NDICE

1. INTRODUCCIN

2. TINCIN
2.1. Definicin
2.2. Ventajas
2.3. Factores que la afectan

3. COLORANTES
3.1. Definicin
3.2. Clasificacin
3.3. Ventajas
3.4. Desventajas
4. TECNICAS DE COLORACIN O TINCIN
4.1 PREPARACIN DEL EXTENDIDO
4.2 FIJACIN
4.3 COLORACIN
4.3.1. Coloracin Simple
4.3.2. Coloracin compuesta
4.4 TINCIN DE GRAM
4.4.1. Bacterias Gram Positivas y Gram Negativas
4.4.2 Fundamento
4.4.2. Tcnica
4.4.3. Visualizacin de la morfologa bacteriana

5. VOCABULARIO

6. BIBLIOGRAFA
 INTRODUCCIN
La gran mayora de microorganismos son tan pequeos como para poder observarse a simple vista,
tal es el caso de los protozoos, algas, hongos, bacterias y virus.

La causa principal es que las bacterias son incoloras, tienen una ausencia de contraste entre la
clula y el medio que la rodea, en tal virtud para aumentar este contraste y estudiar la morfologa
bacteriana se lo puede ejecutar de dos maneras:

1) Por visualizacin de dichos microorganismos vivos sin teir, hecho que nos permite
tambin visualizar su movilidad.
2) Por visualizacin de los microorganismos teidos haciendo uso de colorantes con tal
concentracin que mata a la bacteria y es imposible observar sus movimientos, pese a esta
situacin se mejora la visualizacin de las estructuras de este microorganismo y se logra
detectar componentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares,
centros de actividad respiratoria, etc. acorde a la clase de tincin seleccionada.

Es por eso que esta tcnica es imprescindible en el estudio de la microbiologa para poder dar una
respuesta eficaz ante las interrogantes de la naturaleza de un microorganismo.

TINCIONES BACTERIOLGICAS
 DEFINICIN DE TINCIN
La tincin es una tcnica imprescindible que se constituye en el primer paso para el estudio
microbiolgico de las bacterias con la finalidad de conducir a la identificacin precisa de alguna
estructura.

Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, en un
proceso llamado fijacin. Aqu se procesan y fijan, generalmente por calor o qumicamente, las
estructuras sobre un portaobjetos para continuar inmediatamente con el proceso de tincin.

La fijacin origina normalmente el encogimiento de las clulas; en tanto que la tincin hace que las
clulas aparezcan mayores de lo que son realmente.

VENTAJAS DE LAS TCNICAS DE TINCIN

Proporcionar el necesario y preciso contraste a la clula.

Observar adecuadamente la morfologa del microorganismo.
Averiguar informacin complementaria de la estructura interna y/o externa.
Conocer las caractersticas tintoriales de una bacteria.

FACTORES QUE AFECTAN LAS TCNICAS DE TINCIN

Son muchos los factores que pueden alterar los resultados obtenidos en una tincin

Pureza del colorante.- Si existe mayor pureza hay mayor error y menor calidad en la tincin.

Concentracin.- A mayor concentracin mayor error y menor concentracin menor error.

El pH del colorante.- El pH har que el colorante se fije o no en las estructuras del microorganismo,
por lo tanto es un factor prioritario.

Conservacin del colorante.- Debe conservarse envasados y etiquetados en lugares frescos, secos
y oscuros.

Elaboracin.- Mediante soluciones acuosas o hidroalclicas a partir de polvo de colorante.

Tcnica empleada.- Se requiere ser cuidadoso en este proceso y seguir paso a paso las indicaciones
de las tcnicas.

Temperatura.- Se requiere de temperaturas altas para facilitar la penetracin del colorante.

Cantidad de muestra.- Debe ser homognea y ni tan pequea ni tan grande.

Realizar correctamente el frotis.- Para visualizar la muestra, sta se fija de manera previa con calor.
Soluciones mordientes.- Sustancias que sin capacidad tintorial actan como fijadores del colorante
en la estructura microbiana, por ejemplo la tincin de Gram, con el mordiente Lugol.

Tiempos de tincin.- La preparacin debe contemplar un tiempo preciso segn la tincin.

QU SON COLORANTES?
Un colorante es un cuerpo coloreado de naturaleza orgnica e inorgnica que comunica su color a
otro cuerpo. Es usado a manera de un exfoliante capaz de teir fibras vegetales y animales.

La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que presentan afinidad por los materiales
celulares.
La complejidad de su estructura molecular permite clasificarlos en:

SEGN SU ORIGEN:

Naturales.- Extrados de animales y sobre todo de plantas. Por ejemplo la hematoxilina (proviene
del tronco de una planta), el azul ndigo (del extracto de leguminosa o carmn de la cochinilla)

Sintticos o artificiales.- Obtenidos en su mayor parte del alquitrn de hulla. Por ejemplo el cristal
violeta, violeta de genciana, fucsina bsica, cido pcrico, azul de metileno.

SEGN SUS PROPIEDADES QUMICAS.

Acorde a su estructura fsico-qumica se acopla a la estructura que tie. Estn constituidos

especialmente por un anillo bencnico al que se adhieren diferentes radicales, de los cuales uno de
ellos ser coloreado y corresponder al radical cromforo. En consecuencia a mayor nmero de
radicales cromforos mayor ser el poder colorante de la solucin.

a) SALES COLORANTES.- cidos o aninicos, bsicos y neutros. Los ms usados son los cidos o
bsicos, cuya terminologa indica si la molcula puede ser aninica o catinica.

Los colorantes bsicos son cationes coloreados unidos a un anin incoloro. Tienen estructuras de
naturaleza acida como la cromatina nuclear. Ejemplo violeta de genciana, azul de metileno,
safranina, verde malaquita.

Los colorantes cidos tienen el catin incoloro unido a un anin coloreado. Tienen la clula
bacteriana uniformemente a menos que antes haya sido destruido el ARN del citoplasma.
Reaccionan con sustancias bsicas, como las estructuras citoplasmticas. Ejemplo: eosina, fucsina
acida y nigrosina.

b) COLORANTES LIPOSOLUBLES.- Se combinan con los compuestos lpidos de la clula. En ciertos

casos emplea mordientes para engrosar estructuras muy finas. Ej. Negro Sudn
VENTAJAS DE LOS COLORANTES

Posibilita la identificacin de clulas, bacterias u objetos microscpicos.

Tien de manera parcial, total o gradualmente las estructuras que integran los elementos
que se desea observar.

DESVENTAJAS DE LOS COLORANTES

Es difcil poder usar otro colorante sobre preparaciones que ya han sido teidas.

TIPOS DE COLORACIONES

DIRECTAS.- Se dan por inmersin en el bao colorante.

INDIRECTAS.- El colorante no puede actuar directamente, en consecuencia el objeto a colorear se

somete a tratamiento con otra sustancia llamada mordiente.

TCNICA PARA REALIZAR UNA PREPARACIN COLOREADA

1.- PREPARACIN DEL EXTENDIDO

Debe utilizar un portaobjetos limpio y desengrasado.

Si el cultivo es lquido se extiende hasta formar una pelcula fina que cubra el centro del
portaobjetos.
Si el cultivo procede de un medio slido se procede as:
Mediante la pipeta se coloca una gota de agua en el centro del portaobjetos.
Se quema el exceso de cultivo que queda en el ansa, se deja enfriar y se extiende la
suspensin bacteriana hasta formar la pelcula fina.
Se deja secar al aire o al aire caliente de la llama.

2.- FIJACIN

Se efecta para que los microorganismos queden adheridos al vidrio y no se desprendan de los
objetos con el lavado. Este proceso coagula las sustancias proteicas de las clulas, aqu no mueren
todas las bacterias.

Existen dos mtodos de fijacin:

Mtodo de Koch.- Consiste en pasar lentamente el preparado por la llama del mechero 3 veces
seguidas. En este procedimiento el microorganismo puede deformarse demasiado si hay un
calentamiento excesivo.

Fijacin qumica.- Se fundamenta en la coagulacin del protoplasma microbiano con sustancias

qumicas, y las clulas no sufren deformacin. Hay algunos mtodos:
Se inunda el preparado con alcohol metlico.

Se inunda el extendido con licor de Hoffman (etanol y ter sulfrico) hasta su evaporacin
completa.

3.- COLORACIN

En esta etapa actan las soluciones de colorantes sobre el preparado de acuerdo al mtodo de
tincin.

COLORACIONES SIMPLES

Entre sus caractersticas destacan:

Necesita una fijacin previa.

Ayuda a visualizar la morfologa bacteriana.
Hace uso de un solo colorante (cristal violeta, azul metileno, tinta china, Azul Metileno de
Loeffler, Azul de lactofenol).
Se puede clasificar en:

Tinciones simples con colorantes bsicos

Tinciones simples con colorantes cidos
Tinciones simples con colorantes neutros.

Puede ser positiva o negativa.

a) Coloracin positiva.- Desarrollada con colorantes bsicos.

Tcnica: se cubre el frotis una vez fijado con el colorante y se deja actuar. Luego se lava con agua y
se deja secar.

Con fucsina bsica.- se diluye 1/10 la solucin de fucsina fenicada y se deja actuar de 30 a 60
segundos.

Con violeta de genciana: se diluye 1/10 la solucin y se deja actuar de 30 a 60 segundos.

Con azul de metileno: Se usa para observar agrupamientos y morfologa de bacterias y levaduras,
que difieren desde el punto de vista qumico de su medio exterior y por eso se tien contrastando
con su alrededor.

Se cubre el preparado con la solucin en uso sin diluir y se deja actuar de 3 a 5 minutos. Es el ms
dbil de los tres en mencin por lo cual se emplea con mayor concentracin y durante un mayor
tiempo.

b) Coloracin negativa.- Contraria a las operaciones de tincin tradicional porque los

microorganismos quedan sin teir y se colorea el medio que los rodea y nicamente se
distingue el perfil de las clulas.
Esta coloracin aumenta el contraste de microorganismos en microscopia ptica, sin embargo su
verdadera utilidad se refleja en que permite observar sin dificultad cpsulas bacterianas, esporas
que de otra manera sera difcil evidenciarlas. Se emplea usualmente:

Tinta china: Es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares,
simplemente es utilizada para la observacin de esporas y para la tincin negativa con la cual se
observa la cpsula bacteriana. Es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en
la microscopia ptica.

Colorantes cidos: el ms usado es la nigrosina debido al contraste que le otorga su apariencia

negruzca.

COLORACIONES DIFERENCIALES

Como su nombre lo indica permite diferenciar entre grupos de bacterias que tienen distintas
propiedades tintoriales.

Presentan las siguientes caractersticas:

Requiere una fijacin previa por calor.

Emplea dos colorantes y el ltimo colorante es de contraste.
Permite diferenciar tipos bacterianos, estructuras externas, morfologa y otras
caractersticas.
Las ms utilizadas en microbiologa son de Gram y Ziehl-Neelsen.

TINCIN DE GRAM
Es uno de los mtodos de tincin ms importantes empleado en microbiologa para la visualizacin
de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Su utilidad prctica es innegable y en el trabajo
microscpico del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana
(cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se fundamentan precisamente en la tincin de GRAM.
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en
1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos: Gram-positivas y gramnegativos.
Las bacterias se dividen en dos grupos: Gram - o Gram +.

Estos dos grupos aportan dos ideas bsicas para la definicin "taxonmica" de las bacterias: el
color que adquieren tras la tincin y la forma que presentan las clulas bacterianas.
Adems las Gram - tienen una presin interior de 5 atmsferas y las Gram positivas estn sobre 25
atmsferas. Las Gram - tienen bombas de expulsin de antibiticos y puertas de entrada de
antibiticos, sin embargo dos de las bacterias ms resistentes a los antibiticos son Gram positivas,
Staphylococcus aureus y Enterococcus faecium, haciendo deducir que la resistencia a los
antibiticos no depende tanto del nmero de capas sino de la capacidad de la bacteria para
albergar genes de resistencia a los antibiticos.

BACTERIAS GRAM POSITIVAS

Aquellas bacterias que se tien de azul oscuro o violeta por la

tincin de Gram: de aqu el nombre de "Gram-positivas". Su
envoltura celular comprende la membrana citoplasmtica y una
pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglucano, que rodea a la anterior. La pared
celular se une a la membrana citoplasmtica mediante molculas de cido lipoteicoico. La capa de
peptidoglucano confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el
tinte durante la tincin de Gram, Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).

BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Las Bacterias Gram-Negativas presentan dos membranas lipdicas y entre

ellas se localiza un fina pared celular compuesta principalmente por
peptidoglucano. Estas bacterias se tien de Rosa.

Muchas especies de bacterias Gram-negativas causan enfermedades.

Los cocos Gram-negativos causan la gonorrea (Neisseria gonorrhoeae),
meningitis (Neisseria meningitidis) y sntomas respiratorios (Moraxella catarrhalis), entre otros. Los
bacilos Gram-negativos renen un gran nmero de especies. Algunos de ellos causan
principalmente enfermedades respiratorias (Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila),
enfermedades urinarias (Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens) y
enfermedades gastrointestinales (Salmonella enteritidis, Salmonella typhi).

FUNDAMENTO DE LA TINCIN DE GRAM

La afinidad Gram positiva o negativa depende de la composicin qumica de la pared celular en la

parte de su estructura fsica.

La mayor parte de las muestras sometidas a examen cuando se sospecha de infeccin bacteriana
deben ser extendidas en frotis sobre laminillas de vidrio, teidas y examinadas en un microscopio.

Despus de los primeros cuatro pasos, al observar al microscopio todo se ve violeta.

Luego del colorante algunas conservan su color mientras que otras se decoloran.

Las violetas son Gram positivas, las que pierden su color son Gram negativas, pues los decolorantes
orgnicos utilizados abren poros de la membrana externa de las bacterias Gram negativas
(principalmente de lipoprotenas y lipopolisacridos), permiten la salida del colorante principal; al
agregar el contracolor stos quedan rojos.

Los reactivos empleados son el cristal violeta (colorante bsico), lugol (mordiente), alcohol/cetona
(decolorante) y safranina (colorante de contraste)

TCNICA PARA LA TINCIN DE GRAM

1. Ya fijo el extendido cubrir la superficie con cristal violeta o con violeta de genciana
(colorante primario) por un minuto.
2. Escurrir y enjuagar
3. Cubrir con lugol (mordiente) durante 1 minuto.
4. Lavar con abundante agua.
5. Decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona hasta que deje de perder color.
6. Lavar con agua
7. Cubrir el preparado con fucsina bsica (contracolor)
8. Lavar con agua
9. Dejar secar el preparado al aire
10. Agregar una gota de aceite de inmersin y observar en el microscopio a 100X

RESULTADOS

Formas bsicas en que se puede visualizar la morfologa bacteriana en una tincin GRAM:

Cocos

Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular.

Diplococos, aparecen por pares.
Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas.
Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamao
Bacilos.- Grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

Espirales.- (Treponemas, Borrelias ...)

GRAM POSITIVO GRAM NEGATIVO

Cocos Cocos

R a c i m o s : Staphylococcus sp, como S. aureus Diplococos: forma usual de Neiseria

sp, como N.meningitidis tambin
Cadenas: forma tpica de Streptococcus sp, Moraxella sp y Acinetobacter sp
como S. pneumoniae, Streptococcus

Bacilos Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter

sp, p u e d e s e r G r a m - p o s i ti v o o
G r a m - n e g a ti v o

Gruesos: forma tpica de Bacilos

Clostridium sp, como C. perfringens, C. Bacilos fi nos: forma usual de
septicum enterobacteriaceae, como E. Coli

GLOSARIO
AGENTE DE COLORANTE.- Disolvente orgnico como el alcohol, un cido o alcohol acetona.

Colorante de contraste

COLORANTE PRINCIPAL O PRIMARIO.- Bsico que a las clulas cargadas negativamente las
colorea. El ms utilizado es el cristal violeta
CONTRACTOR O COLORANTE SECUNDARIO.- Colorante bsico de distinto color que el primer
colorante. Por ejemplo, la safrina

CROMFORO.- Se encuentran en una amplia variedad de molculas, y pueden funcionar de

maneras diferentes. Un cromforo aade color a una molcula debido a la naturaleza de los
tomos involucrados y la forma en que se enlazan entre s.

DECOLORANTE.- Es un polvo que en conjunto con el perxido se usa para quitar el color.

EXTENDIDO.- Se denomina as a la pelcula delgada del material contiene el microorganismo y se

extiende sobre el portaobjetos.

FROTIS.- Preparacin de una sustancia semislida o de un lquido espeso extendido sobre un

portaobjetos para poder ser visualizado al microscopio.

FUCSINA O SAFRANINA.- Colorante utilizado en microscopa derivado de la anilina en particular

el clorhidrato de rosanilida

LUGOL.- Producto se emplea frecuentemente como desinfectante y antisptico, para la

desinfeccin de agua en emergencias y como un reactivo para la prueba del yodo en anlisis
mdicos y de laboratorio.

MORDIENTE.- Permite al colorante actual con ms intensidad y que se fije a las clulas (sales
metlicas, solucin yodada o lugol, tanino y fenol).

PROTOPLASMA.- Es el material viviente de las clulas que constituye todo su interior, es decir el
citoplasma ms el ncleo.

SOLUCIONES MORDIENTES.- Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante de las
clulas. Los mordientes usados suelen ser sales metlicas, cidos o bases.

BIBLIOGRAFA
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