LOS NIOSOMAS QUE CONSISTEN EN TWEEN - 60 Y COLESTEROL MEJORAN LA ESTABILIDAD

QUMICA Y LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DEL GALATO DE (-) - EPIGALOCATEQUINA BAJO

CONDICIONES DEL TRACTO INTESTINAL.

RESUMEN

Con el fin de mejorar la estabilidad qumica y la actividad antioxidante del galato de (-) -
epigalocatequina (EGCG) en el tracto gastrointestinal, se desarrollaron niosomas compuestos de
Tween - 60 y colesterol para encapsular EGCG en esta investigacin. Los niosomas cargados con
EGCG con un rendimiento de encapsulacin de alrededor del 76% presentaban un pequeo
dimetro medio Z de aproximadamente 60 nm. En comparacin con el EGCG libre, el EGCG que
permaneca en los tubos de dilisis mejor significativamente para los niosomas a pH 2 y 7,4.
Mientras tanto, el EGCG residual para niosomas aument de 3% a 49% despus de 2 h de incubacin
en fluido intestinal simulado (SIF). Se encontr que la pancreatina afecta la estabilidad de los
niosomas en SIF principalmente. Adems, los resultados de las pruebas de potencia antioxidante
frrica reductora y de la actividad antioxidante celular indicaron que los niosomas cargados con
EGCG exhiban una mayor capacidad antioxidante que el EGCG libre durante la digestin intestinal.
Por lo tanto, podemos inferir que la encapsulacin niosomal podra ser un enfoque prometedor para
mejorar la biodisponibilidad oral de EGCG en el cuerpo.

1. INTRODUCCIN

(-) - El galato de epigalocatequina (EGCG), un flavonoide soluble en agua que es el componente ms

destacado del t verde, ha sido reportado como poseedor de propiedades anticancergenas,
antiaterognicas, antiinflamatorias y cardiovasculares. La ingesta de EGCG se considera segura ya
que el t verde es un alimento que se ha consumido durante siglos. Los beneficios para la salud del
EGCG se han asociado con sus propiedades antioxidantes y la capacidad de interactuar con vas de
sealizacin relacionadas con el metabolismo energtico, la inflamacin y el cncer. Por ejemplo,
se encontr que EGCG reduce el dao oxidativo del ADN mediado por radicales libres a travs de su
capacidad de eliminacin de radicales. Las propiedades preventivas del cncer del EGCG estn
respaldadas por mltiples estudios in vitro, in vivo, epidemiolgicos y clnicos. Debido a su seguridad
y propiedades bioactivas tiles, los investigadores acadmicos e industriales lo consideran un
prometedor phytomedicine para prevenir el cncer, la inflamacin, los trastornos cardiovasculares
y neurodegenerativos.

Sin embargo, EGCG es inestable en el tracto digestivo y mal absorbido a travs de las clulas
epiteliales intestinales. Superar estos obstculos a la biodisponibilidad ha sido un desafo sustancial.
En el tracto intestinal, el EGCG se degrada por el pH alcalino y el oxgeno disuelto. La absorcin de
EGCG en el intestino podra estar relacionada con la regla de cinco de Lipinski, que establece que
los compuestos con un peso molecular superior a 500 g / mol y 5 o ms donantes de enlaces de
hidrgeno no pasan fcilmente a travs de la membrana plasmtica. La investigacin apoya la regla
de Lipinski y ha demostrado que la alta hidrofilia del EGCG perjudica su capacidad de cruzar la
membrana celular, y altos niveles se encuentran en las heces de los animales alimentados con
polifenoles de t verde. Se ha informado que se requiere una dosis bastante alta de EGCG para
mantener la concentracin plasmtica de EGCG a un nivel suficiente para ejercer actividades
antioxidantes. Sin embargo, la escalada de dosis aumenta el riesgo de toxicidad y tambin puede
causar sabores desagradables. Con el objetivo de desarrollar un sistema de administracin oral
eficaz que reduce la degradacin y aumenta la absorcin de EGCG, los sistemas de suministro de
nanopartculas se consideran un enfoque factible.

Las estrategias de nanopartculas para mejorar la farmacocintica y la farmacodinmica del EGCG

incluyen nanopartculas basadas en polisacridos, nanocpsulas lipdicas, nanovehculos basados en
protenas y liposomas. La capacidad mejorada de antiproliferacin contra clulas cancerosas in vitro
de portadores de EGCG fue informada por Rocha et al. Y Ru et al. La encapsulacin o incrustacin
de la matriz tambin reduce el amargor indeseable y la astringencia del EGCG como se muestra por
las nanopartculas de -lactoglobulina. Sin embargo, la proteccin del EGCG frente al entorno del
pH alcalino y la degradacin enzimtica en el tracto gastrointestinal todava no estaban
suficientemente proporcionados por estos sistemas. El EGCG incrustado en la goma arbiga y
maltodextrina, mientras estable en medio acuoso, se liber totalmente en 3 h en el tracto intestinal.
Las nanopartculas de beta-lactoglobulina son resistentes a la digestin gstrica pero susceptible a
la digestin por enzimas intestinales. Un resultado similar tambin se obtuvo a partir de liposomas.
El quitosano es otro biopolmero ampliamente utilizado para la encapsulacin, pero es soluble slo
en ambientes cidos, lo que dara lugar a disolucin en el estmago y disminucin de la
disponibilidad de EGCG en el tracto intestinal. Por lo tanto, se necesita un nuevo enfoque para la
administracin oral de EGCG con estabilidad dentro del tracto gastrointestinal.

Los niosomas son un sistema vesicular estructuralmente anlogo a los liposomas compuestos de
tensioactivos no inicos y colesterol con sus extremos hidrfilos expuestos en las superficies interna
y externa de la vescula, mientras que las cadenas hidrofbicas se enfrentan entre s dentro de la
bicapa. Por lo tanto, las molculas hidrfilas pueden encerrarse dentro del espacio acuoso interno,
mientras que las molculas hidrfobas pueden estar incrustadas dentro de la membrana bicapa.
Con la propiedad de potenciador de la penetracin de un tensioactivo no inico, los sistemas
niosomales presentan una mejora marcada para la biodisponibilidad de una variedad de frmacos,
tales como paclitaxel, griseofulvina y valsartn facilitando la transferencia de los compuestos a
travs de la membrana epitelial intestinal. EGCG niosoma preparado por Span 60 y colesterol
tambin se verific para mejorar la captacin y el transporte de EGCG por las clulas intestinales.
Segn la investigacin de Wilkhu et al., Los niosomas podran tambin aumentar la estabilidad de
las vacunas orales en el tracto gastrointestinal ya que los tensioactivos no inicos son ms
resistentes a la degradacin enzimtica intestinal; Y recientemente
Se produjeron niosomas modificados con segunda capa por carboximetil celulosa de sodio para
mejorar adicionalmente la resistencia de los niosomas de EGCG a la variacin del pH y al estrs
trmico y osmtico. Sin embargo, la estabilidad de los niosomas de EGCG en el tracto
gastrointestinal es todava desconocida hasta ahora. Por lo tanto, en esta investigacin, un modelo
de digestin in vitro se utiliza para investigar la estabilidad de los niosomas EGCG para revelar la
posibilidad de su aplicacin a la administracin oral.

Tween-60 como un surfactante no inico comn con el permiso para ser utilizado con seguridad en
alimentos y productos farmacuticos por la FDA se eligi para preparar niosoma en este estudio. Se
investigaron las caracterizaciones de tamao de gotita, morfologa, eficiencia de encapsulacin y
estabilidad gastrointestinal in vitro de niosomas cargados con EGCG. La actividad antioxidante de
los niosomas de EGCG durante la digestin intestinal tambin se evalu utilizando el poder
antioxidante reductor frrico (FRAC) y la actividad antioxidante celular (CAA)

2. MATERIALES Y METODOS

Materiales. Se adquirieron EGCG (98%) y 2,4,6-tris (2-piridil) -s-triazina (TPTZ) de Shanghai Canspec
Scientific Instruments Co., Ltd. (Shanghai, China). Se adquirieron Triton X-100, cido fosfrico,
alcohol etlico absoluto, FeCl3, DMSO, Tween-60, colesterol y metanol de grado HPLC de Sinopharm
Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). Agua de grado ultrapuro adquirida de A.S. Watson
Group, Ltd. (Hong Kong, China) para ensayos de HPLC, y se utiliz agua desionizada de un sistema
de purificacin de agua Milli-Q (Millipore Co., Bedford, MA) en otros experimentos. Diacetato de 2
', 7'-diclorofluorescena (DCFH-DA), dihidrocloruro de 2,2'-azobis (2-amidinopropano), pepsina de
mucosa gstrica porcina (P7000, actividad enzimtica de 738 U / mg), extracto biliar porcino (B8631)
y pancreatina del pncreas porcino (P7545, 8 especificaciones de USP) se adquirieron de Sigma-
Aldrich Co. LLC (St. Louis, MO). La lnea celular de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) fue un
regalo del Dr. Xing-Guo Wang (Universidad de Jiangnan, Wuxi, China). El medio de Eagle modificado
por Dulbecco (DMEM) (que contiene 4,5 g / l de D-glucosa y GlutaMAX), aminocidos no esenciales
(100x), penicilina y estreptomicina (100x), suero bovino fetal (FBS), tripsina, (HBSS) y solucin
tampn de fosfato (PBS) (1 x) se adquirieron de GIBCO (Grand Island, NY). Otros reactivos qumicos
utilizados en este estudio fueron de grado analtico.

- 2. Preparacin de Niosomas Cargados con EGCG. Los niosomas se prepararon mediante el

mtodo de inyeccin de etanol desarrollado por Fan et al.31 y Pratap et al.27 con ligeras
modificaciones. Se mezcl una cantidad total de 200 mg de Tween-60 y colesterol a una
relacin molar 4: 1 y se disolvi a 60C en 1 ml de alcohol etlico absoluto que contena una
concentracin predefinida de EGCG (25 mg / ml). La solucin resultante se inyect lenta y
uniformemente en 18,5 ml de agua desionizada mediante una jeringa (2 ml) a 50C en un
vaso de precipitados bajo agitacin suave constante usando un agitador magntico. El
alcohol etlico absoluto se elimin despus por evaporacin a presin reducida trabajando
a 0,1 MPa.
- 2. Caracterizaciones de los Niosomas Cargados con EGCG. El dimetro Z medio y el ndice
de polidispersidad (PDI) de los niosomas se determinaron mediante dispersin dinmica de
luz (DLS) en un Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd., RU), de acuerdo con los mtodos
de nuestro informe anterior. La suspensin de vesculas se aadi a 10 ml de agua
desionizada y la mezcla se transfiri a la cubeta. La forma niosomal inicial y el tamao y los
cambios durante el proceso digestivo se visualizaron mediante microscopa electrnica de
transmisin (TEM, H-7650, HITACHI, Japn) de acuerdo con nuestro mtodo previamente
informado con una ligera modificacin. Gotas que contenan suspensin nociva EGCG
prediluida, y el exceso de lquido se elimin con papel de filtro despus de 4 min. Las
muestras se secaron al aire a temperatura ambiente y la morfologa de los niosomas de
EGCG se registr mediante TEM a una tensin de 80 kV.

- 2. Determinacin de la eficiencia de encapsulacin de EGCG en los niosomas. EGCG

encapsulado se separ de EGCG libre por ultracentrifugacin como se describe por Suwakul
et al.33 con modificaciones menores. Brevemente, se diluy la dispersin niosomal de EGCG
(5 ml) con agua de grado ultrapuro a 25 ml en un tubo de centrfuga, y se centrifug a
200000 g durante 30 min a 4C (L 80, Beckman, EUA). El sobrenadante se recogi como el
EGCG libre. El EGCG total en dispersiones niosomales se liber por interrupcin completa
de las vesculas usando Triton X-100 La cantidad de EGCG encapsulado libre y total se
cuantific mediante cromatografa lquida de alta resolucin de fase inversa (RP-HPLC)
utilizando el sistema Hitachi Chromaster HPLC (Hitachi High- Technologies Corporation,
Japn) basado en el mtodo descrito por Li et al.34 Brevemente , Se usaron filtros de jeringa
estriles (0,22 m) para esterilizar cada muestra antes del anlisis. La separacin
cromatogrfica se realiz en una columna Waters Symmetry C18 (4,6 x 250 mm, 5 \ mu m)
a 25C. La fase mvil era una mezcla de disolvente A (v / v / v, cido fosfrico al 0,05%:
metanol al 80%: agua de grado ultrapuro al 20%) y disolvente B (v / v / v, cido fosfrico al
0,05% 90% de agua de grado ultrapuro). El caudal fue de 1 ml / min. Los gradientes lineales
fueron los siguientes: disolvente A 20% a 80% en 15 min, reducido a 20% en 2 min, y
mantenidos a 20% durante 3 min hasta inyeccin de la siguiente muestra. El volumen de
inyeccin fue de 20 l, y la longitud de onda de deteccin del espectro de DAD se fij a 274
nm. El ensayo de HPLC para EGCG fue lineal en el intervalo de 5-100 \ mu g / mL. La ecuacin
de regresin de la curva de calibracin se calcul sobre la base del rea del pico frente a las
concentraciones estndar. La eficiencia de encapsulacin (EE) se calcul de acuerdo con la
siguiente ecuacin:
Donde C libre y C total son las concentraciones de la concentracin de EGCG libre y total en las
dispersiones niosomales preparadas, respectivamente.

- 2. EGCG que permanece bajo el pH gastrointestinal simulado mediante el mtodo de

dilisis. El EGCG remanente de Niosomas cargados de EGCG bajo un pH gastrointestinal
simulado se investig a travs del mtodo de dilisis desarrollado por Zou et al.35 con
ligeras modificaciones. Se utiliz la solucin de EGCG como control. En resumen, se cargaron
2 ml de suspensin de niosoma EGCG en una bolsa de dilisis de membrana de celulosa
(corte Mw de 3 kDa, Sinopharm Co., China) y se sumergieron en 100 ml de solucin tampn
acetato (0,05 M) a pH 2 o PBS M) a pH 7,4 que representaba el pH para el medio gstrico y
el intestino delgado, con agitacin constante a 25C. Las muestras en las bolsas de dilisis
se recogieron a intervalos de tiempo predeterminados (0,5, 1,5, 2,5, 3,5, 5, 7, 10 y 24 h) y
se analizaron para determinar el contenido de EGCG por HPLC. El EGCG restante se calcul
de acuerdo con la siguiente ecuacin:

Donde Ci es la concentracin de EGCG de muestras en la bolsa de dilisis a intervalos de

tiempo y C0 es la concentracin de EGCG de las muestras en el momento inicial.

- 1. Estabilidad de digestin in vitro de Niosomas de EGCG. La estabilidad de digestin in

vitro de los niosomas de EGCG se evalu en fluido gstrico simulado (SGF) y fluido intestinal
simulado (SIF) por separado segn procedimientos informados por Liu et al.21 con
modificaciones menores. La SGF se prepar colocando 2 g de NaCl, 7 ml de HCl (37% en
peso) y 3,2 mg / ml de pepsina en 1 l de agua y ajustando el pH a 2,0 usando HCl 1,0 M. Se
prepar SIF consistente en sales biliares (7 mg / ml) y pancreatina (1 mg / ml) en PBS (0,05
M, pH 7,4). Se utiliz una solucin de EGCG como control tanto en las digestiones de SGF
como de SIF. Las soluciones de SGF y SIF se precalentaron a 37C antes de incubar las
muestras. En resumen, la solucin de muestra se mezcl con SGF o SIF con una relacin en
volumen de 2: 5. La solucin mixta se incub entonces a 37 C con agitacin suave (100
rpm), y se tomaron submuestras para el anlisis del dimetro medio Z a diferentes intervalos
de tiempo (10, 20, 30, 40, 50 y 60 min para SGF y 10, 30, 60, 90, 120 min para SIF). Para
evaluar el impacto de la condicin alcalina de SIF, sales biliares y pancreatina en SIF en
niosomas de EGCG, la evaluacin morfolgica y el anlisis por HPLC se realizaron en
niosomas de EGCG incubados slo en PBS (pH 7,4) y SIF especfico con sales biliares o
 pancreatina por separado . El EGCG restante se calcul de acuerdo con la siguiente
ecuacin:

Donde Ci es la concentracin de EGCG de las muestras a intervalos de tiempo en SGF o SIF, y C0 es

la concentracin de EGCG en el fluido digestivo en el momento inicial.

- 1.. Actividades antioxidantes de los niosomas de EGCG durante la digestin. Las

propiedades antioxidantes de los niosomas cargados con EGCG en SIF se determinaron
mediante el poder antioxidante reductor frrico (FRAP) y se compararon con la solucin
libre de EGCG. En resumen, el reactivo de FRAP de trabajo se prepar recientemente
mezclando 25 ml de tampn de acetato (0,3 M) a pH 3,6 con 2,5 ml de TPTZ (2,4,6 tri (2
piridil) triazina 10 mM en 40 MM de HCl y 2,5 ml de FeCl _ {3} 6H _ {2} O 20 mM a 37C. A
continuacin, se aadieron 0,2 ml de la muestra de incubacin SIF a 4,8 ml de reactivo FRAP.
La mezcla de reaccin se incub en un bao de agua durante 10 minutos a 37 C. La
absorbancia de cada muestra se registr a 593 nm mediante espectrofotometra UV-vis y se
utiliz la diferencia de absorbancia entre la muestra (niosomas cargados con EGCG y
solucin libre de EGCG en SIF) y blanco (SIF con niosomas vacos y SIF en blanco) para
calcular la Valor FRAP. El valor de FRAP se expres en trminos del contenido equivalente
de EGCG, usando la curva estndar de EGCG.

- 1. Ensayo de actividad antioxidante celular (CAA) de Niosomas de EGCG antes y despus

de la digestin. La capacidad antioxidante celular de los niosomas de EGCG se determin
mediante el ensayo de actividad antioxidante celular (CAA) de acuerdo con el mtodo de
Wolfe y Liu, tomando la solucin de EGCG como un grupo de control. Las clulas HepG2 del
carcinoma hepatocelular humano se mantuvieron de forma rutinaria en medio DMEM
completo en matraces Corning de cultivo celular en una incubadora humidificada con 5%
de CO2 y 95% de humedad relativa. El medio DMEM completo se suplement con 10% de
suero fetal de ternera, 1% de penicilina-estreptomicina-glutamina y 1% de aminocidos no
esenciales. El medio de cultivo se cambi cada 2 das al alcanzar una confluencia del 80-
90%. Las clulas utilizadas en el presente estudio se encontraban entre el paso 15 y 30. Se
hicieron crecer 100 l de clulas HepG2 en una placa de 96 pocillos a una densidad de 6 x
104 clulas / pocillo, con la excepcin de los pocillos exteriores debido a una variacin
mucho mayor de ellos. Despus de 24 h de incubacin, el sobrenadante se retir y los
pocillos se lavaron con PBS. Se trataron seis repeticiones de pocillos con 100 l de niosomas
de EGCG y solucin de EGCG ms DCFH-DA 25 M disueltos en medio de tratamiento.
Despus de la siembra durante 1 h, los pocillos se lavaron entonces con 100 l de PBS, y 600
 M de ABAP en 100 l de HBSS se verti sobre la placa de 96 pocillos. Finalmente, la
microplaca de 96 pocillos se coloc en un lector de microplacas (Spectramax M5, Molecular
Devices, EE.UU.) a 37C. La emisin a 538 nm se midi con excitacin a 485 nm cada 5 min
durante 1 h. Adems, los niosomas de EGCG y la solucin de EGCG despus de la digestin
intestinal simulada se recogieron y se diluyeron a diversas concentraciones para el ensayo
CAA en las mismas condiciones. Cada placa inclua tambin seis replicaciones de pocillos de
control que contenan clulas tratadas con DCFH-DA y ABAP y pocillos en blanco que
contenan clulas tratadas con DCFH-DA sin ABAP para solucin de EGCG; DCFHDA sin ABAP
y niosomas en blanco sin EGCG para niosomas de EGCG; DCFH - DA sin ABAP y solucin
digerida sin EGCG para solucin de EGCG digerida; DCFH-DA sin ABAP y digeridos niosomas
en blanco sin EGCG para digeridos EGCG niosomas, respectivamente. Despus de la
sustraccin en blanco de las lecturas de fluorescencia, el rea bajo la curva de fluorescencia
frente al tiempo se integr para calcular el valor de CAA de acuerdo con Wolfe y Liu como
sigue:

- 1. Anlisis estadstico. Todas las mediciones se realizaron al menos por triplicado. Los
valores se expresan como media desviacin estndar (DE). Las comparaciones entre dos
medias se realizaron utilizando las pruebas t de Student no emparejadas. Cuando haba ms
de dos medias, las diferencias se detectaron mediante un anlisis de varianza unidireccional
(ANOVA) seguido de la prueba de rango mltiple de Duncan utilizando el paquete de
software estadstico SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Las diferencias se consideraron
significativas cuando p <0,05.

RESULTADOS Y DISCUSIN

- 2. Caracterizacin de Niosomas de EGCG. El tamao de partcula, PDI, eficiencia de

encapsulacin y morfologa de los niosomas de EGCG son caractersticas importantes de los
niosomas como vehculos de nanodelivery. Como se muestra en la Figura 1A, el dimetro
medio Z de los niosomas de EGCG preparados por el mtodo de inyeccin de etanol era de
aproximadamente 60 nm con un valor de PDI alrededor de 0,110 usando dispersin de luz
lser dinmica (DLS), indicando que el tamao de la vescula era relativamente homogneo.
En comparacin con otros niosomas de EGCG preparados por el mtodo de hidratacin de
pelcula delgada (~100 nm), 13 el tamao de partcula de los niosomas de EGCG preparados
por inyeccin de etanol fue menor. Exceptuando el mtodo de preparacin, los
componentes incorporados en el niosoma y el tipo de emulsionantes tambin afectaran el
tamao de las gotas.28,38,39 La TEM y la forma vesicular de los niosomas de EGCG fueron
 observadas por TEM. Tal como se presenta en la Figura 1B, la imagen de TEM mostr que
las vesculas eran pequeas y de forma principalmente esfrica. El tamao por TEM (~ 60
nm) se correlaciona bien con los resultados por DLS. La imagen TEM tambin mostr la
distribucin de la fase acuosa (rea oscura) rodeada por una membrana unilamelar de
lpidos (zona de luz). El ncleo acuoso tiene aproximadamente 50 nm de dimetro rodeado
por una membrana de 5 nm de grosor.

- La eficiencia de encapsulacin de los niosomas cargados con EGCG fue de 76,4 \ pm 0,8%,
que es mayor que la de las nanopartculas - Lg - EGCG de 60 - 70% con una capacidad de
carga similar de 12% 20 y similar a la de los liposomas de 70-80% al La misma capacidad de
carga del 12,5% .22 Estos resultados pueden atribuirse a las caractersticas estructurales
especficas del EGCG. El grupo galoyl de EGCG facilita su absorcin por los segmentos
lipfilos de tensioactivos mientras que el grupo hidroflico de EGCG facilita la particin a la
fase de agua interna.
- 1. EGCG que permanece bajo Gastrointestinal Simulado PH a travs del mtodo de dilisis.
- El EGCG que queda de solucin a granel y niosomas a pH 2 y 7,4 a travs de una membrana
de dilisis de 3 kDa se presenta en la Figura 2. Se observa que slo 10% de EGCG permaneci
en la bolsa de dilisis despus de 3,5 h a pH 2 y despus de 1,5 h a PH 7,4 para las soluciones
de EGCG. Una posible razn para la rpida difusin de la solucin de EGCG a pH 7,4 fue que
el EGCG tiende a degradarse en molculas ms pequeas bajo condiciones alcalinas. Con la
disminucin de la concentracin de EGCG en las soluciones, el EGCG se empujara para
difundir desde la bolsa de dilisis. Sin embargo, los niosomas de EGCG exhiban una cantidad
relativamente alta que permaneca en las mismas condiciones. Slo 21,3% y 30,9% de EGCG
se filtr a partir de niosomas a pH 2 y 7,4, respectivamente, despus de 24 h de dilisis. El
EGCG que permanece en un ambiente cido despus de 24 h coincide con el EE% de EGCG
niosomas, lo que indica que libre EGCG en vesculas niosomales se difundi principalmente
a travs de la membrana de dilisis con limitado EGCG fuga de vesculas. El EGCG remanente
restante que se encontr en pH 7,4 tambin puede ser causado por la degradacin

Figura 2. EGCG que permanece dentro de los tubos de dilisis para solucin de EGCG (ES) y
Niosomas cargados de EGCG (EN) bajo pH 2 y 7.4 gastrointestinal simulado

- de EGCG fuera de la bolsa de dilisis. La capacidad de los niosomas para evitar la fuga de
EGCG fue mayor que la de algunos otros sistemas de suministro, por ejemplo, la relacin de
fugas de nanopartculas de EGCG quitosano-polifosfato de calcio (CS-CPP) es de
aproximadamente 25-50% en 24 h a pH 6,2 como se inform Por Hu et al.40 Nanopartculas
de polisacridos reportadas por Rocha et al. Se escap aproximadamente el 65% de EGCG
en los primeros 30 min y el EGCG se liber por completo en 3 h a pH 7,418. Pero comparado
con el nuevo derivado anfiflico de quitosano derivado de sulfato de dextrano
nanoliposomas con un nivel de fuga de 20,2% a pH 5,5 informado por Zou et Al., 41 era un
poco ms dbil. Sin embargo, en comparacin con la solucin de EGCG libre, la cantidad de
EGCG que quedaba de niosoma en las primeras 3 h (2,8% y 6,2% a pH 2 y 7,4) aument
 espectacularmente, lo que indicaba que el niosoma puede ser un sistema eficiente para
controlar la fuga de ECGC dentro del tiempo de digestin de 3 h en el tracto GI; Y la
caracterizacin de este sistema en simulado SGF y digestin SIF se examin an ms.

- 2. Estabilidad de Niosomas Cargados con EGCG y EGCG Libre Durante el trnsito a travs
del sistema digestivo. Los De los niosomas cargados con EGCG durante la digestin in vitro
Se sigui midiendo el dimetro medio Z, la cantidad Del EGCG remanente, y la morfologa
de los niosomas Durante el tracto digestivo. Los niosomas se incubaron en SGF Utilizando
EGCG libre como grupo de control. La Figura 3A es un grfico de El dimetro medio Z y PDI
de los niosomas cargados con EGCG Despus de la incubacin de la SGF en el tiempo. El
dimetro medio Z Se mantuvo constante a aproximadamente 60 nm durante 1 h. Estos
resultados Estaban en buen acuerdo con los hallazgos de Chang et al.42 Que las
emulsiones estabilizadas por Tween 80 eran resistentes a la gotita Agregacin en
condiciones gstricas. La tasa de retencin de ambos Los niosomas cargados con EGCG y
las soluciones EGCG libres (Figura 3B) Se mantuvieron sin cambios durante este perodo de
tiempo. La retencin fue mayor De 99% y 96% para los niosomas de EGCG y EGCG libre
Solucin, respectivamente. Estos resultados muestran que EGCG libre y EGCG niosoma son
ambos estables durante el perodo de 1 h en SGF. Sin embargo, en SIF el dimetro medio
de EGCG cargado Niosomas aument de 60 a 149 nm en 10 minutos y Continu
aumentando a 178 nm en 2 h (como se muestra en la Figura 4A, Columnas con color rojo).
Las tasas de retencin de EGCG cargadas En los niosomas y la solucin fueron alrededor
del 49% y 3% respectivamente Despus de 2 h en SIF (mostrada en la Figura 4B), indicando
una proteccin Capacidad de niosomas para EGCG. Otros han observado la Misma
estabilidad de EGCG en fluidos cidos y degradacin rpida
De 97,9% a 3,4% en 1,5 h en soluciones neutras o alcalinas. En comparacin con los liposomas con
EGCG residual a 22,5% Despus de la incubacin en SIF durante 2 h, 35 la capacidad protectora de
Niosomas es mayor. Con el fin de comprender la razn de la prdida de EGCG Durante la digestin
intestinal simulada, condiciones SIF especficas Con PBS (pH 7,4) solamente o PBS (pH 7,4) que
contiene sales biliares O pancreatina por separado se utilizaron para hacer la digestin de nuevo. Se
ha observado que los niosomas de EGCG incubados en PBS No mostr ningn cambio de tamao de
gotita alrededor de 60 nm (Figura 4A, Columnas con color blanco) y un alto ECGC que permanece
95% (Figura 4C) que indicaba que el niosoma de EGCG era Estable a pH 7,4 durante 2 h. Sin embargo,
el tamao de gotita de El niosoma de EGCG aument a 133 nm cuando se incub en PBS incorporado
con sales biliares y 162 nm con pancreatina (Figura 4A); Y la tasa de retencin de EGCG disminuy a
87% cuando Incubadas en PBS slo con sales biliares y 65% con pancreatina (Figura 4C). Estos
resultados muestran que tanto las sales biliares Pancreatina en SIF tienen un impacto en la
estabilidad de los niosomas Y pancreatina tiene una mayor influencia en la estabilidad niosomal En
comparacin con las sales biliares. Variaciones de valor de PDI de los niosomas de EGCG Bajo
condiciones SIF diferentes tambin apoyan esta inferencia. Como se muestra en la Tabla 1, los
valores de PDI de las muestras incubadas en Diferentes condiciones aumentaron en el orden PBS>
sales biliares>Pancreatina> sales biliares + pancreatina. En comparacin con la PDI de muestras en
PBS y PBS con sales biliares Slo, los valores de PDI aumentaron significativamente despus de 2 h
de incubacin
en fluidos de digestin incorporados con pancreatin. La morfologa de EGCG carg niosomes
despus de que la incubacin en SIF especfico con sales de bilis o pancreatin separadamente
tambin fue observada por TEM. Como mostrado en Figuras 5B-1 y 5C-1, el interior de niosomes
incubado en SIF con sales de bilis o pancreatin muestra la distribucin irregular de reas ligeras y
oscuras a diferencia de niosomes recin listo con la luz surfactant la membrana que rodea el corazn
oscuro acuoso. La fusin de dos o ms partculas fue observada para las muestras incubadas con
sales de bilis, como mostrado en la Figura 5B-2. Alguna gotita apareci desintegrar cuando incubado
en SIF con pancreatin.
(La figura 5C-2) que correspondi a niosome no esfrico observado en la Figura 5A marcada con
flechas. Los dimetros de nanopartculas visualizadas por TEM para muestras fueron variados de
136 a 181 nm, 133 a 160 nm, y 166 a 200 nm para niosomes incubado en SIF tanto con sales de bilis
como con pancreatin o sales de bilis y pancreatin slo, que correspondi a los valores de PDI
aumentados en la Mesa 1. Comparado a los dimetros Medios de z obtenidos en la Figura 4, los
dimetros de gotita eran un poquito ms grandes por usando TEM. Resultados similares tambin
fueron observados por Zou et Al-43 que tambin puede ser causado por la inhomogeneidad de
muestras despus de la digestin. Ms pequeo digestive las micelas o niosomes no digerido que
no fue observado en TEM conduciran a bajar los dimetros Medios de z de vesculas niosomal por
usando DLS. Hay informes que surfactants (como polysorbate) atan protenas y enzymes44 y sus
complejos pueden desestabilizar el niosomes. Las micelas de cido de bilis atan el colesterol, 45 y
Tween tambin acta recprocamente con la bilis salts46 por su cola hidrfoba. Estas observaciones
sugieren que la membrana niosomal que consiste en Tween 60 y el colesterol pueda ser molestada
por las sales de bilis y pancreatin en SIF. Tanto las sales de bilis como pancreatin aparecieron
fundirse o unirse niosomes en partculas ms grandes. Sin embargo, mientras pancreatin caus la
interrupcin de las partculas fundidas, las sales de bilis no hicieron. El mecanismo del cambio
estructural de EGCG niosomes en el tracto gastrointestinal la extensin podra ser ilustrada por la
Figura 6. Como mostrado en la figura,

las sales de bilis insertaran en la membrana niosomal y causaran la fusin de gotitas, mientras
pancreatin puede interrumpir la membrana bilayer, conduciendo a la liberacin parcial de EGCG
atrapado.

- 1. Actividad Antioxidante Qumica de Niosomas Cargados con EGCG y EGCG Libre.

- Se encontr que la actividad antioxidante in vitro de EGCG durante la incubacin de SIF
estaba relacionada con el tiempo de digestin. Como se muestra en la Figura 7, los valores
de FRAP EGCG y EGCG cargado niosomas mostr una disminucin continua en el tiempo,
que corresponde con los resultados de EGCG degradacin en el SIF. Finalmente, los valores
de FRAP de la solucin de EGCG y los niosomas de EGCG se redujeron un 42% y un 12%,
respectivamente, despus de 2 h de incubacin de SIF. Es notable que los niosomas
cargados de EGCG mostraron un valor FRAP inferior al EGCG libre en el estado inicial, y una
velocidad de reduccin ms lenta (k = -0.0143) que la solucin EGCG (k = -0.185). Estos
resultados corresponden bien con la mayor estabilidad de los niosomas cargados con EGCG
en el tracto intestinal. El mayor valor FRAP de la solucin de EGCG que los niosomas
cargados con EGCG antes de la incubacin de SIF fue posiblemente debido al efecto de
blindaje de la membrana de bicapa niosomal, lo que impidi el contacto del EGCG con el
reactivo FRAP
- 1. Actividad de Antioxidante de Clula (CAA) Ensaye de EGCG Niosomes Cargado
y EGCG Libre. Los resultados de ensaye FRAP han mostrado que niosomal
encapsulation proporciona la proteccin buena a EGCG en todas partes del tubo
digestivo, debido a la barrera niosomal de la membrana que protege el corazn
EGCG del entorno alcalino. Sin embargo, es confuso que si EGCG carg niosomes
tiene propiedades de antioxidante en sistemas biolgicos. El ensaye CAA
desarrollado por Wolfe y Liu37 es un acercamiento biolgico a la actividad de
antioxidante. El carcinoma humano hepatocellular (HepG2) clulas usadas en el
ensaye CAA, como se ha relatado, tena muchas actividades similares biolgicas
como clulas normales vivas en la gente (L02) Entonces primero los valores de CAA
y argumentos de efecto medianos decididos de los datos de la fluorescencia DCF en
clulas HepG2 cultivadas con EGCG cargaron niosomes y muestran EGCG libre en la
Figura 8A-C. Todos los estudios en esta investigacin estaban basados en la
concentracin de EGCG dentro de la gama de seguridad (segn los resultados de
MTT mostrados en la Figura S1). Tanto EGCG libre como encapsulado apag el ABAP
indujo la reaccin peroxyl radical con unidades de fluorescencia reducidas (como
mostrado en la Figura S2). CAA los valores de EGCG carg niosomes aument
considerablemente (p <0.05) comparado a l de EGCG libre en la misma
concentracin (la Figura 8A). El ms alto CAA el valor de EGCG carg niosomes
puede sugerir que niosomal encapsulation aumente la actividad de antioxidante
celular de EGCG. El valor de EC50 fue calculado basado en el lineal regresin de la
curva de efecto mediana presentada en la Figura 8B, C. El valor de EC50 DE EGCG
libre era 10.4 g/mL, y fue disminuido a 6.9 g/mL despus incorporado a
niosomes. El CAA DE EGCG fue aumentado aproximadamente 1.5 pliegue por
encapsulation. Hu et Al-40 tambin observado que el EC50 DE EGCG disminuy, de
15.25 a 12.60 g/mL, como fue encapsulado en nanopartculas CS-CPP.
Desde EGCG es administrado oralmente, el CAA despus de que la digestin tiene que ser
determinada. EGCG carg niosomes fue recogido despus de la digestin simulada intestinal, y
luego diluido en varias concentraciones usadas para el ensaye CAA. Como presentado en la Figura
9, CAA los valores de EGCG carg niosomes y EGCG libre ambos disminuido comparado a los
resultados antes de la digestin, indicando que EGCG sera degradado en pasar por la va digestiva.
Sin embargo, comparado a la disminucin significativa en el valor de CAA DE EGCG libre despus de
la digestin, el valor de EGCG cargado en niosomes no se cambi considerablemente. El ensaye CAA
conviene con los resultados anteriores que niosomes aparecen proteger EGCG contra la
degradacin.
Segn la respuesta realzada de EGCG en la formulacin niosomal de la Cancin et ., Al-13 los valores
de CAA mejorados para EGCG niosome tambin podran ser atribuidos a los niveles de EGCG
aumentados intercelulares comparados para liberar EGCG. Ya que la direccin de pruebas de CAA
complic publicaciones incluyendo la respuesta, la distribucin, y el metabolismo de compuestos
en clulas, el mecanismo de EGCG que trabaja a las enzimas de antioxidante intrnsecas es todava
confuso. Pruebas ms celulares y pruebas de animal que se relacionan con la toxicidad y
bioavailability de EGCG niosomes ms lejos sern investigadas en nuestro despus de estudios. En
el resumen, niosomes listo por el mtodo de inyeccin de etanol fue usado encapsular EGCG para
realzar la estabilidad digestiva y la actividad de antioxidante in vitro. Relativamente alto EGCG que
deja despus de la digestin simulada intestinal revela las caractersticas de escape lentas del
sistema niosomal y el potencial de niosomes para proteger EGCG durante el paso por el sistema
digestivo. Los resultados de morfologa TEM, DLS la distribucin de tamao de partcula, y EGCG
estudios restantes muestran que EGCG carg niosomes permanecieron intactos despus SGF la
incubacin, pero en parte fueron rotos durante la incubacin SIF. Niosomal encapsulation mejor
la actividad de antioxidante de EGCG, an despus de la digestin, indicando que niosomal
encapsulation es un sistema de entrega potencial que podra ser usado realzar la estabilidad
digestiva y bioavailability de EGCG.

Actividad Antioxidante Celular (CAA) Ensayo de Niosomas Cargados con EGCG y EGCG Libre.
Los resultados del ensayo de FRAP han demostrado que la encapsulacin niosomal proporciona una
buena proteccin a EGCG a travs del tracto intestinal, debido a la barrera de membrana niosomal
que protege el ncleo de EGCG del medio alcalino. Sin embargo, no est claro si los niosomas
cargados de EGCG tienen propiedades antioxidantes en sistemas biolgicos. El ensayo CAA
desarrollado por Wolfe y Liu37 es un enfoque biolgico de la actividad antioxidante. Se ha
informado que las clulas humanas de carcinoma hepatocelular (HepG2) usadas en el ensayo de
CAA tienen muchas actividades biolgicas similares a las clulas vivas normales en seres humanos
(L02) 47. As pues, primero los valores de CAA y los grficos de efecto mediano determinados a partir
de los datos de fluorescencia de DCF en HepG2 Las clulas cultivadas con EGCG cargado niosomas y
libre EGCG se muestran en la Figura 8A-C. Todos los estudios en esta investigacin se basaron en la
concentracin de EGCG dentro de la gama de seguridad (de acuerdo con los resultados MTT se
muestra en la Figura S1). El EGCG libre y encapsulado apag la reaccin de radical peroxilo inducida
por ABAP con unidades de fluorescencia reducidas (como se muestra en la Figura S2). Los valores
de CAA de niosomas cargados con EGCG aumentaron significativamente (p <0,05) en comparacin
con el de EGCG libre a la misma concentracin (Figura 8A). El valor ms alto de CAA de los niosomas
cargados con EGCG puede sugerir que la encapsulacin niosomal aumenta la actividad antioxidante
celular del EGCG. El valor EC50 se calcul sobre la base de la regresin lineal de la curva de efecto
mediano presentada en la Figura 8B, C. El valor EC50 del EGCG libre fue de 10,4 g / ml, y se redujo
a 6,9 g / ml despus de incorporarse en los niosomas. La CAA de EGCG se increment
aproximadamente 1,5 veces por encapsulacin. Hu et al., 40 tambin observaron que la CE50 del
EGCG disminuy de 15,25 a 12,60 g / ml, ya que se encapsul en nanopartculas CS-CPP.

Figura 8. (A) Actividades antioxidantes celulares de la solucin de EGCG (ES) y de los niosomas
cargados con EGCG a diferentes concentraciones de EGCG (media STD, n = 6). (*) Diferencia
significativa (p <0,05). (B, C) Trazado del efecto medio para la inhibicin de la oxidacin de DCFH
inducida por el radical peroxilo por los niosomas cargados con EGCG (B) y EGCG libre (C).

Dado que el EGCG se administra por va oral, es necesario determinar la CAA despus de la digestin.
Los niosomas cargados con EGCG se recogieron despus de la digestin intestinal simulada, y
despus se diluyeron en varias concentraciones usadas para el ensayo CAA. Tal como se presenta
en la Figura 9, los valores de CAA de los niosomas cargados con EGCG y EGCG libre disminuyeron
ambos en comparacin con los resultados antes de la digestin, lo que indica que el EGCG se
degradara al pasar a travs del tracto digestivo. Sin embargo, en comparacin con la disminucin
significativa en el valor CAA de EGCG libre despus de la digestin, el valor de EGCG cargado en
niosomas no cambi significativamente. El ensayo CAA coincide con los resultados anteriores de
que los niosomas parecen proteger el EGCG contra la degradacin
Figura 9. Actividades antioxidantes celulares de los niosomas cargados de EGCG y EGCG libres a
diferentes concentraciones de EGCG despus de la digestin con SIF (media STD, n = 6). (*)
Significativo

Diferencia (p <0,05).

De acuerdo con la mayor captacin de EGCG en la formulacin niosomal de Song et al., 13 los valores
mejorados CAA para niosoma EGCG podra tambin atribuirse a los mayores niveles de EGCG
intercelular en comparacin con EGCG libre. Dado que las pruebas CAA abordan problemas
complicados incluyendo la captacin, distribucin y metabolismo de compuestos en las clulas, el
mecanismo de EGCG que trabaja a las enzimas antioxidantes intrnsecas an no est claro. Ms
pruebas celulares y animales en relacin con la toxicidad y la biodisponibilidad de EGCG niosomas
se investigar ms en los siguientes estudios. En resumen, los niosomas preparados por el mtodo
de inyeccin de etanol se usaron para encapsular EGCG para mejorar la estabilidad digestiva y la
actividad antioxidante in vitro. El EGCG relativamente alto que queda despus de la digestin
intestinal simulada revela las caractersticas de fuga lenta del sistema niosomal y el potencial de
niosomas para proteger EGCG durante el paso a travs del sistema digestivo. Los resultados de la
morfologa de TEM, la distribucin del tamao de partcula de DLS y los estudios EGCG restantes
muestran que los niosomas cargados de EGCG permanecieron intactos despus de la incubacin de
SGF, pero se rompieron parcialmente durante la incubacin de SIF. La encapsulacin niosomal
mejor la actividad antioxidante de EGCG, incluso despus de la digestin, lo que indica que la
encapsulacin niosomal es un sistema de suministro potencial que podra usarse para mejorar la
estabilidad digestiva y la biodisponibilidad de EGCG.