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    221 wtotuccion 428 22 Capitulo Los principios basicos de la espectroscopia Michael H. Penner 224 INTRODUCCION La espectruseospia se ocupa de fa produccion ere _gisto Ta integpetacion de os expects que se dervan Gelainteracclon de a radiacin electromagnética con tu materia, Hay disponibles muchos métodos espectos hpieas diferentes para resolver un amplio surtido de jroblemas analiticos. Los meétodos difieen dependien- de la naturaleza de ls especies a ser analizadas (al ‘amo en las espectrscopias molecular y at6miea), el tipo de interaccin a observarenite In radiaciin y la tnateria (tl como laabsoreida, Inemisign a difeacita) $y la resin del especto electeomagnetico utilizada en el Anilisis. Los meétodos espectroscdpicos son muy infor: hutivos y ampliament uilizados para los andliss, fo los cuanttativos como los cualitatives. Los métodos tspectrosespicos basados nla absorcién © le emision Ge radiacion en los rangos de frecuencias del ultravio- eta (UV), del visible (Vis), del intrarrojo (IR) y de ls tna de radio (NMR, resonancia magnética nuclear), sn enconirados habitvalmente en ls laboratoris ta ficioales de anliss de los alimentos. Cada uno de es tis métodos es diferente, en cuanto que observa tipos fiferentes de transiciones moleculaes o atémicas. En las secciones siguientes se explie el fundamento de es- m2 LALUZ 222.1 Algunas propiedades Se puede considear la luz como si estuviese com- _pussa por paticulas de ener, las cuales se mueven & ftavés del espacio mostranéo propiedades parecidas a fis de ls ondas. Esta imagen de la luz sugiere que la ergiaasociada con un rayo de luz no est distibuida do vna manera continua a través del espacio (junto con fos campos eléctricas y magnéticas asociados con la nda) sino que, mis bien, sté coneentrada en «paque- les diseretos. Por consiguiente, se dice que la luz pre~ Senla una naturaleza dual: corpuscular y ondulatora, Tos fenémenos asociados ean la propagasién de la luz, lls como la intrferencia, la dftaccién ylareftaccién, fe explcan muy fclmente haciendo uso de la teria (ndulaoria de la radiacién electromagnética. Sin em- argo, I interacién de la uz con la materia, que es la base de las espectroscopias de absorcin y de emisién, 8 puede comprender como mejor en términos dela na- Twaleza corpuscular dela luz. La luz no es un caso tini- ‘coe cuanto a poser propiedades tanto de tipo ondula- terio como de tipo corpuscular Por ejemplo, es bien sa bio que las particulas fundamentales dela materia, a= les como los eleetrone, los protones y los neutrones, :tstran un eomportamiento de tipo ondulstorio, Las propiedades ondulatrias de la radiaciin clec- tmomagnética se deseriben en términos de la freeuen- cia, la longitud de onda y la amplitudpropias del onda Er a Figura 22-1 se muestca una representacion grl- cade una onda electromagnetics polrizada plana. La ‘onda esti polarizada en un plano, enel sentido de que los campos oscilantes eléctico y magnético que com- pponen Ia onda se encuentran cada uno confinado a un Siico plano. La freeueneta (v) de una onda se define camo ol nimero de oscilaciones que, en un punto dado, ‘experimentac la onda en el transcuso de un segundo Eto es la inversa det period (p) de una onda, que es el tiempo en segundos requerido para que dos maxi- mos sucesivos pasen por un mismo punto dado. La lon- aitud de onda (3) representa Ia distancia entre dos ‘maximas sueesivos, para cualquier onda dada. Las uni- dates empleadas a ls hora de informar de las longits- dds de onda dependerin de Ie rogién de la radiacién clectromagnética utilizada en el andlisis, Algunas ve- «8, los datos espectroscdpicos se comunieanhacien- ddoreferencia al wimero de ondas (0), que es la inver- de la longitud de onda, expresado en unidades de cm! Los nimeros de ondas se utilizan muy a menudo ena espectroscopia IR. La velocidad de propagacién (j) de una onda elettomagnétes, en unidades de dis- fascia recorrda por segundo, en cualquier medio dado i, puede ser ealculada multiplicando la frecuencia de la onda, en ciclos por segundo, por su longitu de onda, enese medio en particular. yah a creo tte) pms igre 22-1 Ur eresetcin de ne racing "cr ponizad na gue propaga org del 3 Lax cn lcoricoy mantic se encgntane se, sn erpendial ‘eecluno laa tambien, «I zen de propaic, 05 426 Ants deo lint donde: », = velocidad de propagacion en ef medio «i» 19 = frecuencia dela onda 1, = longitud de onda ene! medio wiv La frecuencia de una onda elestromagnética viene determinada por la fuente de la radiacin y permanece cconstante cuando Is onda staviesa medios diferentes, Sin embargo, la velocidad de propagacién de wna onde variaré ligeramente,dependiendo del medio através del cual se propague la luz La longitud de onde dela rai cin varias en proporcin a los cambios en la velocidad 4e Ia onda, tal com establece la Eouacin {1}. La am- pita de ta onda (4) representa i magnitud del vetor eléctrico en los miximos de la onda. La poteneia dante (P) y Ta intensidad radiante (J) de un haz de radiacion son proporcionafes al cuadrado de a amplitad de las ondas asociadas que componen dich radicién La Figura 22-1 indica que las ondas eletromagneticas stn compuests por eampos edetrcos y magnéticos ‘oseilantes, que son ambos dos mutuamente peependien Tare, en fase el uno con el otro, y también perpendicula- sala dreccibn de propagacin de la onda, Como mues- tract dijo, las ondasrepresentan las variaciones en las respectivasintensidades de los campos con el tiempo, en una posicién dad, o bien las varlaciones en ls res pectvas intensdades de Tos campos, alo largo de la di- reecin de propagacin, en un instante de tempo dado Las componenteseléetrica y magnética de las ondas se representan como una serie de vectores euyos médulos son proporcionales a la magnitud del eampo respectiv. El.eampoeléetriceosclante ese de mayor importancia para los fendmenos espectroscépicos tales como la ab- soren, la transmisiny la retacein. Sin embargo, la existncia de un campo escilante purameate elésrico, sin su campo magnético asocado, seria algo imposible. 22.2.2 La terminologia Con frecuencia, la propagacién de las ondaselecteo- magnéticas se describe en términos de frentes de onda 0 de tenes de ondas(véase In Figura 22-2). Un frente de fonda representa el Jocuso Inga de un conjunto de pun- tos, todos los cuales se encuentran en fas, Para una fuen- te puniual de luz, un anillo concéntrico que travese Ios -maximos de rayos de hz adyacentes representa un fen- te de ondas. Noes necesiio en todos ls casos dibujar cl anllo completo; de esta manera, los frentes de onda pueden ser representado por planos de luz en aquellos ‘egos en los cuales el observador se encuenre sufieien- ‘emente alejado dela fuente puntual, de tal modo que Ia Fronas de onde Figura 22-2 Freres eons, ene de ods y yo, ‘dod Hugh D Young Univeral Psi, ed, pig. M7 ‘do os derecos por Adin Wes, Rening MA, 1982 sin dete, superficie curva parezea plana. Normalmente os fen tes de onda se trazan uniendo, para rayos adyacentes, longitud de onds, Un tren de ondas se reiere a una re de frente de ondas que estin todos ellos en fs decir, cada onda individual ‘ma en la misma posicin del espacio. Un tren de onda se puede representar también por una serie de ayos luz, Generalmente, se hace uso de los ayos de Iz referencia @ la naturaleza corpuscular de Ii, rept sentando la teayectria de los fotones. Un tren deo Indiearia que una serie de fotones, todos ellos en siguieron la misma tayectoria 22.2.3. La interferencia BL térming interferencia es e uilizad para bir la observacin experimental de que cuando des ‘nenes de onda se enttenzan dan come resulted, en junto de nterscesién, una onda instantinea cuya mpl tad es la suma algebrica de las amplitudes de las individuales en dicho punto de interscecion. La ley describe este comportamiento de las ondas se cond como el principio de superpos punt, en cualquier instante dado. En especroseopin i mpiitud que, en general, despent el mayor inert Ia correspondiente a la magnitude I intensidad campo eléctricoresltans. La méxlana inerferen anstruetva de ds ondas ene lugar cuando as on se hallan completamente en fase (es deci, os @ fo SS af Sen i. at osama mort 0 So ara mo ra 22 Laine cnt onde que Sener ant) nfs, (0) desnassen 0, y) esfsdsen 180 de una onda se superponen con los miximos de la otra acs) ientas que le maxima interferencia destructiva ene lugar cuando las ondasestin desfasadas en 180° tos miximos de una onda se contraponen con los min nos de la otra onda). Este concepto de interfeencia es fundamental para la interprtacion de Tos datos de la fiaccin, a cual representa un segmento especializa- fo dela espectoscopia cualitativa, Los fenémenos de Interferencia se tilizan también ampliamente en el di- seflo de Ios instrumentos espectroscdpicos que reauie- fen la dispersion para la seleccién de Ta radiacién, tales amo aquelos instramentos que hacen uso de monoero- tnndores dered de difracion o de flrs de intereren- tia, tly com se deseribe en el Capitulo 23. ‘Como mejor se enienden los fenémenos de interte- renci es patindo de I nturleza ondultoria de a luz, Sin embargo, los fendmenos tales emo la absorein ola teisin dela radiacin se compeenden mejor consieran- ho Ta naturaleza corpuscular de fa luz. Las pariclas de energie que se mueven através del espacio con propieda- des ondulatorias se denominan fotones. La energia de un feta puede ser definida en téeminos de la frecuencia de Tnonda con la cual est asociada (Eeuacion (2), Bot p) donde B= encrgia de un fotin ‘k= constants de Planck y= fivuencia de Ia ond ociada Esta relacign indica que los fotones que componen tina nz monoerométien, que e Ia radiacion electromag as pips bison dea epecrscopla 427 nitica compuesta por ondas que poseen una misma fee txencia(yTongitud de onda), son todos de energia equi ‘ilente, Lo que es més, liga! que la Recuencia de una ‘onda es una constante dterminada por la fuente der do que la poblacin de molécuasen el estado fundamental resmanece, esencialment, instead. 22.5 RESUMEN La espectroscopi trata de Ia interaceién de la radia- «in eletromagnética con Ia materia, El andlisis espec- trosedpico, una rama de la espectroscopia,abarea un amplio tango de téenicas utlizadas en los laborateios tnaltios para el andlisis cuaitativo cuantative de la fomporicion qutiea de los alimentos. Los métodos eo runes del aliss espectreseépicoincluyen las expec Iroseopas de absorcién UY, Vise IR; la espectroscopia te fuorescencia molecular; y la espectoscopia de NMR. “neada uno de estos metodo, el anaista ata de mer 1a cantidad de radiacidn, bien Sea absorbida o bien emi- vids por el anaito. Todos estos métodos haven uso del hecho de que el contenido de energia de la materia esti ‘atantizade y de que Tot fotones de raiacion pueden ser sbsorbidos o emitidos por la materia sila energia aso tinda al fotén es ipual a la diferencia de energias para fas transiciones peritidas de dicha especie dada. Los nétodos tratados anteriormente diferen unos de otros on respecto a las longitudes de onda de las radisciones slizadas en el anilisis 0 a naturaleza molecular fete ‘la atémia del ana 22,6 PREGUNTAS DE REPASO |, Cae eens asin con uz som expends mai ‘Scimene conden I murters endo de a hz? Explqa ios feimenas,bastndos en su omens de leinerfrenein 2. Geules enbmenos asain con la az son mis ficient ‘lado consterando ln maturlera corpuscular az? Expligue dior fendmenos, tasndone n su compresin de lnmusez edna de a afacio letomagnia, a4 3. 2Qu siifea decir url canted de neg et ntia 4 Ta absorion moeclr dela alain en el rangp UV-vis ‘iene camo resultado ana rani ere a tp denies deenergi? 5. Le sborciin moles de a raicin on ol ango IR ete coo reso ua rns ene gud ipo de rvles ere? 6. {Por ule necesato un campo magnon aplcns pars & *spectosepia de NMR? 1. [Bn le deel lo niveles de ener permits pas tas moles, de agullos para ls somes? Responds con ferns al agama de vl de erga peste Figua 225, 8. Ena especroscopin de Muorescenea por qu es ms ren latent decade eich ita uel longi ce ‘ntl pra a exacin de ral? 22.7 REFERENCIAS 1. Bal. W. 2001, The Bai of Spectroscopy, Sacity cf Photo-opticalInstumentaton Engines, Benga, W2, 2 Christian, G.D.y O'Relly J.-E). 1986. ata. fal Anais, pi 64. Allyn Bason, Newton, MA bs. at 6.200, nai iret Pe fe Character and Ont ps 6731 Soa ‘Son a Nave Yr Haral L6 1988 nari! Chemie Techs rent al slowed Cie Haris 199: Ounce Chena 20 i Fcemm & Cos Nea fg B.C'y Beto MD. 88 ‘Spector, Oxf Unveiy Pes, Note eka Hawou Pity Chidge TB. BI te Orsini Spon Ovo Univ rx ‘avo inl. ey Cae. R 1988 Specroc “nas Pee Hal ogewond Cie aon foy Edel Maral oh SPECTRO 204200 Specanromtrs 1989 Mion oy Rechenee NY Ramste, RW. 1981. Chemical Egslibriom a Lata Asin Vk, Resting, MA SC Wy Zana BL, Ciera Py Sel Addo Wee Resting, Mi Skog, D- Ay Leary 11.1992, Proce of inet Anan 6 Harourt re ovo Oran Fe Tico ey Sate, K.y Wan, 3. ©1995, Phe Ghent Principe and toptction i Blo Sion Pence Hal Ensen Cit, Nh 23 Capitulo La espectroscopia ultravioleta, la visible y la de fluorescencia Michael H. Penner naa2 te pact de a eyo Boer 430 achat etflc alate Sein reese ee | gs.1_INTRODUCCION La espectroseopia en la regién ultavioleta-vsible UV-Vis) es una do las tenicas de lnboratorio mas co jninmente encontradas en el andlisis de los alimentos. nel presente texto son presentados dversos ejemplos, fales como Ia cuantificacion de los macrocomponentes {el contenido total de hidratos de earbono, por medio del método del fenol-dcido sulfirico), la cuantifiacién fe los microcomponentes (la tamina, mediante el peo- fedimiento fluorimétrico del tlocrom), las estimaio- es de la rancidez (el estado de la oxidacion de los ipidos, por medio del ensayo del éido tiobarbitirico) y las pruebas de supervision (lo ensayos inmunosorbentes ligados a fos enzimas). En eada uno de estos casos, Ia fehl analitca en la cual se fundamenta el ensayo es, 0 bien la emisién o bin la absorcion de radiacién en la regia UV-Vis, Esta sefal puede ser inerente al analito, {alcomo la absorcién de raiacion en la zon del visible por pare de los pigmentos, 0 bien ser ef resltado de tia reacein quimica que afects al analit, tal como en # método colorimeéitico de Lowry, basado en el cobre, para el anilisis del contenido de proteinas slubles, La radiaidn cletromagnetia en Ia porién UV-Vis {et expect se extiende en Tongitudes de onda desde, aproximadamente, 200 hast 700 nm. La regidn UV va de 200 a 350 nm y la rogién Vis, desde 350 hasta 700 tm (véase la Tabla 23-1). La repién UV es incolora al jo humano, mientras que ls diferentes longitudes de ‘nda on la regin visible presentan cada una de elas un ent tronsa om) Cabor ate campomentro! 2040 Volar Dri. oar Naren fro ales op See) Nemo as >a Intro eae "inate coramuvo saan or oben pe color caraterstco, abarcando desde el violet, en el cextremo de las longitudes de onda eortas del especteo, hasta el rojo, en el extremo de las longitudes de onda largas del espectro. La espectroscopia que hace uso de Ia radiacin en la region UV-Vis puode ser dividida en dos eategoras genorles, las espeetroseopas de absor- idm y de fluorescencia, basindose en el tipo de inte= cei entre la radiaciny In materia que estésiendo jobservado, Cada uno de estos dos tipos de espectroseo- pia puede subdividiese, «su vee, en tGsnicas cualitat vas y euanttativas, En general de ete las subdivisio- nes de la espectroscopia UV-Vis, la mis cominmente uilizada es la espetroscopia cuanttativa de absorcon, 23.2 LA ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION ULTRAVIOLETA Y VISIBLE, 23.2.1. Los fundamentos de la espectroscopia cuantitativa de absorcién EI objetivo dela espectroscopia cuanitativa de ab- sorcin es determina a concentracin de analito en una disoucion dada de la muestra, La determincign se basa en Ta medicin de la catia absorb de a lz de un hae de referencia, cuando éteatravess na disoluciin, de la muestra, En algunos casos, e analito puede absor- ber radiscién en la regidn UV-Vis de forma natural, de tal manera que en et transcurso del andlisis no hace falta rmodifiar la natralezaquimica del analito. En otros ea- $06, los analizos que no absorben radiacign en la rein LUVEVis son moditicados quimicamente en el ranseurso el anliss,transformandolos en una especie que ab sorba radiacién de una longitud de onda apropiads. En cualquiera de los dos caso, la presencia del aalito en Ta disolucién afectaré a la eantdad de radiacién tans- rida através de la disolucion y, por consiguiente, 18 transmitancia o la absorbancia relativas de la disolucion pueden se uilzadss como wn indicador de Ie cancen- teacion dl analito, En la préctica real, la disolucign que va a ser anai- zal se encuentra contenida en una eéula de absorién, ls cual se dispone en la trayectoria de una radiacion de Tongitud de onda o longitudes de onda seleccionadas. A continuacion, se mide fa cantidad de radiacion que ata Visa la muestra, en comparacién con una muestra de referencia. La cantdad relativa de luz que atraviest la nuestra se utiliza, seguidamente, para estinar la con- ‘centracin del anaito, El proceso de absorcion puede a7 438 Anat deo atime ser representado como en la Figura 23-1. La radiseior incident sobre Ia célula de absorei6n, Po, poser une potcriiaradiane sensiblemente mayor que la eadiniér ‘Que emerge def pared opuesta del elu, P. La dsm ‘ein en la potenciaradiante eanforme el rayo attavie: sla disolucin es debida a la eaptura (0 absorcién) de Tos fotones por parte de Ia especie absorbent. La rela cin ene la potencia de los haces incident y emergen- te se expresa,normalmente en términos bien sea de le dela absorbanca de Ia disolucion (Pde una dsolucion se define come Ia proporcién entre P y Py tal como viene dado en le Eeuacién [1], La transmitancia también puede ser ex presida en forma de porcentaje, como se muestra en Ic euacién [2] T= PIPy io w= (PiPQ) * 100 fed donde: poteneiaradiane del haz que incide sobre Ta edula de absorcion ‘P= potencia radian del baz que emerge ela célule de absorein porceniaje de transmitencia, "i Los teminos Ty %7 son intitivamenteatractves, puesto que expresan la fraceién dela uz incidente ab Sorbida por la dsolucién. Sin embrago, Ty %T no son directamente proporcionales a Ia concenteacién do analitoabsorbente en fa dsolucion de la muestra. Puss- toque los anaists estin interesados, generalmente, en las concentraciones de los analites, la relacién no linea entre la transmitaneia y la concentracin supone un in conveniente, Un segundo témino uilizado para deser = ‘Pear 2-1 sence on zd lice conto ate ‘es nn cela qu cote ws dsl sot bir ts relacion entre P y Py 6s la absorbancta (4), Ly bsorbancia se deine con respecto a la transmitancia 7 tal como se muestra en la Beuncin (3. A= log (PyP)=—logT=2-log%T (3 donde: 4. ~ sbsorbancia 1, %6F representa lo mismo que en las Beuacions Uy BI respectivament, La absorbancia os una expresion conveniente en el sentido de que, bajo unas condiciones apropinds, es di reetamente proporcional a la eoncentracion de Ia espe ce abrorbente presente en Ia dsolucién. Observe qus, brasindose en estas definiciones para y 7, la absorbane cia de una disolueion no es, sencllamente la unidad ‘menos la transmitancia. En la espectroscopia cuantitati: ‘va Ia facsion del haz ineidente que noes transmitida ng igual ala absorbancia (4) de Ia disolucion, La teacidn entre la absorbancia de una disolucign y la conceniracin de la especie absorbente se conoce coma Ia ey de Beer (Eeuacién{4). A= abe 14 donde: ; = absorbancia f¢ = concentric de la especie absorbente ' = camino dptico através dea dsolucin (en em) ‘a > absortvided. [No hay unidades asociadas oon la absorbancia, 4, puesto que excl logaiima del cociente entre ls poten: tia de ls haces. I término dela concentrecéa,c,pue= dd scr expresido en cuslesquiera unidades apropiads (MM, mg/m, 6). El camino pti, by se da en uni= sorbancia cuando Py >> P, lo cul ocumiri a concert cones del analitocelativamente alas A= log(Po+ PIMP + PO a donde: P, = potenciaradiante de la uz dispersada 4 wepresenta lo mismo queen la Beuacin [3] 'P, Pa representan lo mismo que en la Ecuacio (1) 23.2.3 Algunas consideraciones ‘sobre el procedimiento En general, ol objetivo de las medidas cuantitat vas s doterminar Ia concentracién de un analito, con una precision y una exacttud dptimas, en un lapso de tiempo ‘minima y con el minim cose. Para conseguir est, es ‘senile el anaista tenga en cusnta os posibes ero + asocados con eada una dels etapas que consttuyen 1a metodologia de un ensayo en particular Las fuetes potenciales de error para los ensayos especttosp cos Incluyen las téenieas de preparacion de la muestra in- adeeuidas, 10s controle inapropiados, el ruido insu- ‘mental y fos erores asceiados con unas condicienes inapropiadas para las medidas de la absorbancia (ales ‘como ls leturas extrema de a absorbanciao delaras ritanca), [Los esquomas de preparacién de la muestra para las medidas dela absorbancia varian considerablemen- te. Enel caso mis simple, la disolucin que contiene el analito puede ser medida diectamente, desputs d2 la hhomogeneizacin y la larificacion, Salvo easos espe- ‘Una fuente mais de desvacion respecto dela ley de cial, es necesatia una homogencizacién con anterior, dada cualquier andlsis, pare garanizar una muestra re. presenttiva La clarificaién de las muestra es esenca lntes de tomar lectures de Ia absorbancia, con el fin de cevitar In absoreign aparente debi ala dispersion def Iuz producida por ls disolucionestrbias. Enel missin. pile de los casos, Ia disolueién de referencia para lg muestra seri el propio dsolvente de la muestra, sienda cl disolvente, en muchos de Tos esos, o bien el agua g bin una dsoluciOn amortiguadora acuosa. En sitscio. nes mds complejas, el analito a cuantificar puede neces lar ser mogiicado quimicamente antes de levar a caba las medidas dela absorbancia En esto eas, un analito ‘que no absorbe radiacion en una zona especal propia: dds es modifieado especiieamente, dando como result: ‘doumna especie con unas caracteristicas de absorcién com: patibles con une medida espectrofotométrica dada. Ey muchos ensayos colorimétrios que se basan en Ta ab: sorei de radiacion en la regi del Vis, se uilizan re scciones espeeificas tales como éstas. La disolucién de referencia para estos ensayos se prepara tratando el di solvene dela muestra de una manera idéntcaa a de a muestra. Por consiguente, la disolucién de referencia ayudar @ compensar, teniendo en cuenta cualquier abs orci debida'@ los peopios reactivos modificadores y no al analito mocitieado. Se deberaelegr una lula para contener la mu tras o eubeta, después de que haya sido determinads a regiénespectal general a ulizaren la medida espcto Fotométrcs. Las eluls paras muestras varian encuane toa su composicion y sus dimensiones. a eéula paral rmucatra deberia estar compuesta por un material que ro absorba radian en la regiénespectral que est sien ‘Go utilizada Las células que cumpen este requisio para las medidas en la regién UV pueden estar compussts de enarz0 o por silce fundida. Para la region fapropiadas las edulas heches de video sileatoy tam= bicn hay disponibles eélulas baratas de plistico para algunas aplicaciones, Las dimensiones de la eélula se rin importantes con respecto a la cantidad de disolu: cidn requerida para una medida y en rolacin al tems tno del camino dptico que aparece en Ia ley de Beet ‘Una eélula de absoreintipica mide | em po, aproxi= ‘madamente, 4,5 em dealt, El camino dptico para esta célula tradicional es de I em y el volumen minimo de disolcién necesario para la medida tipiea de absoreisn fede, aproximadamente, 1,5 mL. Hay disponibles co imercialmente céllas de absoreién eon eaminos Spi: ‘eos que abarcan desde 1 hasta 100 mm. También bay slisponibles eélulasestrechas, de aproximadamente 4 mm de ancho, con caminos dpticos de 1 em. Estas ulus estrechas son ities para las medidas de absor- bancia cuando hay disponibles cantidades limitadas de Aisolucién, de menos de I ml. En muchos casos, el analista necesita elegir una Iongitud de onda apropiada sla cual llevar a cabo ls medidas de i absorbanca. Si posible, lo mejr es elegir = Inlongitud de onda ala cua el analito muesire la mixi= ima absorbancia y donde la absorbancia no varie rida ‘mente con los cambios en la longitud de onda (véase Ia Figura 23-3). Habitualmente, esta posicién eorresponde 41a cima dl pico de absorcién mis alto, levar a cabo las medidas en esta cumbre presenta dos ventas: (1) sin Sensibilidad maxima, definide como la vaviacién en Ia absorbanecia por eada unidad de cambio en la concen traci del analito; y @2) una mayor observancia de Is ley de Beer, puesto que a region espectral que compone tl haz de le radiacion est formada por longitudes de ‘anda con diferencias relativamente pequefias en sus bsortividades molars para el analito que est siendo ‘medio (vase la Figura 23.3), Este tltimo punto es im- portante, en cuanto que el haz de la radincon wtlizada en el anilisis esta compuesto por una pequefia banda continua de longitudes de onda centradas alrededor de ln ongitud de onda seflada en el selector de longitudes be onda de instrument, La verdadera medida de In absorbancia se leva a ‘abo calibrando, en primer lugar, el 0% y el 100% de transmitancia del instrumento. El ajuste del 0% de vom 7 il 3 1 z : 3 : ; i re a) Longitude onda om) Figura 23-3. Uncspesto be abs hpttic, exe 340y 100 fama anchra de tnd eta de arachnids pr Is ‘ect del spect se supe gute de, prximadaent, 20 fn. Observe qe en lp ined no hy cine ing vara on nabs molar olrgo de ee rng longitudes de ond, a specresopi leave, lave yl de florescencia 441 teansmitancia se realiza mientea el fotodetector se en: ‘venta apantallado de la radiacionincidente por medio de un oblurador ocluyente, remedando una absoreién infnita. Este ajusteestablece Ia conrente de nivel bisi- 0 0«corrente oscuray al nivel apropiado, de tal maner que el dispositive de leturaindique cero, A continua ci, el sjuste del 100% de transitanca se lleva a cabo ‘con el obturador ocluyente abiertoy una lula de refe- rencia y una disolucin apopiadas en I rayectria de la luz. La propia eélula de referencia debe er equivaten- tea lacélula que contiene la muestra (es decir e emplea uu conjunto de dos eélulas«emparjadas»). En muchos casos, se utiliza la misma celula para ambes disolucio- nes: la de la mueseay lade referencia. Generalmente a célula de referencia se lena con un dsolvente,siendo Se, con frecuencia, agua destilede 0 desionizada para los sistemas acuosos. El ajuste del 100% de T esablece efectivamente 7 | pata la ela de referencia, lo cl es equivalent adefinir P en la Eeuaeign [1] como equi- valent ala potencia ragante del haz que emerge de la eblula de referencia Los ajustes del 0% de Ty del 100% {de T deberian ser confimados, segin sea necessro, a 10, largo del ensayo. A continuacidn, se mide Ia ella de la ‘muestra, la cual contene el anaito, sin eambiar los juss ‘es, Los ajustes levados a cabo con la cella de referen- ia establecerin efectivamente el instramento pura dar ‘un lecture de Ta muesra en los téminos de la Eeuacion (6). La lectura para Ia dsolucién de la muestra estar entre el Oy el 100% de . La mayor de lo espectrofo- témetros moderns permiten al analista relia® la leet- ‘de las medidas bien sea on unidades de absorbanci, bien sea como el porcentaje de transmitancia. General mente es més conveniente realizar las letras en unida- 4es de absorbancia puesto que, by unas condiciones ‘optimas, la absorbancia es diectamente proporconal a Ja concentacién. Cuando se llevan a cabo las medidas con un intrumento que hace uso de una agujaosclante snalégica para presentar la lectura, puede ser peterible utilizar la escala lineal del poreentaje de tansmitancia y caleular, seguidamente, Ia absorbancia haciendo uso de la Bewncin [3]. Esto es particularmente cierto para las ‘medidas en las cuales el porcentaje de transmitanca sea inferior sl 20%. 23.2.4 Las curvas de callbrado En la mayoria de fos casos, es aeonsejable hacer uso de curvas de calibrado para las medidas evanttatvas En el andlisis de los alimentos, hay un gran nimero de ‘ensayos empiric para los cuales las curva de calibra do son esenciales. La eurva de ealibrad se utiliza pa 442 Anis do or inertce establece I relacidn entre la concentracion del analito Y la absorbancia, Est relacion es establecid experimer {almente «través del andisis de una serie de muestra de ‘concetacion del aalito conocida. Lo mejores preps- rar las disolcions pateones con los mismos reactives y a mismo tiempo que la muestra inebgnits. El rango de concentracionesabarcado por las disolucione patrones debe incluiraquella esperada para la incdgnita. En a Figura 23-4 se muestran dos curvas de calibradotpicas Para aquellos sistemas que cumplen la ley de Beer sn cesperadas curvas de ealibrado lineales. Aungue paia Slgunos ensayos se uilizan ls ewrvas de ealibrado mo Tineales, generalment se preferen las relaciones lnes~ les debido a la comodidad a Ia hora de procesar los di- tos, Las curvas de ealibrado no lineales pueden ser cat- sadas por cambios dapendientes de la concentracin et 1 comportamiento qulmico del sistema o por linitacie: res inherentes a i instrumentacion utiliza para el et- sayo. La curva de clibrado no lineal dela Figura 23-0 reflea el hecho de que la sensibilidad del ealibrad>,

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