Abstrak

Isoflavonoid yang berasal dari flavonone menengah, naringenin, yang ubiquitously hadir dalam
tanaman, dan memainkan peran penting dalam pengembangan tanaman dan respon pertahanan.
Isoflavonoid disekresikan oleh kacang-kacangan juga memainkan peran penting dalam
mempromosikan pembentukan nodul nitrogen oleh rhizobia simbiosis. Dalam tanaman ini,
enzim kunci yang mengarahkan intermediet jalur fenilpropanoid dari flavonoid untuk
isoflavonoid adalah sitokrom P450 mono-oksigenase, isoflavon sintase. Dalam upaya untuk
mengembangkan varietas padi yang memiliki kemampuan untuk menginduksi nodulasi
(mengangguk) gen di rhizobia, gen IFS dari kedelai dimasukkan ke dalam beras (Oryza sativa L.
cv. Murasaki R86) di bawah kontrol promotor 35S. Kehadiran IFS beras transgenik dikonfirmasi
dengan PCR dan analisis Southern blot. Analisis garis transgenik 35S-IFS menunjukkan bahwa
ekspresi gen IFS menyebabkan produksi genistein isoflavon dalam jaringan padi. Hasil ini
menunjukkan bahwa enzim gen-menyatakan IFS kedelai aktif dalam tanaman padi R86, dan
bahwa antara naringenin dari jalur antosianin tersedia sebagai substrat untuk enzim asing
diperkenalkan. The genistein diproduksi dalam sel beras hadir dalam bentuk glikosida,
menunjukkan bahwa glycosyltransferases endogen yang mampu mengenali genistein sebagai
substrat. Studi dengan rhizobia menunjukkan bahwa ekspresi isoflavon sintase menganugerahkan
tanaman padi dengan kemampuan untuk menghasilkan flavonoid yang mampu menginduksi
ekspresi gen mengangguk, meskipun derajat bervariasi, di rhizobia yang berbeda.

Substrat untuk memproduksi genistein isoflavon adalah naringenin, perantara di cabang dari jalur
fenilpropanoid yang mengarah ke sintesis flavonoid, yang meliputi flavanon, flavon, flavonol,
proanthocyanidins, dan antosianin. Naringenin adalah produk dari enzim chalcone synthase dan
chalcone isomerase yang umum untuk kebanyakan tanaman (Gambar. 1). Kacang-kacangan
memiliki enzim yang unik yang melakukan aril migrasi dari B-cincin ke 3-posisi naringenin,
membuka jalan bagi produksi isoflavon (KOCHS dan Grisebach, 1986). enzim kunci ini yang
mengarahkan phenylpropanoid intermediet jalur-flavonone ke isoflavonoid adalah sitokrom
P450 mono-oksigenase, isoflavon sintase. Dalam kebanyakan tanaman selain kacang-kacangan,
isoflavon tidak di antara kompleks berbagai metabolit sekunder disintesis oleh jalur
fenilpropanoid. Perbedaan ini disebabkan tidak adanya isoflavon sintase, yang mengubah
naringenin menjadi isoflavon. Identifikasi gen encoding isoflavon synthase (Akashi et al, 1999;.
Steele et al, 1999;.. Jung et al, 2000) memungkinkan pengenalan isoflavon mensintesis kapasitas
dalam Arabidopsis dan tembakau, dan jagung kultur sel BMS yang melakukan tidak secara alami
memproduksi isoflavon (Jung et al, 2000;.. Yu et al, 2000;. Liu et al, 2002). Studi ini
menunjukkan bahwa isoflavon genistein dapat disintesis di Arabidopsis dan tembakau, sehingga
membuktikan bahwa naringenin substrat hadir dalam tanaman antosianin yang memproduksi ini
tersedia untuk isoflavon sintase untuk mengkonversi ke genistein.

Beras adalah salah satu tanaman serealia yang paling penting di dunia, dan baru-baru banyak
usaha telah diarahkan mengurangi masukan nitrogen dari pupuk kimia dan menyediakan
nitrogen untuk padi oleh fiksasi nitrogen biologis (Ladha dan Reddy, 2000, 2003). Menuju
tujuan ini, penelitian telah berfokus pada bagaimana mendorong interaksi beras dengan rhizobia
dalam rangka untuk mengembangkan hubungan simbiosis stabil (Reddy et al, 1997, 2000a, b;..
Sreevidya et al, 2005). Beras ditunjukkan ke pelabuhan setidaknya parsial membuat genetik
dalam genom untuk berinteraksi dengan rhizobia (Reddy et al., 2000b, 2002). Namun, varietas
padi memiliki kapasitas yang sangat rendah untuk menginduksi gen mengangguk rhizobia,
mungkin karena kurangnya kemampuan untuk mensintesis mengangguk gen-inducing flavonoid
(Reddy et al, 2000b;.. Rolfe et al, 2000). Oleh karena itu, produksi isoflavon dapat membuka
jalan bagi tanaman padi untuk masuk ke dalam hubungan simbiosis dengan rhizobia. Karena
sekresi dari flavonoid adalah langkah pertama dalam interaksi legume-Rhizobium, dan beras
tidak memiliki jalur untuk menghasilkan isoflavon dari flavanon seperti naringenin, dalam
penelitian ini tujuannya adalah untuk mentransfer enzim kunci, isoflavon sintase untuk produksi
isoflavonoid beras, dan untuk menentukan kemampuannya untuk mensintesis genistein
isoflavonoid, dan untuk menginduksi gen mengangguk rhizobia. Dalam penelitian ini, berbagai
beras berpigmen (Oryza sativa L. cv. Murasaki R86) yang digunakan yang menghasilkan
antosianin pada daun, batang, dan kulit biji (Nakai et al., 1998). Setiap tanaman yang dapat
menghasilkan anthocynins harus memiliki kemampuan untuk menghasilkan naringenin, substrat
untuk isoflavon sintase untuk produksi genistein (Gbr. 1).
BAHAN DAN METODE

Strain Rhizobial
Strain rhizobial, Rhizobium NGR234, A. caulinodans ORS571, R. meliloti 1021, dan B.
japonicum USDA110 fusi menyimpan mengangguk :: lacZ, yang digunakan dalam penelitian ini
tercantum dalam Tabel 1, dan akan disebut dalam teks sebagai NGR234, ORS571, Rm1021, dan
USDA110, masing-masing. The Rhizobium dan Bradyrhizobium strain secara rutin tumbuh di
bawah kondisi aerobik dalam gelap pada suhu 30 C dalam ragi mannitol (YM) kaldu atau
piring agar-agar (Vincent, 1970), dilengkapi dengan antibiotik yang tepat, jika diperlukan.

KONSTRUKSI VEKTOR TRANSFORMASI TANAMAN

Transformasi vektor biner pMSH2-cyp93C1 (Gambar 2A.) Yang mengandung kedelai isoflavon
gen synthase (IFS; cyp93C1v1) di bawah kendali CaMV 35S promoter dan gen nopaline
synthase (nos) terminator dibangun oleh ligasi 1,8 kb SPEI / XbaI fragmen dari cyp93C1v1
cDNA, yang berasal dari pCR2.1 / cyp93C1v1 (Siminszky et al., 1999), hilir promotor CaMV
35S dalam SPEI / XbaI dibatasi vektor biner pMSH2 (Kawasaki et al., 1999), dalam orientasi
akal.

TRANSFORMASI PADI DAN KONDISI PERTUMBUHAN

vektor biner digunakan untuk transformasi padi, pVM200 (turunan dari pMSH kurang promotor
CaMV 35S di situs kloning beberapa; vektor kontrol) atau pMSH2-cyp93C1 (35S-IFS),
diperkenalkan ke Agrobacterium tumefaciens EHA105 oleh elektroporasi (Nagel et al ., 1990).
transformasi Agrobacterium-dimediasi beras (Oryza sativa L. cv. Murasaki R86) kalus dilakukan
menurut Sreevidya et al. (2005). Tanaman regenerasi dari kalus berubah dipilih oleh resistensi
higromisin. Sepenuhnya planlet regenerasi diaklimatisasi hidroponik dalam larutan hara Yoshida
(Yoshida et al., 1976) untuk 15 d dan kemudian tanaman transgenik putatif (generasi T0)
dipindahkan ke tanah dalam pot dan ditanam di rumah kaca penahanan transgenik.
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR), DAN SELATAN DAN ANALISIS UTARA
BLOT

Genomik DNA dibuat dari daun padi muda menggunakan prosedur yang dikembangkan oleh
Dellaporta et al. (1983) untuk analisis Southern, dan dengan metode CTAB (Taylor et al., 1993)
untuk analisis PCR.

Untuk PCR analisis ~ 5 ng DNA genom digunakan sebagai template. Primer, yang dirancang
untuk menghasilkan seluruh urutan coding dari IFS, yang digunakan pada konsentrasi 10 pM
dalam campuran reaksi 20 ml mengandung 0,2 mM setiap dNTP, 2 mM MgCl2, 2 U Taq DNA
polymerase dalam buffer PCR, dan PCR dilakukan pada Biometra Uno-thermocycler (Biometra,
Gttingen, Jerman). Maju dan mundur primer yang 5'-ATG TTG CTT GAA CTT GCA CT-3
'dan 5'-TTA AGA AAG GAG TTT AGA TG-3', masing-masing, dan amplifikasi dilakukan
dengan siklus awal 3 menit pada 94 C, diikuti dengan 30 siklus 30 s pada 94 C, 45 s pada 53
C, dan 1,5 menit pada 72 C, dan siklus akhir tunggal 10 menit pada 72 C. Setelah selesai
PCR, sampel dipisahkan pada 0,8% (wt / vol) agarose gel, diwarnai dengan etidium bromida dan
divisualisasikan pada transilluminator UV.

Untuk aliquot analisis Southern dari 10 ug DNA genomik dimurnikan dicerna dengan XbaI,
ukuran-difraksinasi pada 0,8% (b / v) gel agarosa, alkali ditransfer ke Hybond-N nilon membran
+ (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Inggris), dan hibridisasi semalam di 42 C untuk
digoksigenin-11-dUTP berlabel PCR fragmen dari urutan coding dari IFS. DNA Probe persiapan
menggunakan primer acak, hibridisasi dan keketatan pencucian membran, dan deteksi
chemiluminescent band dengan anti-DIG-AP dan CSPD dilakukan menggunakan DIG-tinggi
Perdana DNA Pelabelan dan Deteksi Kit II sesuai instruksi pabrik (Roche Applied Science,
Mannheim, Jerman). Bercak terkena X-ray film (Kodak, Rochester, NY, USA) selama 1-2 jam.

Untuk analisis utara, total RNA diisolasi dari daun padi muda dengan ekstraksi guanidin
isothiocyanate sesuai petunjuk pabrik (Trizol reagen; Gibco-BRL, Grand Island, NY). RNA total
(~ 20 mg) menjadi sasaran denaturasi elektroforesis gel agarosa dan dihapuskan ke + membran
Hybond-N (Amersham) menggunakan metode standar (Sambrook et al., 1989). Membran
hibridisasi dengan DIG-berlabel IFS probe dan diproses seperti dijelaskan di atas.

ISOFLAVON AKTIVITAS SINTASE ASSAY

Untuk tes synthase Isoflavon, larut dan protein membran pecahan dari kontrol dan tanaman padi
transgenik 35S-IFS disusun sebagai berikut. jaringan akar / daun (1 g berat segar) tanaman padi 2
bulan-tua dibekukan dengan nitrogen cair, tanah sampai menjadi bubuk halus, dan homogen
dalam 10 ml buffer ekstraksi (50 mM Tris-HCl, pH 8,2, 0,4 M sukrosa , 2 mM EDTA, 0,5 mM
DTT, 0,3 mM mercaptoethanol, dan 10% gliserol). The homogenates disentrifugasi pada 5000
rpm (5 K) selama 10 menit pada 4 C. Pelet dibuang, dan supernatan (ditunjuk sebagai
homogenates mentah, yang mengandung fraksi baik larut dan membran) dikumpulkan dan
disimpan pada -80 C sampai digunakan lebih lanjut. Sebagian dari supernatan disentrifugasi
lagi pada 15 000 rpm (15 K) selama 60 menit pada 4 C setelah menambahkan gliserol untuk
konsentrasi akhir 20%. pelet yang dihasilkan (mikrosomal mentah fraksi) dan supernatannya
diambil dan disimpan pada -80 C sampai digunakan lebih lanjut. Isi protein dari 5 K dan 15 K
persiapan ditentukan dengan menggunakan protein microassay Bradford (Bio-Rad, Hercules,
CA, USA), dan aktivitas isoflavon sintase tes dilakukan menurut Yu et al. (2000). Sekitar 150
mg dari fraksi protein di atas diinkubasi selama 12 jam pada suhu kamar dalam campuran reaksi
yang mengandung 80 mM K2HPO4, 0,5 mM glutathione, 20% sukrosa, pH 8,0, dengan 100 pM
naringenin atau 100 pM liquiritigenin substrat dan 0,4 mM NADPH . Setelah inkubasi, reaksi
diekstraksi dengan metanol. Sampel menguap dan diresuspensi dalam 80% metanol, dan
kemudian dipisahkan pada sistem HPLC seperti dijelaskan di atas.

PENGUKURAN AKTIVITAS MENGANGGUK GEN-INDUCING

ekstrak metanol dibuat dari jaringan padi transgenik untransformed atau vektor diubah tanaman
kontrol, dan 35S-IFS, dan eluen diperoleh setelah pemisahan HPLC dari ekstrak metanol dinilai
karena kemampuan mereka untuk menginduksi ekspresi gen mengangguk rhizobia menyimpan
fusi mengangguk :: lacZ (Tabel 1) sebagai berikut. Bakteri ditumbuhkan semalam untuk fase
pertengahan log dan diencerkan ke OD600 0,2 di 2 ml media YM yang mengandung 50 ml
ekstrak jaringan beras atau eluen diperoleh setelah pemisahan HPLC, bersama dengan antibiotik
yang tepat. Semua ekstrak diencerkan di 0,01 mg ml-1, dalam 2 ml budaya. Setelah semalam
gemetar selama 16 jam pada 30 C, budaya yang diuji untuk aktivitas -galaktosidase
(diungkapkan oleh anggukan :: lacZ gen fusi) sesuai dengan metode Miller (1972) pada suhu 37
C dengan o- nitrophenyl--D-galactopyranoside (ONPG) atau klorofenol merah--D-
galactopyranoside (CRPG) sebagai substrat. The OD420 (ONPG), OD574 (CRPG). dan OD600
(sel bakteri) pembacaan diperoleh dengan menggunakan spektrofotometer (DU800, Beckman,
USA). Semua tes dengan ekstrak dilakukan setidaknya empat kali, dan berarti dan standard error
dari titik data dihitung dengan menggunakan program Microsoft Excel, dengan kontrol yang
tepat dalam setiap percobaan. Data yang diperoleh dengan tes induksi gen mengangguk menjadi
sasaran uji t Student untuk menggambarkan pentingnya perbedaan dalam kegiatan -
galaktosidase menimbulkan di rhizobia dalam menanggapi ekstrak tanaman dari tanaman 35S-
IFS dibandingkan tanaman padi pengendalian vektor-berubah. ambang batas signifikansi
disesuaikan untuk beberapa perbandingan dengan koreksi Bonferroni. Dikoreksi P-nilai
kemudian dihitung sesuai dengan ukuran sampel. Koreksi Bonferroni untuk beberapa
perbandingan diterapkan untuk meningkatkan tingkat keketatan sementara menentukan
signifikansi perbedaan antara kelompok dibandingkan dengan uji t. Dengan demikian, uji
signifikansi dilakukan adalah pada dua sisi tingkat alpha (tingkat signifikansi) yang sangat ketat
0,01.

-galaktosidase tes rhizobia dilakukan dengan metanol tepat diencerkan (pelarut yang digunakan
untuk pengenceran ekstrak) menjabat sebagai kontrol negatif, dan tes dengan flavonoid otentik
(100 M) apigenin, 7,4-dihydroxyflavone, daidzein, genistein, liquiritigenin, luteolin, dan
naringenin menjabat sebagai kontrol positif.