CaraCterizaCiones
de pptidos ptimas:
Una gua prctica de mapa de pptidos
introduCCin
Mapa de pptidos, una herramienta inestimable para compuestos La seleccin de una tcnica cromatogrfica para separar pptidos y
biofarmacuticos, es un mtodo muy potente adems de la prueba de generar mapas de pptidos depende de la protena, de los objetivos
identidad ms utilizada para protenas, especialmente las que se producen experimentales y del resultado previsto. Sin embargo, la excelente
por medios recombinantes. Por lo general, incluye la digestin enzimtica potencia resolutiva de la cromatografa de fase reversa (RPC) hace que
(normalmente con el uso de tripsina) de una protena para producir esta sea la tcnica de HPLC predominante para separaciones de mapa
fragmentos de pptidos, seguida por la separacin e identificacin de los de pptidos. Tambin resulta ideal para separaciones analticas y de
fragmentos en una forma reproducible; esto permite la deteccin y control preparacin, debido a la disponibilidad de eluyentes de fase mvil voltil.
de cambios de aminocidos individuales, oxidacin, deamidacin y otros Es importante tener en cuenta que las columnas preferidas para las
productos de degradacin. Tambin permite la deteccin directa de separaciones de mapa de pptidos son similares a las que se usan para
variantes comunes de anticuerpo monoclonal como la ciclizacin molculas pequeas; sin embargo, debido a que las separaciones de
N-terminal, el procesamiento de lisina C-terminal y la N-glicosilacin, mapa de pptidos se realizan con un pH bajo y una temperatura elevada,
as como otras modificaciones post-traslacionales. se utilizan de forma rutinaria columnas con una estabilidad de pH
excelente y efectos de silanoles mnimos.
Un mapa de pptidos es una identificacin de una protena, as como el
producto final de varios procesos que proporcionan una comprensin Es necesaria una inspeccin cuidadosa de la estrategia de caracterizacin
completa de la protena que se analiza. Incluye cuatro pasos principales: completa para generar mapas de pptidos correctos. Un perfil puede
aislamiento y purificacin de la protena; divisin selectiva de los enlaces consistir en unos 100 picos que representan pptidos individuales y sus
de pptidos; separacin cromatogrfica de los pptidos y anlisis validado derivados; debido a ello, requiere conocimiento de mtodos de preparacin
de los pptidos. de muestras, tcnicas de separacin potentes y protocolos validados.
La capacidad y la informacin necesarias para desarrollar un mapa de
El mapa de pptidos se considera un procedimiento comparativo que pptidos correcto le ayudar a conseguir la mejor separacin posible de
confirma la estructura primaria de la protena y detecta alteraciones en sus digestos proteolticos, as como a conseguir un resultado de
su estructura. De forma adicional, muestra consistencia en el proceso y caracterizacin de pptidos correcto y fiable.
estabilidad gentica. Un mapa de pptidos debe incluir la identificacin
positiva de la protena, maximizar la cobertura de la secuencia de pptidos El objetivo de esta gua prctica de mapa de pptidos es destacar las
completa y proporcionar informacin adicional, as como la identificacin reas que son importantes para generar mapas de pptidos mediante
de la secuencia ms all de la que se obtiene al nivel de protena no cromatografa de fase reversa, compartir algunas de las tcnicas
digerida. fundamentales que se usan en procedimientos de mapa de pptidos y
subrayar consideraciones para la optimizacin de sus separaciones de
mapa de pptidos, con el fin de conseguir los mejores resultados posibles.
2
Digestin de protenas:
Preparacin de protena para mejorar
la separacin de mapa de pptidos
Para garantizar una digestin completa y satisfactoria, as como para opciones a tener en cuenta para la optimizacin de la digestin, deben
proporcionar un alto grado de seguridad en la estrategia elegida, resulta seguirse algunos enfoques comunes. Los cinco pasos que se siguen para
til tener un buen conocimiento de los pasos de la digestin de una la digestin de protenas, resumidos en la Tabla 1, son (1) preparacin de
protena antes del anlisis. Con frecuencia, el mtodo de digestin muestra (2) seleccin de agentes de divisin (3) alquilacin/reduccin (4)
requiere su propia serie de protocolos de desarrollo para proporcionar una proceso de digestin (5) enriquecimiento/limpieza.
muestra adecuada y estable para la inyeccin LC. Aunque hay muchas
Tabla 1
Cinco pasos para la digestin de protenas
procedimiento efecto previsto experimento general
1. Preparacin de muestras Preparacin de la muestra para digestin Reduccin, enriquecimiento, dilisis, desalinizacin
2. Seleccin de agente de divisin Requisito de divisin especfico Ninguno
3. Reduccin y alquilacin La reduccin reduce los enlaces de disulfuro Reduccin: DTT, 45 min, 60 C
La Alquilacin inhibe los grupos SH Alquilacin: IAM, 1 h, con oscuridad
4. Proceso de digestin Divisin de protenas Digestin: pH 8, 37 C, durante la noche
Atenuacin: adicin de TFA
5. Enriquecimiento/limpieza Preparacin de muestra para anlisis de LC o LC/MS Puntas de C18, concentracin, dilisis, columnas de afinidad
4
Las columnas Bio SEC de Agilent pueden
clasicar ecazmente (por tamao)
y desalinizar mezclas de protenas antes
de las aplicaciones de mapa de pptidos.
La filtracin en gel es uno de los mtodos de cromatografa ms sencillos o diferente al de la muestra. Despus de la aplicacin de la muestra a la
de realizar; esto se debe a que las muestras se procesan mediante una columna, se aade ms del tampn de columna (tampn de elucin) para
elucin isocrtica. En su forma analtica, la filtracin en gel (tambin llevar las molculas de la muestra por la columna. Las molculas mayores
conocida como cromatografa de exclusin por tamao) puede distinguir (que no pueden introducirse en los poros del medio) se eluyen de la
entre molculas (como protenas) con pesos moleculares que no difieran columna en primer lugar, seguidas por las molculas ms pequeas que se
ms del doble. En estas aplicaciones, la diferencia de tamao entre difunden en los poros, volvindolas ms lentas en relacin a las molculas
sustancias separadas es muy grande (por ejemplo, protenas frente a mayores. Si el tampn de elucin es diferente de la muestra que se ha
sales). Se elige un medio de filtracin en gel que excluya por completo las aplicado, las molculas mayores se desplazan de las sales originales y se
molculas de mayor tamao, mientras que se permite que las molculas eluyen en este nuevo tampn, que est completamente separado del
ms pequeas se difundan libremente en todos los espacios porosos. tampn de muestra original.
La columna se equilibra con un tampn, que puede ser el mismo
3,399
350
matriz roja/alqulica
300 Cadena pesada 2
250
200
Cadena ligera 2,759
Cadena pesada 1 Figura 1: separacin de fase reversa de un anticuerpo
3,287 monoclonal reducido y con grupos alquilo antes del
150
protocolo de digestin, con una columna de 2,1 x
0,464 50 mm Agilent 300SB-C8 de resolucin rpida y alta
100 denicin (RRHD, por sus siglas en ingls), n. de ref.
0,406
2,404 Agilent 857750-906. La separacin se realiz a
0,333 Fragmento de cadena
50 0,5 ml/min, a 75 C con agua (0,1% TFA)/ACN
0,229 2,956 4,462 4,855 (0,08%) en condiciones con multisegmento en un
LC Agilent 1290 Innity.
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 min
6
Paso 4: digestin
Como ya se ha mencionado, la tripsina es la peptidasa ms utilizada para pH de digestin. En general, el pH de la mezcla de digestin est
la digestin, debido a su especificidad bien definida. Ya que la tripsina es empricamente determinado para garantizar la optimizacin del
una protena, puede digerirse a s misma en un proceso llamado autolisis. rendimiento de un agente de divisin concreto. Por ejemplo, cuando se
No obstante, Ca++, presente de forma natural en la mayora de muestras, usa bromuro de ciangeno como agente de divisin, es necesario un
se une en el bucle de unin de Ca++ en tripsina y evita la autolisis. Con la entorno de acidez alta (p. ej., pH 2, cido frmico); no obstante, cuando
tripsina modificada que se utiliza ahora en la mayora de laboratorios, se usa tripsina como agente de divisin, resulta ptimo un entorno
la autolisis se reduce adicionalmente y no suele suponer un mayor ligeramente alcalino (pH 8). Como norma general, el pH del medio de
problema. reaccin no debe modificar la integridad qumica de la protena durante
la digestin ni el proceso de la reaccin de fragmentacin.
La digestin trptica se realiza con un pH ptimo en el rango 7,5 8,5 y
habitualmente a 37 C. Para proporcionar un pH ptimo para la divisin
enzimtica, se aade un tampn, normalmente 50 mM de bicarbonato de
tiempo y temperatura de digestin. El tiempo y la temperatura
desempean una funcin importante en una digestin ptima. Para
amonio de trietilo (tABC), o 12,5 mM de bicarbonato de amonio (ABC)
minimizar las reacciones qumicas, es adecuada (y recomendada)
antes de la adicin de tripsina. Un tampn de 2-amino-2-hidroximetil
una temperatura entre 25 C y 37 C para la mayora de digestiones de
propano-1,3-diol (Tris) tambin se puede usar para este fin, pero se debe
protenas (p. ej., las digestiones de tripsina se realizan habitualmente a
tener en cuenta que el tampn de Tris no es compatible con el anlisis
37 C). No obstante, el tipo y tamao de protena determinar en ltima
de MS, como MALDI y ESI-MS; por tanto, deber reducirse mediante
instancia la temperatura de la reaccin debida a la desnaturalizacin
extraccin de fase slida (SPE, por sus siglas en ingls) o ZipTips. Para
de protenas, a medida que la temperatura de la reaccin aumenta.
garantizar una cantidad suficiente (pero no demasiado alta) de enzima
El tiempo de reaccin tambin es un factor a tener en cuenta en la
en la realizacin de la digestin, es imprescindible tener la relacin
optimizacin del protocolo de digestin. Si hay una cantidad de muestra
enzima-protena correcta.
suficiente disponible, se considerar la realizacin de un estudio
experimental para determinar el tiempo ptimo para obtener un mapa
Las protenas pueden actuar de forma diferente en diferentes entornos;
reproducible, al mismo tiempo que se evita una digestin incompleta.
cuando se digieren protenas modelo en una mezcla, se observan
El tiempo de digestin vara de 2 h a 30 h, en funcin del tamao y tipo
digestiones menos eficaces que cuando se digieren de forma separada.
de muestra, mientras que la reaccin se detiene mediante la adicin de
Una razn que explica este hecho puede ser la competicin creciente por
un cido, lo cual no interfiere en el mapa, o bien mediante congelacin.
zonas de divisin de tripsina, cuando se digieren ms protenas juntas.
De forma adicional, puede haber muchos factores y parmetros
condicionales que afecten a la integridad y eficacia de la digestin de Concentracin de enzima de divisin. La concentracin del agente de
protenas, produciendo una variedad de resultados previstos. Si estos divisin debe minimizarse para evitar su contribucin a los patrones de
factores se comprenden o controlan mejor, los resultados de la digestin mapas. Con frecuencia se utiliza una cantidad excesiva de agente de
pueden mejorarse considerablemente. El pH de la reaccin, el tiempo de divisin para lograr un tiempo de digestin razonablemente rpido
digestin y la temperatura, as como la cantidad de agente de divisin (es decir, de 6 a 20 horas); sin embargo, debe tenerse mucho cuidado
empleado, son fundamentales para la eficacia de la digestin. con este aumento en las cantidades. Por lo general se usa una relacin
protena-peptidasa entre 10:1 y 200:1, y se recomienda que el agente
de divisin de aada en dos o ms fases para optimizar la divisin.
La tripsina se aade de esta forma en muchos procedimientos estndar
de digestin de tripsina. Sin embargo, el volumen de reaccin final
permanece lo suficientemente pequeo para facilitar la separacin,
que es el siguiente paso en el mapa de pptidos. Para resolver los
artefactos de digestin que podran interferir con el anlisis posterior,
se realiza una determinacin en blanco; para ello se usa un control de
digestin con todos los reactivos, excepto la protena de prueba.
8
preparacin de solucin de reduccin, alquilacin y digestin: Resumen
100 mm de bicarbonato de amonio: aadir 100 ml de agua a 0,7906 g de bicarbonato de amonio. Almacenar en un refrigerador a 4 C hasta 2 meses.
solucin madre de tripsina: Se puede adquirir tripsina modificada: Tripsina de calidad protemica de Agilent (n. de ref.; 204310, consulte en la siguiente
pgina "Reactivos y equipo"). Est liofilizada y puede almacenarse bajo esta forma a -20 C durante ms de un ao sin que haya una prdida significativa
de actividad. Cuando sea necesario, debe prepararse solucin madre de tripsina mediante la hidratacin de tripsina liofilizada en 100 l de 50 mM de cido
actico hasta obtener una concentracin final de 1 g/ml. Para minimizar los ciclos de congelacin-descongelacin y aumentar la estabilidad de
almacenamiento, debe dividirse la tripsina hidratada en cuatro tubos separados de ~10 l cada uno. Debe almacenarse cada muestra exacta a -20 C en
un congelador sin No Frost. Esta solucin de 1 g/l se utiliza para preparar la solucin intermedia de tripsina segn sea necesario (lase ms abajo).
Tenga en cuenta que la tripsina de calidad protemica de Agilent incluye documentacin tcnica que proporciona un protocolo alternativo para la digestin
trptica. Hemos utilizado el mtodo que aparece a continuacin y hemos concluido que es sencillo y fiable.
dtt 200 mm: aadir 1 ml de agua a 0,031 g de DTT en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Vrtex. Dividir la solucin de DTT en muestras alcuotas segn
convenga (por ejemplo, 100 l) en tubos de microcentrifugadora. Almacenar cada muestra exacta a -20 C hasta un mes en un congelador sin No Frost.
No descongelar y volver a congelar.
200 mm de iam (preparar justo antes de su uso): aadir 1 ml de agua a 0,037 g de IAM en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Vrtex.
3. Aadir 25 l de agente de desnaturalizacin de TFE. 2. Si desea digerir menos de 20 g de protena total, preparar solucin intermedia de
tripsina diluyendo solucin madre 10 veces mayor con la adicin de 45 l de agua
4. Aadir 1,0 l de solucin madre de DTT. ultrapura. Esta solucin de 100 ng/l puede almacenarse a -20 C durante 2 meses sin
5. Vrtex para mezclar. prdida de actividad significativa.
advertenCia: Si el IAM no se destruye, empezar a aadir grupos de alquilos lisinas lentamente.
6. Calentar bajo una de las series de condiciones para desnaturalizar:
60 C entre 45 minutos y 1 hora 3. Aadir solucin madre de tripsina entre 1:20 y 1:50 segn masa de
90 C entre 20 minutos (protenas hidroflicas) y 1 hora (protenas enzima:sustrato. Por ejemplo, para 500 g de protena, aadir entre 10 y 25 g
hidrfobas) de tripsina (entre 10 y 25 l de solucin madre de tripsina).
3. Incubar muestra con oscuridad (gradilla cubierta con lmina) a temperatura 1. Aadir 1 l de de cido frmico limpio o TFA para reducir el pH y detener la
ambiente durante 1 hora. actividad de tripsina.
Si hay que desalinizar, usar TFA ya que ayuda en la unin de pptidos a la
atenuacin de exceso de iam resina durante la limpieza.
1. Aadir 1,0 l de solucin madre de DTT para destruir el exceso de IAM. 2. Vrtex, brevemente.
2. Dejar durante 1 hora con oscuridad (gradilla cubierta con lmina) 3. Si el pH de la muestra original es algo a tener especialmente en cuenta,
a temperatura ambiente. comprobar el pH (normalmente entre 3,0 y 3,3). Aadir ms cido si el pH es
dilucin y ajuste de pH superior a 4.
4. Aadir ms base (bicarbonato de amonio) si el pH no se encuentra en el La opacidad puede deberse a restos celulares en la muestra.
rango entre 7 y 9. 3. Diluir una muestra exacta segn sea necesario para el anlisis.
Si la protena tiene un peso molecular de 50 kDa y si la digestin lleg a
completarse, la solucin es de unos 20 pmol/l.
Si la muestra es menos compleja, diluir hasta conseguir una solucin de
50 fmol/l.
reactivos y equipo
elemento necesario ejemplo
Bicarbonato de amonio, de pureza analtica Catlogo de Sigma n. A-6141
Ditiotreitol (DTT), >+99% Catlogo de Sigma n. D-5545
Iodoacetamida (IAM), 97% Catlogo de Sigma-Aldrich n. I-670-9
Trifluoroetanol (TFE), +99% Catlogo de Sigma-Aldrich n. T63002-100G
Tripsina, modificada Tripsina de calidad protemica de Agilent (n. de ref. 204310)
Agua, 18 megaohmios o equivalente N. de ref. Agilent 8500-2236
cido frmico, pureza analtica o cido trifluoroactico, N. de ref. Agilent G2453-85060
grado de secuenciacin
Tubos de microcentrifugadora con cierre de seguridad N. de ref. Eppendorf 022363611 (0,5 ml, caja de 500) o n. de ref. 022363204 (1,5 ml, caja de 500)
Eppendorf
Micropipetas y puntas: rango de 1 1000 l
Calentador/sellador de tubos Agitador calentador Eppendorf
Tiras indicadoras del pH, rangos de pH 2,5 4,5 Tiras Science ColorpHast de EM, catlogo n. 700181-2
y 7,0 9,0
Balanza analtica
Puntas Bond Elut OMIX, 10 l (volumen de elucin Puntas de 1 x 96 (n. de ref. Agilent A5700310); Puntas de 6 x 96 (n. de ref. Agilent A5700310K)
2 10 l)
Puntas Bond Elut OMIX, 100 l (volumen de elucin Puntas de 1 x 96 (n. de ref. Agilent A57003100); puntas de 6 x 96 (n. de ref. Agilent A57003100K)
10 100 l)
10
para la limpieza de volmenes ms pequeos de pptidos:
Puntas Bond Elut OMIX
mtodo de Bond elut omiX (volumen 10 l) para limpieza de digesto de pptidos
pretratamiento de Ajustar la muestra a una concentracin de cido trifluoroactico (TFA) de 0,5% 1,0% con el uso de una solucin de TFA de 2,5%
muestra
acondicionamiento Aspirar 10 l de acetonitrilo al 50% (ACN): introducir agua y descartar el disolvente. Repetir. Aspirar 10 l de solucin de TFA al 1,0% y
y equilibrado descartar el disolvente. Repetir.
aplicacin de Aspirar hasta 10 l de muestra pretratada en punta OMIX. Dispensar y aspirar la muestra 3 5 ciclos para obtener la mxima eficacia.
muestra Pueden usarse hasta 10 ciclos para mejorar la unin.
enjuagar Aspirar 10 l de tampn de TFA al 0,1% y descartar el disolvente. Repetir.
elucin Anlisis de LC/MS o LC/MS/MS: aspirar 2 10 l de cido frmico o cido actico al 0,1% en 50 75% de acetonitrilo o 50 75% de
solucin de metanol y dispensar en un vial de inyector automtico o placa de pocillos.
Para obtener los mejores resultados, ajustar la pipeta para que coincida con el volumen de punta (10 l) para los pasos de equilibrado, aplicacin de
muestra y enjuague. Para la elucin, tomar una muestra del volumen exacto de solucin de elucin en un contenedor separado y mantener la pipeta
en el ajuste mximo de volumen para que coincida con el volumen de punta, 10 l.
Obtenga ms informacin sobre la preparacin de muestras automatizada para mapa de pptidos en la pgina 22.
70
60
Absorbancia de UV
50
40
30
20
10
12
Requisitos para una correcta
separacin de mapa de pptidos
El enfoque general en el desarrollo de un mtodo de RPC prctico para as como para conseguir una separacin reproducible y slida.
mapa de pptidos requiere una buena comprensin de los requisitos La seleccin de columna, la calidad de columna, la seleccin de fase mvil
de columna especficos de pptidos y del desarrollo de mtodos y los requisitos de deteccin son todos componentes importantes en las
cromatogrficos. Aunque muchos de los mismos principios separaciones de mapa de pptidos; estos componentes pueden mejorar
cromatogrficos se aplican a la separacin de pptidos, en comparacin considerablemente la calidad de sus mapas de pptidos.
con separaciones de molculas pequeas, hay algunas variables
especficas de la condicin para la optimizacin del mtodo de pptidos,
seleccin de columnas
El aspecto ms importante para conseguir una separacin de mapa de Las separaciones de pptidos producen nmeros de placa ms pequeos
pptidos fiable y bien resuelta es la seleccin de una columna adecuada. debido a sus coeficientes de difusin ms altos; tambin han favorecido el
El tamao de poro de columna, el tipo y tamao de partcula y la qumica y uso de materiales de columna totalmente porosos de menor dimetro con
estabilidad de fase ligada (qumica y lecho compacto) tienen una funcin flujos ms lentos. Esto ha generado un aumento en los envases por debajo
importante en la facilitacin de la separacin de mapa de pptidos, de 2 m para obtener mapas de pptidos ms eficaces. Sin embargo, ms
la estrategia de optimizacin y el anlisis espectromtrico. Para recientemente, las columnas superficialmente porosas han ganado
separaciones de pptidos, los tamaos de poro de columna preferidos popularidad para las separaciones biolgicas (especialmente en la
se sitan entre 100 y 120, mientras que la seleccin de fase ptima industria biofarmacutica), ya que resuelven las limitaciones de la difusin
es normalmente C18. Aunque algunas columnas comerciales ofrecen de masa de protenas y pptidos. Estas columnas ofrecen una ruta de
tamaos de poro para pptidos de hasta 60, estos estn normalmente difusin ms corta que permite las separaciones de molculas mayores a
relacionados con separaciones de fragmentos de pptidos ms pequeos velocidades lineales altas, sin los aumentos de contrapresin del sistema
o anlisis de patrones. Del mismo modo, se usan longitudes de cadena de asociados con las partculas ms pequeas. En la figura 5 se muestra el
carbono de fase ligada ms pequeas; sin embargo, estas tienen relacin ejemplo de un mapa de pptidos de resolucin alta rpida, con el uso de
con mtodos especficos y su funcionalidad es limitada para conseguir una columna superficialmente porosa.
retencin a lo largo de la amplia variedad de hidrofobicidad de pptidos.
70
60
50
40
30
20
10
Figura 5: separacin de fase reversa de BSA con una columna de 2,1 x 150 mm de mapa de pptidos Agilent AdvanceBio (n. de ref. Agilent 653750-902).
La separacin de mapa de pptidos se realiz a 0,3 ml/min, a 40 C con gradiente lineal de agua (0,1% TFA)/ACN (0,08%).
La calidad de columna (reproducibilidad y estabilidad de un anlisis a otro) es un requisito esencial, que a veces se pasa por alto, para mantener
separaciones de mapa de pptidos reproducibles y slidas. La separaciones de fase reversa de pptidos se realizan generalmente con pH bajo (pH<3)
y a temperaturas elevadas (>40 C). Los mapas de pptidos requieren una operacin repetible para obtener identificaciones de mapa precisas, as como
protocolos de validacin repetidos. Al elegir una columna para mapa de pptidos, la calidad de la columna debe ser lo primero a tener en cuenta en la
decisin. En la figura 6 se muestra un ejemplo excelente de mapa de pptidos reproducible de un digesto trptico de anticuerpo monoclonal, separado en
condiciones de pH bajo y temperatura elevada, durante un anlisis de LC/MS.
mAU
anlisis 2
550
anlisis 4
500
450 anlisis 6
400
anlisis 8
350
14
seleccin de fase mvil
El disolvente usado con ms frecuencia en el mapa de pptidos es agua Las fases mviles que se emplean en la cromatografa de fase reversa
con acetonitrilo como modificador orgnico, para el que no se recomienda (RPC, por sus siglas en ingls) para el anlisis de protenas y pptidos
ms del 0,1% de agente de emparejamiento inico. En determinadas contienen un aditivo que sirve como agente de emparejamiento inico.
circunstancias, puede aadirse alcohol proplico o alcohol isoproplico para Este componente aumenta la hidrofobicidad de pptidos mediante la
solubilizar los componentes de digesto, teniendo en cuenta que la adicin formacin de emparejamientos inicos con sus grupos cargados. Como
no aumenta excesivamente la viscosidad de los componentes. Las fases consecuencia, la interaccin de los pptidos con la fase estacionaria
mviles con una solucin tampn que contienen fosfato se usan para dar hidrfoba es posible y, por tanto, tambin lo es su separacin mejorada
algo de flexibilidad a la seleccin de condiciones de pH; esto se debe a mediante un aumento de retencin. Otros aditivos habituales, como el
que los cambios de pH en el rango 3,0 5,0 aumentan la separacin de cido trifluoroactico (TFA), el cido frmico (FA) y el cido actico (AcOH)
pptidos que contienen residuos cidos (p. ej., cidos glutmicos y pueden dar lugar a pH muy bajos y promover el despliegue y la
asprticos). Los fosfatos de sodio o potasio, el acetato de amonio y el desnaturalizacin de protenas. De este modo las molculas, como los
cido fosfrico con un pH entre 2 y 7 (o mayor en el caso de soportes pptidos, se eluyen en bandas ms pronunciadas y ms simtricas. El
basados en polmeros) se han usado tambin con gradientes de agente de emparejamiento inico ms usado para la separacin de
acetonitrilo. El acetonitrilo que contiene cido trifluoroactico se usa con protenas y pptidos es el TFA, tanto por su compatibilidad (volatilidad alta)
mucha frecuencia. con espectrometra de masas como por la afinidad del pptido cargado.
deteccin
La deteccin de pptidos es normalmente de entre 210 nm y 220 nm y/o mezcla de 0,1% de TFA en agua (disolvente A) y 0,08% de TFA (disolvente
280 nm (figura 7). La deteccin a 280 nm se realiza a menudo en paralelo B) en ACN, que se usa para minimizar la deriva inicial provocada por
con la deteccin a 210 nm en mapas de pptidos. El triptfano, la tirosina y cambios en la absorbancia durante el curso del gradiente de elucin. En la
la fenilalanina son sensibles a 280 nm, mientras que la deteccin a 210 nm figura 7 se muestra una comparacin de ejemplo de una separacin de
es relativamente poco selectiva para muchas otras sustancias biolgicas mapa de pptidos con variacin de longitud de onda entre 220 nm y 280
en la matriz de muestra. No obstante, la sensibilidad a 210 nm y 220 nm es nm; se muestran en detalle las diferencia en los perfiles de sensibilidad de
entre dos y cuatro veces mayor que a 280 nm. De forma adicional, tiene absorbancia y de pico de UV.
cierta importancia para el perfil de deteccin de mapas de pptidos la
40
220 nm
30
20
10
0
0
4 10 20 30 40 50 min
3
280 nm
2
16
(2) variables para el cambio de selectividad (a) del mapa de
pptidos
Los cromatografistas que trabajan con muestras biolgicas, por lo general, En la figura 8 se detalla una comparacin entre dos regiones de gradiente
posponen un cambio de las condiciones de columna (N) hasta que el idntico cuando se aumenta la temperatura de 30 C (cromatograma
espacio de bandas (a) ha mejorado. Los cambios en la temperatura y en la superior) a 60 C (cromatograma inferior) para un digesto trptico de
pendiente del gradiente resultan tiles (sin cambios en la fase mvil o mioglobina. A una temperatura elevada de 60 C, el perfil de separacin
columna) y deben explorarse en primer lugar para mejorar el espacio de detalla cambios en la forma de banda y en la posicin de pico que se
bandas (a) para la optimizacin de una separacin de mapa de pptidos. resalta mediante los picos 1 7. Es evidente que algunos de los cambios
destacados en esta regin del cromatograma son la separacin mejorada
entre los picos 1, 2 y 3 y las diferencias de posicionamiento de banda
Un cambio en la temperatura es un mtodo potente de cambiar
(selectividad) entre los picos 4 y 5.
la selectividad que podra provocar un cambio de retencin para residuos
peptdicos concretos. La elevacin de la temperatura de una separacin de
mapa de pptidos produce bandas ms estrechas, reduce la contrapresin
del sistema y cambia la selectividad. Se recomienda una temperatura
inicial de 30 35 C; sin embargo, la temperatura ptima para una
separacin de mapeo concreta depender de muchos factores segn
el tipo de digestin y la composicin. Algunos pptidos muy hidrfobos
requieren una temperatura de 60 80 C para una recuperacin mxima,
mientras que la selectividad para una muestra concreta ser a menudo
mejor para una temperatura concreta entre 30 y 60 C.
50
30 C 6, 7
334 bar 2
3
40
4
1
30
20
10
20 2
10
Figura 8: separacin de gradiente de digesto trptico de mioglobina a 5,0 8,0 min de un gradiente de 20 min
con una columna de mapa de pptidos AdvanceBio de 2,1 x 150 mm (n. de ref. Agilent 653950-302). Las dos
separaciones se completaron con un gradiente lineal de agua (1,0% TFA)/ACN (0,08% TFA), 0,3 ml/min con
215 nm en un sistema LC cuaternario bioinerte Agilent 1260 Innity. El cromatograma superior se separ a una
temperatura de 30 C y el cromatograma inferior se complet a una temperatura de 60 C.
Figura 9: efecto de pendiente del gradiente durante una separacin de digesto trptico de
mioglobina
mAU
40 gradiente de 15 minutos
35 42 picos
30
25
20
15
10
5
0
-5
0 2 4 6 8 10 12 14 min
mAU
40 gradiente de 40 minutos
35
56 picos
30
Figura 9: separaciones de gradiente de digesto trptico
25 de mioglobina con una columna de mapa de pptidos de
20 2,1 x 150 mm AdvanceBio (n. de ref. Agilent 653950-302)
15 en un sistema LC cuaternario bioinerte Agilent 1260
10 Innity, con gradiente lineal de agua (1,0% TFA)/ACN
5 (0,08% TFA), 0,6 ml/min a 50 C. El cromatograma
0
superior se complet en 15 minutos, mientras que el
cromatograma inferior se complet en 40 minutos.
-5
Los asteriscos en cada cromatograma representan los
0 5 10 15 20 25 30 35 min mismos picos.
18
(3) ajustar las condiciones de columna para una mayor
optimizacin
Una vez se ha optimizado el gradiente en trminos de retencin (k') y Se ha demostrado que la elucin del gradiente, las variables posteriores
selectividad (a), son posibles ms mejoras en la separacin mediante la asociadas en la optimizacin de la selectividad y las optimizaciones de
variacin de la longitud de columna y de la velocidad de flujo. La eleccin condicin de columna mencionadas en (1), (2) y (3) son estrategias
de la condicin de columna que se variar en la elucin del gradiente es, bsicas para mejorar cualquier estrategia de separacin, incluido el mapa
fundamentalmente, la misma que para la separacin isocrtica. En ambos de pptidos. Los mtodos descritos anteriormente se describen mejor en
casos, los valores ms altos de eficacia (N) pueden obtenerse a expensas los pasos a continuacin:
de tiempos de anlisis ms largos. Para las mejoras en la resolucin de
poca importancia, en las que es menos importante un aumento en el pasos del desarrollo de mtodos de mapa
tiempo de anlisis, es recomendable reducir la velocidad de flujo. Sin
embargo, cuando se necesita un aumento de resolucin mayor, de pptidos
normalmente es preferible aumentar la longitud de la columna. Si la 1. seleccionar las condiciones de gradiente iniciales: longitud de columna,
resolucin es mayor de la necesaria despus de optimizar la selectividad, composicin de fase mvil, velocidad de flujo, temperatura y deteccin.
esta resolucin excesiva puede cambiarse por un tiempo de anlisis ms La separacin inicial debe optimizarse para la retencin (k). Esto requiere
un gradiente que no sea demasiado brusco.
corto, mediante el aumento de la velocidad de flujo y/o la reduccin de la
longitud de columna. En la figura 10 se muestra un ejemplo de resolucin 2. ajustar el rango de gradiente. Esto se utiliza para minimizar el tiempo de
anlisis mediante la eliminacin del espacio desperdiciado al comienzo y
de mapa de pptidos mejorada para un digesto trptico de mioglobina, con
al final del cromatograma.
una longitud de columna aumentada de 150 mm a 250 mm. En esta
3. variar selectividad. Si se observan bandas solapadas o el tiempo de
comparacin, las condiciones y el tiempo del gradiente se mantuvieron
ejecucin es demasiado elevado, pueden probarse las opciones
constantes mientras se aumentaba la longitud de columna de 150 mm comentadas sobre ajustes de selectividad.
a 250 mm. Se aadi un recuadro rojo a las mismas reas de las tener en cuenta la forma del gradiente. Puede lograrse un espacio de
4.
separaciones para indicar la mejora de resolucin gracias a los 250 mm banda adicional mediante el uso de una forma de gradiente no lineal de
de longitud; as tambin se pusieron de manifiesto las ganancias en la modo opcional; as se mejora an ms la separacin.
capacidad de picos por unidad temporal. 5. ajustar condiciones de columna. Cuando el espacio de bandas y la
selectividad se optimicen, debe considerarse la variacin del tiempo de
anlisis y/o de la longitud de columna; as se mejora la resolucin y/o
la velocidad del anlisis.
20
Figura 11: mapa de pptidos optimizado de protena epo que proporciona un 100% de
cobertura de secuencia
mAU
300
250
200
150
100
50
0
0 5 10 15 20 25 30
x106
6.5
6
5.5
5 Figura 11: el cromatograma superior muestra una
4.5 separacin de mapa de pptidos de digesto de
4
3.5 EPO, completamente optimizada, realizada en una
3 columna de mapa de pptidos de 2,1 x 150 mm
2.5
2
AdvanceBio. El cromatograma inferior muestra
1.5 el anlisis cualitativo (con un extractor de
1 caractersticas moleculares) para la cobertura
0.5
0 de secuencias generada mediante un Q-TOF de
14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5 18 18.5 19 19.5 20 20.5 21 21.5 22 22.5 23 23.5 24 24.5 25 25.5 Agilent.
AssayMAP transforma los flujos de trabajo de digestin, limpieza y fraccionamiento para permitir
una precisin y un nmero de muestras analizadas antes imposibles de alcanzar:
Reproducibilidad mejorada gracias a que el error humano es menor: <5% de CV La solucin de preparacin de muestras de
pptidos AssayMAP se basa en la potente
Mayor nmero de muestras analizadas: hasta 384 muestras cada da combinacin de cromatografa miniaturizada y
de lecho compacto, la plataforma moderna de
Reduce significativamente el tiempo de preparacin manual, dejando a los cientficos libres para realizar manipulacin de lquidos Bravo y una interfaz de
tareas analticas usuario sencilla basada en aplicaciones; todo ello
crea un entorno de acceso abierto para usuarios
Desarrollo de mtodos ms rpido: la plataforma automatizada le permite optimizar mtodos con rapidez expertos e inexpertos y, adems, simplica los
ujos de trabajo de preparacin de muestras ms
difciles.
22
Consiga reproducibilidad del ujo de trabajo total con la solucin Agilent AssayMAP para
preparacin de muestras antes del anlisis de espectrometra de masas
La solucin de preparacin de muestras de pptidos AssayMAP se us para examinar la reproducibilidad. El % de CV se determin en 25 pptidos
para digerir 64 repeticiones de cada uno de los dos tipos de muestras: BSA dentro de cada muestra, como puede observarse en la tabla 1. Se muestran
en urea y HCL de guanidina. Las muestras se limpiaron con cartuchos de los diferentes intervalos de % de CV. Se ilustran las contribuciones de la
fase reversa AssayMAP y se analizaron con una columna de mapa de media total de % de CV. Para mostrar la reproducibilidad, el rea de pico
pptidos Agilent AdvanceBio, LC Agilent 1290 Infinity y espectrmetro de para pptidos representativos se muestra en la figura 12.
masas Q-TOF iFunnel Agilent 6550. El experimento se repiti en el da dos
lvnelteFaK, % de Cv = 1,3
rHpeYavsvllr, % de Cv = 2,5
rea de picos de pptidos (x107)
4
aeFvevtK, % de Cv = 1,8
HCl de guanidina
lvvstQtala, % de Cv = 2,5 25 pptidos urea (n=64, 62) (n=64, 64)
3
da 1 da 2 da 1 da 2
aWsvar, % de Cv = 3,3 % de CV de rea media de picos 3,3 3,7 2,3 2,6
pptidos con % de Cv<5 23 21 25 23
2
0 16 32 48 64 80 96 112 128 Pptidos con 5>% de CV<10 2 3 1
Pptidos con % de CV>10 1 1
Nmero de muestra (digestin de BSA con HCI de guanidina)
Figura 12: representaciones de dispersin que muestran el rea de picos de tabla 1: % de CV al da con diferentes intervalos de % de CV.
4 pptidos a lo largo de 2 das.
La preparacin de muestras AssayMAP llev unas cuatro horas diarias, El flujo de trabajo total de CV fue del <4%. El flujo de trabajo completo
con solo dos horas de actividad al da. La preparacin de muestras manual incluy el sistema de preparacin de muestras de pptidos AssayMAP,
para el mismo flujo de trabajo llevara unas ocho horas diarias, con cuatro una columna de mapa de pptidos Agilent AdvanceBio, el sistema LC 1290
horas de actividad al da. Infinity y un espectrmetro de masas Q-TOF iFunnel Agilent 6550.