Citologa de los microorganismos.

Preparacin del frotis y fijado. Tincin simple

Tincin diferencial: coloracin gramm, cidos alcohol

resistente.

Tincin negativa. Demostracin de los grnulos meta

cromticos.

INTRODUCCIN

La tincin diferencial requiere ms de un tipo de colorante y se utiliza para distinguir entre varios
tipos de clulas bacterianas. Una tincin diferencial tpicamente consiste de tres pasos
principales: primero un colorante primario, el cual se utiliza para teir a todas las clulas en la
tincin; enseguida un paso de decoloracin, el cual remueve el colorante solo de ciertos tipos
de clulas y finalmente un colorante de contraste, el cual tie las clulas recin decoloradas pero
no tiene efecto sobre las clulas que an retienen el colorante primario.

La tincin propuesta por el mdico dans Christian Gram en 1884, es una de las tinciones
diferenciales ms utilizadas en bacteriologa, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de
24 horas en Gram positivas y Gram negativas. La reaccin de la tincin de Gram se basa en la
cantidad de peptidoglucano que se encuentra en las paredes celulares de estas bacterias. Las
bacterias Gram positivas tienen muchas capas de peptidoglucano, las cuales a su vez, sostienen
molculas de cido teicoico.
El cido teicoico reacciona con el cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tincin.
Un complejo de las molculas cristal violeta-yodo-cido teicoico es muy difcil de remover. Como
la pared celular de las clulas Gram positivas retiene estos compuestos, es ms difcil decolorar
una clula Gram positiva que una Gram negativa. Una mezcla de alcohol remueve el cristal
violeta de la clula Gram negativa, pero no de la Gram positiva.
I. EXPERIMENTO N1: PREPARACION DE FROTIS Y FIJADO.
1. FUNDAMENTO TEORICO

II. EXPERIMENTO N2: TINCION SIMPLE

1. FUNDAMENTO TEORICO
La tincin simple se utiliza para destacar el microorganismo completo para que se vean las
formas y las estructuras celulares bsicas. En la que se usa un nico reactivo, que
preferentemente es de tipo bsico y contiene un cromgeno (compuesto que da color al
tinte) con carga positiva, ya que la pared celular de las bacterias posee componentes con
carga negativa que atraen y enlazan el cromgeno.
Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las clulas absorbern el
colorante y quedarn teidas del mismo color.
Por tanto, la tincin simple mejora la observacin de la clula completa. Se fija el espcimen,
se aade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso
de colorante y la preparacin ya est lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente
(sustancia qumica utilizada par intensificar la coloracin), hay que aadirlo justo antes del
colorante.
2. OBJETIVOS
Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo
a la tincin de Gram.
Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterizacin e
identificacin de las bacterias.
3. RESULTADOS

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Celulas con nucleos basfilos y citoplasma de azul palido.

Ademas bacterias pequeas de color azul

III. EXPERIMENTO N3: TINCION DIFERENCIAL- COLORACION GRAMM

1. FUNDAMENTO TEORICO

Si se desean observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias, resulta sumamente

til el utilizar las preparaciones fijas y teidas, debido a que estas permiten que las clulas
se visualicen de mejor manera y se puedan diferenciar las distintas especies por su
coloracin, este mtodo en particular se llama tincin diferencial o selectiva.
La morfologa de la bacteria es visible debido a que los colorantes utilizados en el proceso
tien la superficie permitiendo cambiar de color a las bacterias, esto ayuda a tener una
definicin clara al momento de observar en el microscopio ptico.
 PASOS METODOS RESULTADOS
GRAM (+) GRAM (-)
Colorante Violeta de Se tie de violeta Se tie de violeta
bsico genciana
Mordiente Lugol Permanece violeta Permanece
violeta
Decoloracin Alcohol de 95% o Permanece violeta Se decolora
alcohol acetona
Contraste Fucsnia o Permanece violeta Se tie de rojo
safranina

2. OBJETIVOS
Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo
a la tincin de Gram.
Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterizacin e
identificacin de las bacterias.

3. RESULTADOS

Corynebacterium Bacillus subtilis

es un bacilo, gram positivo, anaerobio facultativo. es una bacteria Gram positiva, Catalasa-positiva
IV. EXPERIMENTO N4: TINCION DIFERENCIAL- COLORACION PARA ACIDO ALCOHOL
RESISTENTE O COLORACIN ZIECHL NEELSEN.

Se llama as a la naturaleza cida del agente decolorante, el cual es ms

fuerte que la mezcla alcohol-acetona usada en el Gram. Estos
microorganismos resisten la decoloracin debido a las sustancias
lipdicas de su membrana. Ejemplo el M. tuberculosis, el M. leprae.

PASOS METODOS RESULTADOS

Acido No acido
Alcohol-resistente Alcohol-resistente
Colorante Fucsnia Se tie de rojo Se tie de rojo
bsico
Mordiente Calor Permanece rojo Permanece rojo

Decoloracin Alcohol - Permanece rojo Se decolora

Clorhdrico
Contraste Azul de Permanece rojo Se tie de Azul
Metileno

a. cido-alcohol resistencia:

Es la propiedad fsica de algunas bacterias a la resistencia a la

decoloracin de la fucsina bsica (rojo) la cual penetra en la clula por
accin del fenol y el calor.

Las bacterias cido-alcohol resistentes no pueden ser clasificados segn

la tincin de Gram, la cual es la tcnica ms comn en la microbiologa
contempornea, sin embargo puede ser teido con algunas tinciones
concentradas combinadas con calor. Una vez teida tiene la capacidad
de resistir la decoloracin de una combinacin de alcohol- cido, el cual
es el decolorante ms comn en los protocolos de tincin de bacterias,
de donde viene el nombre Alcohol-cido resistente.
2. RESULTADOS

Bacilo de Koch

Los bacilos aparecen de color rojo, ya que estos son cido-

alcohol resistente porque poseen lpidos en sus membranas,
y lo que se ti de azul fueron las partes No acido

V. EXPERIMENTO N5: DEMOSTRACION DE GRANULOS METACROMATICOS

1. FUNDAMENTACION TEORICA

Muchas bacterias, cuando crecen bajo determinadas condiciones de

cultivo, son capaces de acumular dentro del citoplasma depsitos de
materiales de reserva, que se denominan inclusiones. Los grnulos
metacromatico con un ejemplo de estas inclusiones; constituyen
acumulaciones de polisfosfato y se conocen tambin como grnulos de
colutina o cuerpos de Babes-Ernst.

Estos grnulos se denominan as, porque muestran un efecto

metacromatico; esto es, aparecen de color rojo o de diferentes tonos de
azul, cuando se tien con azul de metileno azul de toluidina. Son comunes
en corinebacterias, espirilos y bacilos lcticos y su por esencia se utiliza
en la identificacin de esas bacterias.
 2. RESULTADOS

El Corinebacterium diphteriae tiene

condensaciones de cromatina y estas vendran
a ser los granulos metacromaticos

VI. EXPERIMENTO N6: TINCION NEGATIVA

1. FUNDAMENTACION TEORICA

Ttincin negativa es una tcnica de microscopa que permite contrastar las muestras mediante
una sustancia opaca a los fotones (microscopa ptica) o a los electrones (microscopa
electrnica). En el primer caso, se emplea nigrosina o tinta china; para el caso de bacterias que
esporulan, esta tcnica permite visualizar las esporas como entes refringentes sobre un campo
de fondo oscuro.

En caso de microscopa electrnica de transmisin, se emplean sustancias de alto nmero

atmico que, por tanto, resultan opacas a los electrones transmitidos. Tpicamente, estas
sustancias son acetato de uranilo, citrato de plomo o molibdato de amonio.

Al electrnico, esta tcnica permite visualizar virus, flagelos, bacterias y otros entes de escaso
tamao.
2. RESULTADOS

Klebsiella neumoniae
presentar una cpsula que acta como un mecanismo
resfringente evitando que el colorante tia a la bacteria es
por eso que la tincin negativa tie el medio en el que se
encuentran estas bacterias.