JOURNAL READING

A Matured Fruit Extract of Date Palm Tree (Phoenix dactylifera L.)

Stimulates the Cellular Immune System in Mice

Diajukan untuk Memenuhi Tugas Kepaniteraan Klinik dan Melengkapi Salah Satu Syarat
Menempuh Program Pendidikan Profesi Dokter
Bagian Ilmu Kesehatan Telinga Hidung Tenggorok Kepala Leher RSI Sultan Agung
Semarang

Disusun oleh :
Rahmayuni Fitrianti
30101206722

Pembimbing :
Dr. Hj. Andriana Tjitria W. W. S., Sp.THT-KL, MSi. Med

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS ISLAM SULTAN AGUNG SEMARANG
RSI SULTAN AGUNG SEMARANG
2017
Efek Ekstrak Buah Kurma Matang (Phoenix dactylifera L.) Dalam Menstimulasi Sistem
Imun Seluler pada Mencit
Koji Karasawa, Yuji Uzuhashi, Mitsuru Hirota, and Hajime Otani*

ABSTRAK
Efek imunomodulator dari ekstrak dalam air panas buah kurma matang (Phoenix dactylifera
L.) diteliti dalam perbandingan pada buah plum dan buah ara pada mencit. Jumlah sel IFN-
+CD4, IFN-+CD49b and IL-12+CD11b tertinggi terdapat pada mencit yang diberikan diet
yang ditambahkan ekstrak kurma. Polifenol teridentifikasi pada ekstrak kurma, seperti asam
klorogenik, asam cafein, pelargonin dan asam ferulik, menstimulasi ekspresi IFN-+mRNA
secara signifikan pada kultur sel Peyers patch pada mencit. Asam klorogenik dan asam
cafein juga meningkatkan jumlah sel IFN- CD4 secara signifikan, ketika beberapa polifenol
meningkatkan jumlah dari sel IFN- CD49b dan IL-12 CD11b secara signifikan. Dengan
kata lain, 70% ekstrak kurma yang tidak larut ethanol diberikan dengan tripsin meningkatkan
jumlah dari sel IFN- CD49b dan IL-12 secara signifikan. Hasil ini mengindikasikan bahwa
beberapa polifenol dan polisakarida terdapat di buah kurma dan menstimulasi sistem imun
seluler pada mencit.
KATA KUNCI : buah kurma, stimulasi imun, sistem imun seluler, mencit, Peyers patch

PENDAHULUAN
Buah dari pohon kurma (Phoenix dactylifera L.) telah dikembang biakkan di Afrika
Utara untuk kurang lebih 3.500 tahun,1 dan kultivasinya telah menyebar sampai ke Timur
Tengah, bagian Tengah dan Selatan Amerika, dan Eropa Selatan.2,3 Untuk orang-orang Timur
Tengah, buah kurma dianggap sebagai makanan yang ideal karena tingginya kadar gula dan
sumber serat yang baik, mineral dan nutrisi lainnya juga.4 Buah kurma juga digunakan
sebagai obat-obatan tradisional untuk menghindari berbagai penyakit infeksi karena
kemampuan anti-bakteria 5 dan anti-fungal nya.6
Disamping itu, buah plum (Prunus domestica) dan ara (Ficus carica) lebih umum
ditemukan di Jepang. Plum berasal dari daerah Kaukasian di Asia Barat,7 dan buah ini saat ini
8
dikembang biakkan besar-besaran di Pakistan,India, dan Eropa Timur.9 Buah plum telah
digunnakan secara medis di India untuk pengobatan leukorea, menstruasi tidak teratur,dan
keguguran. 10
Miripnya, buah ara digunakan secara luas di daerah Mediterranean Eropa Timur.11
Afrika, dan Asia Selatan.12 Buah ara juga secara tradisional digunakan sebagai remedy
respiratorik dan anti-spasmodik.13 Buah kurma, buah plum dan buah ara umumnya
dikonsumsi tidak hanya sebagai buah segar tetapi juga dikeringkan dan makanan obat
tradisional, dan memiliki fungsi berpotensi untuk menyembuhkan penyakit yang
berhubungan dengan gaya hidup.2,14,15 Imunitas dapat dibagi menadi dua kelompok: innate
dan adaptif. Pendahulunya merepresentasikan lini pertama dari pertahanan tubuh terhadap
serangan pathogen,dan dimediasi oleh factor humoral seperti protein anti-mikrobial dan
leukosit seperti makrofag, sel dendritic (DC) dan sel natural killer (NK). Bentuk distinctivbe
dari imunitas innate adalah untuk fungsi cepat efektor melalui reseptor germline-encoded
terbatas. Maka dari itu, imun adaptif berkembang nanti tetapi secara klonal mengekspresikan
berbagai macam reseptor antigen yang diproduksi oleh daerah rekombinasi somatic
spesifik.
Komponen dominan dari buah kurma, plum dan ara kering adalah gula, polisakarida
seperti pectin dan -glucan, dam polifenol. Pektin dilaporkan memiliki efek imunomodulator
tertentu, termasuk perlindungan terhadap infeksi Streptococcus pada mencit16 dan upregulasi
dari interleukin (IL)-1 dan interferon (IFN)- pada mencit,17 sedangkan -glucan
mendemonstrasikan perlindungan terhadap infekis bakteri dan protozoa pada hewan uji
coba.18,19 Lebih dari itu, intake tinggi dari kokoa, yang kaya akan polifenol, di laporkan dapat
meningkatkan respon Th1 dan untuk menurunkan respon antibody pada mencit.20 Akan
tetapi, hanya ada beberapa laporan pada aktivitas imunomodulator buah kurma, plum, dan ara
kering. Maka dari itu, studi ini meneliti efek imunnomodulator dari ekstrak air panas dari
buah matang pohon kurma dalam perbandingannya dengan ekstrak buah plum dan ara pada
mencit. Lebih dari itu, studi ini mengevaluasi apakah beberapa polifenol yang ditemukan di
ekstrak kurma menstimulasi system imun seluler pada mencit.

METODE DAN BAHAN

Bahan, Pikoeritrin (PE) yang dilabel dengan anti-mouse IL-4 antibodi monoclonal
(mAb, clone 11B11), PE yang dilabel dengan anti-mouse IFN-mAb (clone XMG1.2), PE
yang dilabel dengan anti-mouse IL-12 IL-23/p40 mAb (clone C15.6), biotin yang dilabel
dengan anti-mouse CD4 mAb (clone RM45), biotin yang dilabel dengan anti-mouse CD49b
mAb (clone DX5), biotin yang dilabel dengan anti-mouse CD11b mAb (clone M1/70), dan
phycoerythrin/cyanine5 (PE/Cy5)-yang dilabel dengan streptavidin didapatkan dari
BioLegend (San Diego, CA).
Brefeldin A (BFA), ionomycin, streptomycin, dan phorbol 12-myristate 13-acetate
(PMA) dibeli dari Industri Kimia Murni Wako (Osaka, Japan). IntraPrep dibeli dari Beckman
Coulter (Marseille, France). Defined fetal bovine serum (FBS) didapatkan dari Laboratorium
HyClone (Logan, UT). Penicillin didapatkan dari Biomedika MP (CostaMesa, CA). Roswell
Park Memorial Institute (RPMI)-1640 dibeli dari Farmasi Nissui (Tokyo, Japan) Reagen
TRIzol dNTP, dan M-MLV reverse transcriptase dibeli dari Teknologi Hidup Invitrogen
(Carlsbad, CA). Two aliquots of SYBR Plumix Ex Taq mixture were obtained from Takara
Bio (Shiga, Japan). Asam protokat ekuik, pelargonin, asam kafein, asam ferulik, dan asam
klorogenik dibeli dari Funakoshi Co., Ltd. (Tokyo, Japan), dan asam siringik didapatkan
dari Industri Kimia Murni Wako. Perlengkapan labeling ABEE dibeli dari J-Oil Mills, Inc.
(Tokyo, Japan). Seluruh bahan kimia yang digunakan dalam studi ini merupakan derajat
analisis tertinggi yang tersedia secara komersil.

Tabel 1. Komposisi Diet

Persiapan Ekstrak Buah. Buah kurma yang dikeringkan dipanen di Uni Emirat Arab
(UAE) didapatkan dari Perusahaan Marubeni (Tokyo, Japan). Buah plum dan ara kering
dibeli dari Perusahaan Makanan Shoei (Tokyo, Japan). Setiap buah kering (1.000 g)
dipotong menjadi sekitar 5x5 mm potong, termasuk kulit dan daging buah tanpa biji, dan
direbus di dalam 9.000 ml air panas steril (DW) selama 2 jam dibawah reflux. Supernatan
dikumpulkan dengan sentrifugasi (5.000 g, 30 menit) dan ekstrak buah kurma, plum, dan ara
yang dikeringkan lalu dibekukan. Berat dari esktrak kurma, plum dan ara adalah 675 g, 593
g, dan 525 g masing-masingnya.
 Fraksinasi Ekstrak Kurma dan Plum. Ekstrak kurma (675 g) dan plum (593 g)
dilarutkan kedalam 2.500 mL DW, diletakkan di tabung dialisa Spectra/Por CE sebesar berat
molekul potongan 100x500 (MWCO) (Laboratorium Spectrum, Inc., Rancho Dominguez,
CA), dan di dialysis selama 16 jam pada suhu 15oC against Dw. Ultrafiltrasi dilakukan
berdasarkan prosedur yang dijelaskan oleh Segura Campos et al.21
Retentat pada tabung dialisa berhasil di ultrafiltrasikan dengan empat membrane
MWCO: 1,000 (YM-1), 5,000 (PLCC), 10,000 (PLGC), dan 30,000 (YM-30) Da (Millipore,
Billerica, MA) dengan artian sel ultrafiltrasi yang telah diaduk (model 8200; Amicon,
Danvers, MA). Kelima fraksi yang telah di ultrafiltrasi di masukkan kedalam 10 mL DEW
dan dikeringkan, dan didesain sebagai fraksi dengan massa molekul lebih dari 30,000 Da
(30,000 Da retentate); dari 10,000 Da ke 30,000 Da (30,000 Da permeate 10,000 Da
retentate); dari 5,000 Da ke 10,000 Da (10,000 Da permeate5,000 Da retentate); dari 1,000
Da ke 5,000 Da (5,000 Da permeate1,000 Da retentate); dan dari 500 Da ke 1,000 Da (1,000
Da permeate). Hasil dari setiap fraksi adalah 1.91 g, 1.48 g, 0.14 g, 0.59 g, dan 1.80 g untuk
ekstrak kurma, dan 1.10 g, 0.20 g, 0.03 g, 0.12 g, dan 2.96 g untuk ekstrak plum, masing-
masingnya. Lalu, fraksi dengan berat molekul lebih dari 30,000 Da (0.5 g) dicampurkan
kedalam 20 mL dari 0.05 M buffer sodium fosfat (pH 7.2), dengan tambahan sulfat amoniak
pada konsentrasi saturasi 70%, dan diinkubasi pada 4oC selama 16 jam. Sampel lalu di
sentrifugfasi (20000g, 30 menit), dan endapan dicampur kedalam 20 mL buffer diatas,
diletakkan ke dalam tabung dialisa Spectra/Por CE 100x500 MWCO, dan didialisa selama 16
jam pada suhu 15oC berlawanan dengan buffer. Rententat kemudian dikering-bekukan
sebagai endapan pada saturasi sulfat amoniak 70%. Hasilnya adalah 0.14 g. Miripnya, fraksi
dengan berat molekul lebih dari 30,000 Da (0.5 g) dicampurkan kedalam 20 mL dari 0.05 M
buffer sodium fosfat (pH 7.6), dengan tambahan tripsin pada konsentrasi 0.01% (w/w), dan
diinkubasi pada suhu 25oC selama 16 jam. Reaksi dihentikan dengan tambahan etanol pada
konsentrasi 70%, dan di inkubasi pada suhu 45oC selama 1 jam, Lalu di sentrifugasi (5000g,
20 menit). Endapan kemudian di kering-bekukan sebagai endapan pada 70% etanol.
Hasilnya adalah 0.31 g.
Pemberian Oral. Mencit jantan berusia 5 minggu C3H/HeN didapatkan dari Japan
23
SLC, Inc. (Shizuoka, Japan) dan dikandang pada ( 2oC dibawah standar selama 12 jam
siklus terang-gelap. Setelah dikembang biakkan dahulu selama 1 minggu, mencit dibagi
menjadi 4 kelompok dimana mereka diberikan diet standar hewan pengerat AIN-93 M (Clea
Japan, Tokyo, Japan) sebagai diet bebas ekstrak (control), 10% diet yang ditambahkan
ekstrak kurma, 10% diet yang ditambahkan ekstrak plum, dan 10% diet yang ditambahkan
ekstrak ara. Jumlah gula dan protein dari diet yang ditambahkan ekstrak buah-buahan sesuai
dengan diet control. Komposisi detail dari setiap diet ditunjukkan pada Tabel 1. Air diberikan
ad libitum dari botol minuman.
Setiap kelompok terdiri dari 5 mencit, dan mereka dikembang biakkan selama 30
hari. Setelah berkembang biak, limfa dan Peyers patch dikumpulkan untuk diteliti fungsi
selnya. Seluruh hewan uji coba yang digunakan pada studi ini di perlakukan sesuai dengan
panduan Regulasi dari Hewan Uji Coba di Universitas Shinshu ddan berdasarkan Hukum No.
105 dan Pemberitahuan No.6 dari Pemerintah Jepang.
Peyers Patch dan suspense sel limfa, dan kultur sel. Peyers patch dan suspense
sel limfa disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya.22 Ekstrak kurma dan plum yang telah
difraksi dicampur kedalam phosphate-buffered saline (PBS) dan ditambahkan kedalam
medium dalam konsentrasi akhir 50 atau 100g/mL. Polifenol standar individu dicampur ke
sulfoksida dimetil (DMSO) dan ditambahkan kedalam medium pada konsentrasi akhir
sebesar 4 nmol/mL. Konsentrasi akhir dari DMSO adalah 0.01% dan dipastikan tidak
memiliki sitotoksisitas. Sel di kultur pada suhu 37oC dengan kelembapan inkubator 5%
CO2selama 48 jam (untuk analisis fungsi sel) atau 24 jam (untuk analisis ekspresi mRNA).
Analisis Fungsi Sel. Marker permukaan sel dan sitokin intraseluler dilabeli
berdasarkan prosedur yang telah dijelaskan sebelumnya.22 Nomor sel dipastikan
menggunakan analiser fungsi sel personal Guava (Guava PCA, Guava Technologies,
Hayward, CA).
Persiapan dari RNA total dan Real-Time Reverse Transcription (RT)
Polymerase Chain Reaction (PCR). RNA total dari sel Peyers patch diekstraksi seperti
yang dijelaskan sebelumnya.22 Real-time RT-PCR dilakukan menggunakan sebuah system
Thermal Cycler Dice Real Time TP800 (Takara Bio) menggunakan 2xSYBR Plumix Ex Taq
campuran. Urutan utama untuk amplifikasi IFN- dilaporkan oleh Mizutani et al.23
Urutan utama dari glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) dilaporkan
oleh Tobita et al.24 Reaksi realtime RT-PCR melibatkan 40 siklus dari 95oC selama 5 detik
dan 60oC selama 30 detik. Jumlah relative dari IFN- mRNA dinormalisasi menggunakan
ekspresi dari GAPDH sebagai control internal. Sebuah indeks ekspresi dihitung dari jumlah
relative yang ternormalisasi pada bagian tanpa ekstrak/polifenol sampai dengan jumlah
relative normalisasi dengan diberikannya ekstrak/polifenol. Analisis ini dilakukan
setidaknya sebanyak tiga kali, dan hasil yang membuktikan muncul.
Analisis Ultraperformance Liquid Chromatography (UPLC). Ekstrak kurma (2
g) dilarutkan dalam 40 mL DW yang mengandung asam formiat 0,1%, dan diaplikasikan
pada kartrid C-18 Sep-Pak (10 g) (Waters, Milford, MA) yang diaktifkan dengan metanol dan
diseimbangkan dengan DW mengandung asam format 0,1%. Kemudian, komponen yang
tidak terserap dicuci dengan DW yang mengandung asam format 0,1%, dan komponen yang
diserap dielusi dengan metanol 50%. Larutan dipekatkan dengan menggunakan evaporator
berputar dan dikeringkan beku sebagai fraksi dengan polifenol kurma kasar. Beratnya sebesar
107,8 mg. Fraksi dilarutkan dalam metanol pada konsentrasi 200 mg / mL dan dianalisis
dengan menggunakan UPLC. Analisis UPLC dilakukan dengan menggunakan sistem
ACQUITY UPLC (Waters) dan BEH C18 (2.1 mm i.d. 50 mm, 1.7m; Waters). Suhu
autosampler dan kolom dipertahankan masing-masing pada 20 dan 40 C. Pemisahan dicapai
dengan elusi gradien menggunakan (A) DW yang mengandung asam trifluoroasetat 0,1%
(TFA) dan (B) asetonitril yang mengandung 0,1% TFA sebagai fase gerak pada laju alir 0,50
mL / menit. Kondisi gradien fase gerak adalah sebagai berikut: konsentrasi B, 5 15%, 0 10
menit; B konsentrasi, 15 95%, 10 12 menit, dan kembali ke kondisi awal. Efluen dipantau
pada absorbansi 254 nm.
Penentuan Komposisi Gula. Penentuan komposisi gula dilakukan sesuai prosedur
seperti yang dijelaskan oleh Yasuno et al.25 Fraksi dengan massa molekul lebih dari 30.000
Da (5 g) dihidrolisa dan diberi label dengan menggunakan kit pelabelan ABEE.
Monosakarida yang dikonversi oleh ABEE dianalisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT). Kolomnya adalah ODS-80T (4,6 mm i.d. 150 mm; Tosoh, Tokyo, Jepang). HPLC
dilakukan sesuai prosedur seperti yang dijelaskan oleh Yasuno et al.25
Analisis Statistik. Data dinyatakan sebagai rerata (standar deviasi (SD). Analisis
statistik dilakukan dengan menggunakan beberapa uji perbandingan Dunnett untuk analisis
varians satu arah. Perbedaan dianggap signifikan bila nilai kurang dari 0,05.

HASIL
Sifat Imunologis Mencit yang diberikan diet dengan tambahan tambahan
ekstrak kurma, ekstrak plum, atau ekstrak buah ara. Mencit C3H/HeN berusia enam
minggu diberi ekstrak kurma, ekstrak plum, atau ekstrak ara atau diet bebas ekstrak (kontrol)
selama 30 hari. Tidak ada perbedaan signifikan dalam bobot tubuh yang diamati pada
mencit yang diberi empat macam makanan (data tidak ditunjukkan). Seperti ditunjukkan
pada Tabel 2, jumlah sel IFN-+CD4+ di Peyers patch secara signifikan lebih tinggi pada
mencit yang diberi diet ekstrak buah dibandingkan dengan yang diberi diet kontrol, terutama
mencit yang diberi diet dengan menambahkan ekstrak kurma dan ekstrak plum. Jumlah sel
Peyers Patch IFN-+CD49b+ secara signifikan lebih tinggi pada mencit yang diberi diet
tambahan ekstrak kurma dan ekstrak buah plum dibandingkan dengan yang diberi diet
kontrol dan diet ekstrak buah ara, sedangkan sel IL-12+CD11b+ secara signifikan lebih tinggi
pada mencit yang diberi diet tambahan ekstrak kurma dibandingkan dengan yang diberi diet
kontrol dan ekstrak plum serta ekstrak buah ara. Demikian pula, jumlah sel limpa IFN-
+CD4+ dan IL-12+CD11b+ secara signifikan lebih tinggi pada mencit yang diberi diet
tambahan ekstrak kurma yang dibandingkan dengan yang diberi diet kontrol, ekstrak plum
atau ekstrak buah ara.

Tabel 2. Jumlah Sel Imunokompeten pada Peyers Patch dan Limpa dari Mencit yang
diberikan Diet dengan tambahan ekstrak Kurma, Ekstrak Plum, dan Ekstrak Buah Ara

Pengaruh Ekstrak Kurma dan Ekstrak Plum Terfraksi terhadap Ekspresi Gen
IFN- pada Kultur Sel Patch Peyer Mencit. Seperti ditunjukkan pada Gambar 1, dua
fraksi ekstrak kurma dengan massa molekuler 500 Da sampai 1.000 Da dan lebih besar dari
30.000 Da secara signifikan meningkatkan tingkat ekspresi IFN- mRNA dibandingkan
fraksi tanpa-ekstrak dan fraksi ekstrak kurma lain, dengan massa molekul dari 1.000 Da
sampai 5.000 Da, 5.000 Da sampai 10.000 Da, dan 10.000 Da sampai 30.000 Da. Fraksi
ekstrak plum dengan massa molekul dari 10.000 Da sampai 30.000 Da dan lebih dari 30.000
Da secara signifikan meningkatkan tingkat ekspresi IFN- mRNA dibandingkan dengan tiga
fraksi ekstrak plum lainnya.
Identifikasi Polifenol dalam Ekstrak Kurma melalui UPLC. Seperti ditunjukkan
pada Gambar 2, lebih dari 10 titik puncak terdeteksi pada ekstrak kurma pada UPLC. Waktu
retensi dan spektrum UV puncak ini dibandingkan dengan polifenol standar yang tersedia
secara komersial. Enam puncak utama diidentifikasi sebagai berikut: (1) asam protocatechuic,
(2) asam chlorogenic, (3) asam caffeic, (4) asam syringic, (5) pelargonin, dan (6) asam
ferulic. Sayangnya, puncak lainnya tidak bisa diidentifikasi.

Gambar 1. Gambar dari ekstrak fraksinasi kurma dan ekstrak buah Plum pada ekspresi IFN-
mRNA pada sel peyer patch mencit. Peyer's patches diperoleh dari mencit berumur enam
minggu yang dibiakkan dengan diet standar yang tersedia secara komersial, dan selnya
dikultur dengan 50 atau 100 g/mL masing-masing ekstrak selama 24 jam. Total RNA dari
sel yang diekstraksi dan cDNA dihasilkan oleh reaksi RT. Fraksi dengan massa molekul dari
500 Da sampai 1.000 Da, fraksi dengan massa molekul dari 1.000 Da sampai 5.000 Da, fraksi
dengan massa molekul dari 5.000 Da sampai 10.000 Da, fraksi dengan massa molekul dari
10.000 Da sampai 30.000 Da, dan fraksi dengan massa molekul lebih dari 30.000 Da
disajikan sebagai batang, terbuka, titik hitam, padat, dan berarsir. Data diwakili sebagai mean
(SD (n = 3). Item yang ditunjukkan dengan huruf yang berbeda (yaitu, a, b, c, d) secara
signifikan berbeda (P <0,05).
Gambar 2. Spektrum (atas) dan kromatogram (bawah) fraksi dengan polifenol kurma kasar
dianalisis dengan UPLC: (1) asam protocatechuic, (2) asam chlorogenic, (3) asam caffeic, (4)
asam syringic, (5) pelargonin, dan (6) asam ferullic.

Gambar 3. Efek beberapa polifenol yang diidentifikasi pada ekstrak kurma pada ekspresi
IFN- mRNA pada kultur sel peyer patch mencit. Peyer's patches diperoleh dari mencit
berumur enam minggu yang dibiakkan dengan diet standar yang tersedia secara komersial,
dan selnya dikultur dengan 4 M masing-masing polifenol selama 24 jam. Total RNA dari
sel diekstraksi dan cDNA dihasilkan oleh reaksi RT. Data diwakili sebagai mean (SD (n = 3).
Item yang ditunjukkan dengan huruf yang berbeda (yaitu, a, b) secara signifikan berbeda (P
<0,05).

Efek Beberapa Polifenol yang Teridentifikasi dalam Ekstrak Kurma pada

Ekspresi Gen IFN- pada Kultur Sel Patch Peyer Mencit. Gambar 3 menunjukkan efek
dari enam polifenol yang tersedia secara komersial yang teridentifikasi pada ekstrak kurma
pada ekspresi IFN- mRNA pada kultur sel patch Peyer. Asam klorogenat, asam caffeic,
pelargonin, dan asam ferulat meningkatkan ekspresi IFN- mRNA secara signifikan
dibandingkan dengan asam protocatechuic dan syringic bebas polifenol.
Efek Beberapa Polifenol yang Teridentifikasi dalam Ekstrak Kurma terhadap
Jumlah Sel Imunokompeten dalam Kultur Sel Patch Peyer Mencit. Tabel 3 menunjukkan
jumlah sel imunokompeten pada sel patch Peyer yang dikultur dengan empat polifenol yang
meningkatkan ekspresi IFN- mRNA, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3. Asam
klorogenik dan asam caffeic meningkatkan jumlah IFN-+CD4+ sel Patch Peyer secara
signifikan dibandingkan bebas-polifenol, pelargonin dan asam ferulic. Asam klorogenat,
pelargonin, dan asam ferulik meningkatkan jumlah IFN-+CD49b+ sel Patch Peyer secara
signifikan dibandingkan dengan bebas-polifenol dan asam caffeic. Selain itu, asam
chlorogenic, asam caffeic, dan asam ferulic meningkatkan jumlah IL-12+CD11b+ sel secara
signifikan dibandingkan dengan bebas-polifenol dan pelargonin.

Tabel 3. Jumlah Sel Imunokompeten di Sel Peyers Patch yang Dibiakkan dengan Empat
Polifenol yang Teridentifikasi pada Ekstrak Kurma

Efek Dua Presipitat dari Fraksi Ekstrak Kurma dengan Massa Molekul Lebih
dari 30.000 Da pada Jumlah Sel Imunokompeten dalam Kultur Sel Patch Peyer Mencit.
Tabel 4 menunjukkan jumlah sel imunokompeten pada sel Patch Peyer yang dikultur dengan
endapan amonium sulfat atau etanol dari fraksi ekstrak kurma dengan massa molekul lebih
dari 30.000 Da. Endapan etanol meningkatkan jumlah IFN-+CD49b+ dan IL-12+CD11b+
sel secara signifikan dibandingkan dengan endapan bebas. Sebaliknya, endapan amonium
sulfat memiliki sedikit pengaruh pada sel imunokompeten.
Penentuan Komposisi Gula pada Fraksi Ekstrak Kurma dengan Massa Molekul
Lebih dari 30.000 Da. Seperti ditunjukkan pada Gambar 4B, tiga puncak terdeteksi pada
produk degradasi terkonversi-ABEE dari fraksi ekstrak kurma dengan massa molekul lebih
dari 30.000 Da pada HPLC. Waktu retensi dari dua puncak ini konsisten dengan asam
galakturonat terkonversi-ABEE dan glukosa terkonversi-ABEE (Gambar 4A), walaupun satu
puncak kecil tidak dapat ditentukan.

Tabel 4. Jumlah Sel Imunokompeten di Sel Peyer's Patch yang dibiakkan dengan 2 jenis
presipitat, dalam Saturasi 70% Amonium Sulfat dan Etanol 70% Fraksi Ekstrak Kurma
dengan Massa Molekul lebih dari 30.000 Daa

Gambar 4. Kromatogram monosakarida standar yang dikonversi oleh ABEE (A) dan produk
degradasi ABEE yang dikonversi dari fraksi ekstrak kurma dengan massa molekul lebih dari
30.000 Da (B) pada HPLC. Puncak: (1) asam galakturonat yang dikonversi ABEE, (2)
glukosa yang dikonversi ABEE.

DISKUSI
Pertama, jumlah IFN-+CD4+, IFN-+CD49b+ dan IL-12+CD11b++ sel Patch Peyer
secara signifikan meningkat pada mencit yang diberi diet tambahan ekstrak kurma
dibandingkan dengan diet bebas ekstrak (kontrol). Jumlah IFN-+CD4+ sel Patch Peyer
pada mencit yang diberi diet tambahan ekstrak plum atau ekstrak buah ara, dan jumlah IFN-
+ CD49b + sel patch Peyer pada mereka yang diberi makanan tambahan ekstrak plum
terstimulasi secara signifikan. Namun, jumlah sel IFN-+CD4+ dan IL-12+CD11b+ limpa
meningkat secara signifikan hanya pada mencit yang diberi diet ekstrak kurma (Tabel 2).
CD11b adalah antigen khas permukaan sel makrofag dan DC.26 IL-12 adalah salah satu
sitokin utama yang diproduksi oleh sel-sel ini.27 Di sisi lain, CD49b adalah antigen
permukaan sel yang khas dari sel NK. IFN- juga merupakan sitokin utama yang diproduksi
oleh sel-sel ini dan sel T helper tipe 1 (Th1).27 Makrofag dan DC membentuk garis
pertahanan pertama sebagai komponen respons kekebalan alami pada pertahanan inang. Sel
NK juga merupakan sel aksesori penting, selain makrofag dan DC, yang berperan penting
dalam pertahanan inang untuk memunculkan efek sitotoksik pada sel tumor.28 Proliferasi
dan aktivasi sel NK diinduksi oleh IL-12, dan Sel NK yang teraktivasi menghasilkan IFN-
.27 Oleh karena itu, diketahui bahwa peningkatan jumlah IFN-+CD49b+ sel disebabkan
oleh peningkatan jumlah IL-12 + CD11b+ sel. Di sisi lain, sel-sel IFN-+CD4+ adalah sel
Th1, dan produksi IFN- merangsang IL-12 yang dihasilkan dari makrofag dan sel NK dan
meningkatkan diferensiasi sel T naif menjadi sel Th1.29 Fakta-fakta ini menunjukkan bahwa
ekstrak kurma merangsang IL-12 yang diproduksi oleh makrofag dan/atau DC, menunjukkan
bahwa IL-12 mengaktifkan sel NK di Peyer patch, dan mendiferensiasi sel T naif menjadi
sel Th1 di patch Peyer dan limpa. Kecenderungan untuk peningkatan sel IL-12+CD11b+
Patch Peyer menunjukkan bahwa ekstrak plum juga mengaktifkan sel NK dan sel Th1.
Secara kebetulan, diyakini bahwa ekstrak buah ara merangsang sel Th1 dengan cara yang
berbeda dibanding ekstrak kurma dan plum, karena ekstrak ara meningkatkan jumlah sel
IFN-+CD4+ patch Peyer namun tidak meningkatkan jumlah sel IL-12+CD11b+ patch Peyer.
Dua fraksi ekstrak kurma dengan massa molekul dari 500 Da sampai 1.000 Da dan
lebih dari 30.000 Da secara signifikan meningkatkan tingkat ekspresi IFN- mRNA
dibandingkan yang bebas ekstrak dan fraksi lainnya (Gambar 1). Hasil ini menunjukkan
bahwa setidaknya dua jenis komponen pada ekstrak kurma merangsang ekspresi IFN-
mRNA. Oleh karena itu, komponen kurma ini dapat mempengaruhi peningkatan jumlah sel
IFN-+CD4+ dan Peyer patch IFN-+CD49b+ patch Peyer dan limpa pada mencit yang
diberi diet ekstraksi kurma.
Secara umum dianggap bahwa komponen molekul rendah terdapat dalam buah
terutama adalah polifenol. Dilaporkan bahwa kurma mengandung beberapa polifenol seperti
asam protocatechuic, asam caffeic, syringic acid, ferulic acid, procyanidins, dan quercetin
glycoside. Dalam penelitian ini, kami mengidentifikasi enam jenis polifenol pada ekstrak
kurma. Sebagai tambahan, kami memastikan bahwa asam chlorogenic dan pelargonin adalah
polifenol baru pada kurma (Gambar 2). Efek dari kedua polifenol yang diidentifikasi dalam
penelitian ini dan beberapa polifenol lain yang diketahui dimasukkan pada kurma diperiksa
pada ekspresi gen IFN-pada kultur sel patch Peyer mencit. Asam klorogenat, asam caffeic,
pelargonin, dan asam ferulat meningkatkan ekspresi IFN- mRNA secara signifikan
dibandingkan dengan asam protocat echuic dan syringic bebas polifenol (Gambar 3). Selain
itu, asam chlorogenic dan asam caffeic meningkatkan jumlah sel IFN-+CD4+ secara
signifikan dibandingkan dengan bebas polifenol, pelargonin dan asam ferulic. Selain itu,
asam chlorogenic, pelargonin dan ferulic acid meningkatkan jumlah
Sel IFN-+CD49b+ secara signifikan dibandingkan dengan polifenolfri dan asam
caffeic. Dalam tes pemberian oral, pada mencit diberi diet ekstraksi kurma, jumlah patch
Peyer IFN- + CD4 + dan IFN- + CD49b + dan jumlah sel limpa IFN- + CD4 + secara
signifikan lebih tinggi, dan jumlahnya Limpa sel IFN- + CD49b + cenderung meningkat
dibandingkan dengan yang diberi diet kontrol. Hasil ini menunjukkan bahwa peningkatan
jumlah sel IFN-+CD4+ limpa pada mencit yang diberi diet ekstraksi pada kurma tampaknya
disebabkan oleh tindakan asam klorogenik dan asam caffeic, sedangkan pada jumlah limpa
IFN- + Sel CD49b+ pada mencit mungkin disebabkan oleh tindakan asam chlorogenic,
pelargonin, dan asam ferulic.
Kemudian dianggap bahwa komponen molekul tinggi yang terdapat dalam buah adalah
protein dan polisakarida. Kami menyiapkan dua jenis presipitat dengan penambahan
amonium sulfat atau etanol, mengikuti pencernaan dengan tripsin, ke dalam fraksi ekstrak
kurma dengan massa molekul lebih dari 30.000 Da. Endapan etanol dari ekstrak kurma,
setelah pencernaan dengan tripsin, meningkatkan jumlah sel IFN- + CD49b + dan IL12 +
CD11b + secara signifikan dibandingkan dengan yang bebas endapan, namun endapan
amonium sulfat memiliki sedikit pengaruh terhadap sel imunokompeten (Tabel 4). Selain itu,
seperti yang ditunjukkan oleh analisis HPLC, fraksi ekstrak kurma dengan massa molekul
lebih besar dari 30.000 Da terutama terdiri dari glukosa (Gambar 4). Dilaporkan bahwa
kurma mengandung -D-glukan,31 dan glukan adalah polisakarida yang mengandung
glukosa. Hasil ini menunjukkan bahwa fungsi imunomodulator dari ekstrak kurma juga
disebabkan oleh -D-glukan.
Sebagai kesimpulan, dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa ekstrak kurma
meningkatkan sistem kekebalan seluler lebih kuat daripada ekstrak plum dan buah ara.
Kami mengusulkan kurma tersebut dapat digunakan sebagai imunomodulator yang efektif
untuk mencegah beberapa penyakit. Secara khusus, kami menemukan bahwa ekstrak kurma
merangsang sel IFN- + CD4 +, atau sel Th1. Sudah diketahui bahwa alergi tipe I disebabkan
oleh rendahnya kadar sel Th1.32 Oleh karena itu, kami sedang menyelidiki efek ekstrak
kurma yang ditambahkan pada gejala alergi pada model mencit alergi tipe I