antimicrobianos em
biofilmes para o controle de
contaminao na indstria
de domissanitrios
Autores: Eliane Gama Lucchesi1, Slvia Yuko Eguchi2
e ngela Maria Moraes1
1
Departamento de Processos Biotecnolgicos,
Faculdade de Engenharia Qumica, Eliane Gama Lucchesi
Universidade Estadual de Campinas Slvia Yuko Eguchi
2
Dosage Pesquisas Laboratoriais, Investiga Institutos
ngela Maria Moraes
de Pesquisa
Contato: ammoraes@feq.unicamp.br
41
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artigo tcnico
bianos como antibiticos, biocidas e desinfetantes [5] do para inibir ou erradicar cepas causadoras de infeces.
que as clulas planctnicas, pioneiras na formao de Os testes da CIM e da CMM so ensaios padres para
biofilmes. verificar a susceptibilidade de clulas planctnicas a an-
Supe-se que menos de 10% dos micro-organismos tibiticos. Devido reprodutibilidade, os testes de CIM
presentes num sistema sejam, de fato, clulas planct- e CMM passaram a ser utilizados para auxiliar na de-
nicas, estando mais de 90% na forma de biofilmes [6]. finio de dosagem mnima de outros antimicrobianos,
Nas comunidades microbianas possvel observar in- tais como conservantes necessrios para preservao
teraes de mutualismo, comensalismo, antagonismo e de produtos com gua em sua composio.
saprofismo, responsveis pela estabilizao do sistema, Entretanto, em se tratando de biofilmes, este mtodo
podendo ocorrer entre micro-organismomicro-organis- no deve ser aplicado, pois os ensaios de susceptibilida-
mo ou micro-organismoorganismo multicelular [2]. de mostram que a concentrao de agente ativo para a
A formao do biofilme est diretamente relacionada erradicao do biofilme de 100 a 1.000 vezes maior do
adeso celular. Dentre os fatores que do incio ao pro- que a determinada para clulas planctnicas [6]. Esta re-
cesso de adeso esto as cargas superficiais da parede sistncia d-se principalmente pela MPE e pela compo-
celular das bactrias. A presena de fmbrias e pilis e sio da membrana externa e da parede celular, e ocor-
fatores genticos inerentes possibilitam sua interao re predominantemente com bactrias Gram-negativas
com variados tipos de superfcies [7], [8]. [10]. Degradao e inativao dos biocidas por enzimas
Segundo a American Society for Microbiology [9], a e metablitos das clulas do biofilme podem ocorrer [11],
formao do biofilme divide-se em cinco etapas conse- diminuindo drasticamente a sua eficcia na erradicao
cutivas. A etapa inicial, de adsoro reversvel, ocorre das clulas.
em segundos, e nela predominam as foras fracas de Variados sistemas vm sendo utilizados para o de-
atrao. Em seguida, ocorre uma etapa de adeso ir- senvolvimento controlado de biofilmes in vitro para que
reversvel, na qual predominam foras fsicas e qumi- se possa testar, de forma mais precisa e reprodutvel,
cas, que duram de segundos a horas. Aps esta etapa, sua susceptibilidade aos antimicrobianos, determinando
por perodos de horas a dias, ocorrem o crescimento e a concentrao inibitria mnima para clulas ssseis
a diviso celular, seguidos da formao da MPE [10]. e da concentrao inibitria mnima de erradicao de
Finalmente, na quinta e ltima etapa, ocorre a adeso biofilmes (CIMEB) [12]. Sistemas como a imobilizao
de outros organismos e a liberao de micro-colnias de clulas em hidrogis, o cultivo celular em quimios-
microbianas, que prolongam por perodos de dias as tatos, o uso de fermentador de filme com espessura
meses [10]. constante, reatores de fluxo simples, o dispositivo de
Durante a adeso, as clulas modificam seu fenti- Robbin modificado e o cultivo de clulas em placas
po em funo da proximidade do suporte, respondendo com micro-poos como o dispositivo MBEC podem
s condies ambientais com padres de crescimento ser empregados [1]. Entretanto, questes frequentes
diferentes dos observados em clulas livres [8]. Alm como a dificuldade de operao e os custos elevados
da maior resistncia a agentes antimicrobianos, outros limitam seu emprego como mtodos de uso rpido para
problemas esto associados presena dos biofilmes, o diagnstico de problemas e a proposio de possveis
dentre estes, maior populao em comparao de solues.
clulas planctnicas (podendo chegar a valores de at Como alternativa aos sistemas citados anteriormen-
10 a 10 UCF/mL), maior dificuldade de remoo das
11 12
te, foi desenvolvida uma estratgia baseada no uso
clulas do sistema, limpeza, manuteno de equipamen- de esferas de vidro como suporte para a formao de
tos, chegando at os efeitos deletrios sobre o produto biofilmes sob condies cisalhantes e em sua utilizao
final [10]. para a determinao da CIM e da CIMEB em processos
A anlise da concentrao inibitria mnima (CIM) e contaminados com micro-organismos ssseis [13]. Tal
da concentrao de morte mnima (CMM) muito utiliza- estratgia permite gerar biofilmes in vitro de foram rpi-
da na rea mdica e veterinria com intuito de se verifi- da e simultnea, de forma a possibilitar a realizao de
car a dosagem mnima de antimicrobianos necessrios testes com variados tipos de agentes antimicrobianos,
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de forma simples, rpida, verstil, reprodutiva e menos
dispendiosa em comparao aos dispositivos encon-
trados no mercado. Esta abordagem j foi testada com
sucesso na determinao da CIM e da CIMEB em amos-
tras de fluido de corte provenientes de processos de usi-
nagem de metais contaminados por micro-organismos Solues integradas
formadores de biofilmes [13]. Alm do vidro, outros tipos
de materiais podem ser utilizados como suporte para para seu projeto de
o desenvolvimento de biofilmes, como ao inoxidvel e
PVC, de uso comum em processos industriais.
sala limpa
Um dos setores industriais que apresenta proble-
mas com contaminao microbiana disseminada por
biofilmes o da produo de domissanitrios. Este seg-
mento passou por grandes mudanas em 2009, quando
a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA),
atravs da RDC 035/2008, proibiu a utilizao de formal-
dedo como conservante nestas formulaes.
Devido ao microbicida e microbiosttica do for- Produtos Swell:
maldedo, a maior parte das ocorrncias de contamina-
Divisrias / Portas / Visores / Pass-trough
o no processo fabril de domissanitrios era, de certa
Acessrios / Sistema de ar condicionado para reas
forma, corrigida com suplementao do conservante,
uma vez que o baixo custo do formaldedo permitia o
classificadas / Controles de temperatura
aumento na dosagem usada. Com a proibio do uso Umidade / Pureza do ar / Gradiente de presso
de formol, buscar alternativas de preservao passou a
ser premente.
Devido intensa contaminao por biofilmes nos
processos de fabricao, proveniente de vrios fatores,
a simples troca do formaldedo por outros agentes anti-
microbianos foi, num primeiro momento ineficaz, criando
a necessidade de repensar todos os conceitos no que
se refere contaminao microbiana neste segmento.
No presente estudo, o uso da tcnica de esferas de
vidro foi avaliada para o estabelecimento da dosagem
de erradicao de biofilmes e da estratgia de tratamen-
to para o controle da contaminao em duas indstrias
do setor domissanitrio, que apresentavam graves
problemas de contaminao microbiana. A eficcia dos
antimicrobianos em clulas ssseis, pela abordagem de
desenvolvimento dos biofilmes em de esferas de vidro,
foi comparada com a erradicao das clulas planctni-
cas pela anlise da CIM tanto em detergentes quanto em
amaciantes de roupas, que apresentaram problemas de
contaminao. Testes comparativos, empregando a me- Rua Caravelas, 225 Jd. Vale do Sol
todologia j estabelecida baseada no sistema MBEC, So Jos dos Campos SP CEP 12238-170
foram realizados, assim como ensaios empregando es-
Tel.: (12) 3939.5854 comercial@swell.eng.br
feras de ao inoxidvel em substituio s de vidro.
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artigo tcnico
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menor concentrao de cada agente antimicrobiano na tantes foram semeadas (por estrias) em meio de cultivo
qual no se verificou crescimento celular foi assumida TSA devidamente distribudo e solidificado em placas
como a CMM. de Petri. A menor concentrao na qual no se verificou
crescimento de clulas foi denominada concentrao
2.3. Formao de biofilme na superfcie de mnima de erradicao de biofilme (CMEB).
esferas de vidro ou ao inoxidvel e anlise de sua
susceptibilidade aos antimicrobianos 2.4. Formao de biofilmes no dispositivo
Os ensaios foram realizados com base na metodolo- MBECHTP e anlise de sua susceptibilidade aos
gia descrita por Lucchesi [15]. Para cada tipo de contami- antimicrobianos
nante os ensaios foram efetuados em triplicata, empre- Assim como no procedimento envolvendo esferas de
gando os quatro biocidas em diferentes concentraes. vidro, o ensaio com o dispositivo MBEC-HTP, produzido
Alquotas de 0,3g de esferas de vidro ou ao inoxidvel em poliestireno, foi realizado em duas etapas, onde numa
previamente lavadas foram acondicionadas em tubos de se inocula o contaminante formador de biofilme e nou-
ensaio com tampa de rosca (16mm x 100mm) e a cada tra onde se avalia seu comportamento frente a agentes
um dos tubos foram adicionados 4,5mL de cada suspen- antimicrobianos. A primeira etapa envolve um dispositivo
so microbiana contaminante (contendo 1,0 x 108 UFC/ formado por uma base retangular escavada provida de
mL), alm de 0,5mL de meio de cultivo TSB. Os tubos fo- 8 canais, onde colocada a populao contaminante, e
ram colocados em um homogeneizador (modelo AP-22, uma tampa com 96 pinos onde as clulas se fixam, for-
Phoenix) e foram agitados por movimentos rotacionais mando o biofilme. Na segunda etapa, a tampa contendo
(4 a 5 rpm) em estufa (modelo 320 L, Tecnal) ajustada os pinos transferida para uma nova base onde se en-
temperatura de 361C por 48 horas para a gerao dos contram 96 poos preenchidos com solues de biocidas
biofilmes em condies cisalhantes. e de amostras para a realizao de ensaios controle.
Aps a incubao, as esferas de vidro ou ao ino- Assim, para a primeira etapa, em bases distintas
xidvel foram removidas com o auxlio de uma cureta, foram adicionados 22 mL de cada um dos inculos pa-
transferidas para novos tubos de ensaios estreis, e la- dronizados (1,0x108 UFC/mL), e 2 mL de meio de cultura
vadas por duas vezes com gua destilada estril para a TSB. Os dispositivos foram tampados e transferidos para
remoo das clulas no aderidas e dos nutrientes em uma mesa agitadora com movimentos oscilatrios (4 a 5
contato com as partculas. Aps a lavagem foram adicio- oscilaes por minuto e inclinao de 5), posicionando-
nados 2,5mL do meio de cultura TSB e 2,5mL de soluo -os de forma que o fluxo do meio de cultura na base do
aquosa dos quatro biocidas testados nas concentraes dispositivo ficasse direcionado no sentido dos canais. O
de 1%, 5%, 10%, 15% e 20% (em massa) de cada produ- crescimento microbiano foi efetuado em estufa (modelo
to. Os tubos foram ento incubados em estufa a 361C 320 L, Tecnal) a 361C, por 48 horas para permitir a for-
por mais 24 horas, no caso das amostras provenientes mao dos filmes em cada um dos pinos com populao
do processo de produo de detergente, e por 3 horas microbiana superior a 1,0x10 6 UFC/pino.
no caso da amostra de amaciante contaminado. Aps Aps a incubao, a tampa do dispositivo MBEC
o perodo de incubao, as solues de biocidas foram foi retirada e lavada por duas vezes com soluo salina,
drenadas e as esferas lavadas com gua destilada estril para remoo das clulas planctnicas. Esta lavagem foi
por duas vezes. Em cada tubo foi adicionado 5mL de meio efetuada colocando-se a tampa do dispositivo em uma
de cultivo TSB, que foram sonicados (modelo USC1450, placa do tipo ELISA com 96 poos, contendo 0,2mL de
25 khz, Thornton) por 30 minutos para a desagregao soluo salina estril por poo. Aps a lavagem, a tampa
dos biofilmes e, aps 24 horas de incubao, a turvao do dispositivo foi encaixada em outra microplaca do tipo
ou no dos meios de cultivo foi analisada visando deter- ELISA com 96 orifcios, cada um contendo 0,1mL das di-
minar a menor concentrao de cada microbicida capaz ferentes concentraes dos biocidas e 0,1mL do meio de
de inibir o crescimento das clulas ssseis, ou seja, a cultura TSB, de modo a encaixar um pino em cada poo.
concentrao inibitria mnima de biofilme (CIMB). Para As placas foram incubadas a 361C por 24 horas. Aps
os tubos sem turvao, as suspenses celulares resul- o perodo de incubao, a tampa foi novamente lavada
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artigo tcnico
com soluo salina e colocada em uma nova microplaca recomendadas pelo fabricante [18] (estabelecidas com
contendo 200L de meio TSB fresco por poo. Aps 30 base em valores superiores CIM e CMM, na tentativa
minutos de sonicao, a placa foi incubada por mais 24 de antever e prevenir contaminaes em produtos aca-
horas, quando, ento, foi analisado o crescimento celu- bados e que variam de acordo com o tipo de aplicao)
lar por turbidez ou por estrias em meio TSA. A menor so de 1.000 a 2.000 ppm para o produto BHD-208, de
concentrao na qual no foi verificado o crescimento de 10.000 a 50.000 ppm para o BP-600 e o BP-610, e de
clulas foi denominada concentrao mnima de erradi- 5.000 a 10.500 ppm para o BHD-235.
cao do biofilme (CMEB). Os resultados apresentados nas Tabelas 1 e 2 cor-
roboram as afirmaes anteriores para as amostras de
2.5. Caracterizao das clulas contaminantes do detergente contaminado tratadas com os antimicrobia-
amaciante nos testados. Enquanto os dados coletados para micro-
A identificao dos micro-organismos contaminan- -organismos planctnicos (Tabela 1) apontam eficcia
tes do amaciante foi efetuada pela equipe do Prof. Dr. dos quatro microbicidas utilizados em concentraes
Welington Luiz de Arajo, da Universidade de Mogi das muito abaixo das indicadas pelo fabricante, os resulta-
Cruzes (So Paulo). Uma amostra representativa do dos obtidos para clulas em biofilmes mostram que as
amaciante contaminado foi inoculada em meio de cultura concentraes requeridas para o controle da contamina-
TSB a 10% e aps 72 h, foi realizada a extrao de DNA o so, de fato, muito superiores.
total. O gene 16S rRNA foi parcialmente amplificado por Quando comparados os resultados das duas tabelas
PCR e os fragmentos amplificados foram clonados em pode-se verificar o aumento significativo das dosagens
E. coli. A biblioteca de clones resultante foi caracteriza- para erradicao dos biofilmes formados em relao aos
da por ARDRA, utilizando-se as enzimas de restrio
HaeIII e HhaI. Clones divergentes foram identificados Tabela 1
por sequenciamento. A anlise fentica foi realizada
CIM (ppm de CMM (ppm de
Agente antimicrobiano
com o programa MEGA 4.0 e a rvore de similaridade foi agente ativo) agente ativo)
construda pelo mtodo de neighbour-joining. BHD-208 13,5 13,5
BP-600 10,5 10,5
BP-610 10,0 10,0
3. Resultados e discusso BHD-235 9,0 9,0
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resultados obtidos para as clulas planctnicas. Varia- formados nos dois tipos de materiais (Tabela 5). Pos-
es de 953 a 1200 vezes foram notadas na CIMB em sivelmente, os biofilmes formados em vidro e em ao
relao CIM, e de 953 a 2981 para a CMEB em com- inoxidvel possuem caractersticas similares.
parao CMM para os variados agentes microbicidas Variaes idnticas, de 1009 a 1020 para a CIMB em
avaliados. As menores concentraes requeridas para relao CIM, e de 1009 a 2032 para a CMEB em com-
o controle dos biofilmes foram obtidas com os produtos parao CMM foram obtidos tanto para o vidro quanto
BP-600 e BP-610. A maior discrepncia foi observada para o ao inoxidvel. Para todos os agentes microbicidas
para o microbicida BHD-208, que atua como um exce-
lente preservante, porm apresentou-se pouco eficaz
Tabela 3
como agente sanitizante.
CIMB (ppm de CMEB (ppm de
A Tabela 3 mostra os resultados do teste de erra- Agente antimicrobiano
agente ativo) agente ativo)
dicao de biofilmes efetuados empregando o sistema BHD-208 13,5 13,5
MBEC. A total correlao nos dados obtidos no sistema BP-600 10,5 10,5
MBEC em relao aos biofilmes produzidos na super-
BP-610 10,0 10,0
fcie das esferas de vidro confirma e valida de uso da
BHD-235 9,0 9,0
tcnica de esferas para este tipo de aplicao.
Resistncia de biofilmes formados, no dispositivo
MBEC, a partir de micro-organismos oriundos do
3.2. Formao e susceptibilidade do biofilme
processo de produo de detergente aos agentes
desenvolvido na superfcie das esferas de antimicrobianos em termos de concentrao inibitria
vidro ou ao de inoxidvel a partir de amaciante mnima para biofilmes (CIMB) e concentrao mnima
de erradicao de biofilmes (CMEB).
contaminado
Os resultados da CIM e da CMM obtidos para as
amostras de amaciante contaminado esto apresenta-
Tabela 4
dos na Tabela 4, enquanto que o comportamento quanto
CIM (ppm de CMM (ppm de
CIMB e CMEB verificado em esferas de vidro e de Agente antimicrobiano
agente ativo) agente ativo)
ao inoxidvel apresentados na Tabela 5. BHD-208 25,8 51,6
Assim como verificado para as amostras de deter-
BP-600 12,2 24,4
gente, os testes da CIM e da CMM com o amaciante
BP-610 10,05 10,05
de roupas contaminado mostraram a eficcia dos an-
BHD-235 12,2 12,2
timicrobianos para o controle dos micro-organismos
planctnicos, foram em concentraes muito inferio- Resistncia dos micro-organismos oriundos do
processo de produo de amaciante aos agentes
res s indicadas pelo fabricante.
antimicrobianos testados, para clulas planctnicas,
No foram observadas diferenas quanto s concen- em termos de concentrao inibitria mnima (CIM)
traes necessrias para a erradicao dos biofilmes e concentrao mnima de morte (CMM).
Tabela 5
CIMB (ppm de agente ativo) CMEB (ppm de agente ativo)
Agente antimicrobiano
Vidro Ao Inoxidvel Vidro Ao Inoxidvel
BHD-208 26.300 26.300 52.600 52.600
BP-600 12.322 12.322 24.644 24.644
BP-610 10.150 10.150 10.150 10.150
BHD-235 12.440 12.440 24.800 24.800
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artigo tcnico
observa-se que as concentraes requeridas para o con- plexo Burkholderia cepacia, Buttiauxella sp., Acidobac-
trole dos biofilmes foram maiores no caso das amostras teriaceae e Gemmatimonadaceae, sendo que nestes
de amaciante que das de detergente contaminado, o que dois ltimos no foi possvel avanar na identificao,
indica que a microbiota do amaciante contaminado mais o que sugere que estas possam ser espcies ainda no
resistente, possivelmente por resultar de uma populao descritas na literatura.
pr-existente que j havia sido exposta, por prolongado
perodo, a microbicidas com baixa ao residual, como
o formol. 4. Concluses
Durante os testes com amaciante de roupas
contaminado, verificou-se que os micro-organismos Os resultados deste estudo mostram que caso o
possuam um comportamento peculiar. Mesmo utili- tratamento para eliminar a contaminao dos sistemas
zando-se diversas tcnicas de manuteno e recupe- de fabricao do detergente e do amaciante de roupas
rao de micro-organismos, no foi possvel efetuar fosse baseado somente nos testes de CIM utilizando
a propagao deste consrcio microbiano em meios clulas planctnicas, a eficincia seria comprometida
de cultivo tradicionais. Observou-se que estes micro- necessitando rever toda a sistemtica de sanitizao e
-organismos somente se multiplicavam na presena preservao.
do amaciante de roupas, e que quando se retirava o Na prtica, definir o preservante mais eficaz, recupe-
produto, no havia crescimento de colnias em meio rar os produtos devolvidos e aumentar a dosagem de mi-
slido distribudo nas placas de Petri ou no meio de crobicida no foram aes que solucionaram o problema
cultivo lquido. Este comportamento levou ao inte- de contaminao. Foi necessrio, concomitantemente,
resse de identificar a populao microbiana presente efetuar um procedimento de limpeza mecnica com pos-
nesta amostra, atravs da caracterizao molecular terior sanitizao, para que as empresas erradicassem
destes contaminantes. Os resultados obtidos so a contaminao.
apresentados na Figura 1. O sistema de esferas mostrou-se simples, eficiente,
A comunidade bacteriana encontrada neste ama- com a vantagem de permitir a medida CIMB, alm de
ciante de roupas foi composta por organismos do com- representar um custo 40% inferior ao MBEC.
Figura 1 Padro de bandas dos isolados da amostra de amaciante, obtida por meio da tcnica de ARDRA. A:
resultados obtidos com a enzima HaeIII; B: resultados obtidos com a enzima Enzima HhaI; M: marcador molecular de
100pb; A01 a A18: isolados.
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