INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Escuela Nacional De Ciencias Biolgicas

Prolongacin Manuel Carpio y Plan de Ayala s/n, Miguel Hidalgo,

Santo Toms, 11350 Ciudad de Mxico, CDMX.

Tcnica de microcultivo

La tcnica de microcultivo sobre portaobjetos es convencional para visualizar estructuras delicadas,

sin manipulacin que las pudiera alterar. Estos microcultivos se preparan extendiendo una capa fina
del medio de agar adecuado, aspticamente, sobre un portaobjetos estril, e inoculado en su punto
central, cuando se ha solidificado, con una suspensin de esporas el hongo en estudio. A
continuacin, se incuba aspticamente (en el interior de una placa de Petri estril) en condiciones
idneas para cada caso.

IDENTIFICACIN DE MOHOS POR LA TCNICA DE RIDELL (MICROCULTIVO)

1. Cortar cuadros de PDA de una caja Petri de 1 cm de lado y 3 mm de espesor con un bistur
estril y caliente.

2.- Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que est sobre una varilla de vidrio doblada
en forma de V en una caja de Petri (previamente esterilizada).

3. Tomar con el asa el inoculo del

moho previamente
seleccionado.

4. Inocular por picadura en cada uno de los lados del cuadro de agar.

5. Colocar sobre el agar un cubreobjeto y presionar ligeramente para que se adhiera al medio.
6. Adicionar 5 ml de glicerol al 10% en la caja Petri.

7. Incubar la caja a 28 C durante 48 h. REALIZAR OBSERVACIONES MNIMO CADA 12 h

PARA IDENTIFICAR LOS CUERPOS FRUCTFEROS.

1. Si el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar, retirar el glicerol con una pipeta

Pasteur

2.- Adicionar 5 ml de formaldehdo para inactivar el moho durante 15 minutos.

3. Desprender con cuidado el cubreobjetos que

se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo sobre un portaobjetos que contenga una
gota de azul de algodn, sellar la preparacin con barniz de uas transparente.
4. Desprender con cuidado el cuadro de agar y colocar una gota de azul de algodn, colocar
un cubreobjetos sobre el colorante y sellar la preparacin. Observar las preparaciones a 10X
y 40X.
 5. Dibujar las estructuras observadas y con ayuda de la bibliografa realizar la comparacin
de las estructuras reproductoras y vegetativas, identificar de que moho se trata. Por
ejemplo: Rhizopus sp.

Tcnica 2.-

1. De una placa de Sabouraud, cortamos un cuadrado de 1.5 x 1.5 cm de agar, con ayuda de una
cuchilla.
2. Coger el cuadrado de agar que hemos recortado y ponerlo sobre un portaobjetos, sobre los
bordes de este cuadrado sembramos el moho de la muestra que tengamos (en este caso hongo de
un alimento). A continuacin, colocar sobre el cuadrado de agar (una vez sembrado) un
cubreobjetos. Conservar esta preparacin en una cmara hmeda e incubar es estufa a 25C (hongo
filamentoso).
3. Luego, con la placa con el medio Saboreaud al que le hemos cortado el cuadrado, vamos a realizar
en ella otra siembra. Cogemos la muestra de moho que tengamos (en este caso un hongo ambiental)
y hacemos una siembra sobre los bordes. Levar a incubar a 25C.

Una vez pasado el tiempo de incubacin, procedemos a su observacin, para ello:

- Portaobjetos con el cuadrado de agar:
1 Coger un portaobjetos nuevo, poner una gota de azul de lactofenol y poner sobre la gota el
cubreobjetos que se encontraba sobre el cuadrado de agar.
2 Observar al microscopio con el objetivo 40x.
- Placa de Saboreaud:
1 Coger un portaobjetos nuevo, poner una gota de azul de lactofenol y con un asa de siembra
estril coger una muestra del hongo que ha debido crecer en la placa. Mezclar bien la preparacin.
2 Poner sobre la preparacin un cubreobjetos y observar al microscopio con el objetivo 40x.

Tcnica 3
Tcnica de emparedado
Con esta tcnica se tienen dos planos de enfoque.
Mtodo

a) Sobre una caja de Petri con medio decultivo, se deposita de 5 a 8 fragmentos delhongo por
estudiar

B) Se introducen en el agar de 4 a 6cubreobjetos estriles de 22 * 22 mm en unngulo aproximado
de 45 .

c) Se cierra la caja y se incuba durante 7 a 15das a 25C

d) Cuando el cultivo ha alcanzado su madurezse retira un cubreobjetos de la caja y se colocasobre
un portaobjetos, sobre el cualpreviamente se ha depositado una gota deazul de algodn.

e) Se deposita una gota de azul de algodnsobre el cubreobjetos y se cubre con otrocubreobjetos

de 24 * 40 mm.

f) Se repite el procedimiento con los demscubreobjetos contenidos en la caja de cultivo-

Tcnica 4
El anlisis de materiales clnicos con la coloracin de blanco de calcoflor y posterior observacin
con microscopio de fluorescencia, resulta un mtodo sencillo y rpido para la identificacin
presuntiva y contribuye, por lo tanto, al diagnstico temprano de especies de Malassezia.
La tcnica del blanco de calcoflor se basa, por una parte, en la propiedad que tiene dicha sustancia
de emitir fluorescencia al ser activada por radiacin ultravioleta, y por otra, en la afinidad que
presenta por la celulosa y la quitina presentes en la pared celular de los organismos fngicos.
La preparacin con blanco de calcoflor consiste en depositar sobre un portaobjetos el material a
analizar (escamas o alcuota de colonia), y sobre el mismo agregar una gota de solucin del
fluorocromo (blanco de calcoflor M2r (Sigma) 0,1g, azul de Evans (Sigma) 0,05 g, agua destilada
100ml) (11), y una gota de KOH 10%, colocndose luego el cubreobjetos. El preparado se observa
en un microscopio con sistema de fluorescencia (lmpara de mercurio, objetivos especficos y filtros
para trabajar con longitud de onda de 390-420 nm).

Tcnica de gota pendiente

-Es til para seguir la evolucin completa de un hongo.

-Se emplea para observar la germinacin de las esporas

Mtodo

1) Se toma un anillo de vidrio de unos dos centmetros de dimetro, con bordes bien pulidos, altura
de 1 cm aproximadamente.

2) Se flamea el anillo y se toca uno de sus bordes con luten de R. de Noyer o parafina, adhiriendo un
portaobjeto esterilizado

3) Luego se introduce una gota de agua esterilizada en la cmara as formada. Con fin de conservar
la humedad del cultivo.

4) Acto seguido se junta su otro borde con vaselina y se le pone encima el cubreobjeto, que lleva en
su centro el medio de cultivo con el hongo en suspensin. Se puede usar en vez de este dispositivo
un portaobjeto excavado.
 Tcnica de montaje hmedo

Es un viejo mtodo rpido para preparar colonias de hongos para examen microscpico.

Mtodo

1.-Con una aguja doblada se toma una pequea proporcin de la colonia a estudiar incluyendo una
pequea proporcin del agar subyacente.

2.-La muestra debe tomarse de un sitio intermedio entre el centro y la periferia de la colonia.

3.Este pequeo fragmento de colonia y el agar de sostn se transfieren a un portaobjetos el cual

contiene una gota de lactofenol azul de anilina y se cubre con un cubreobjetos.

4.-Se presiona la preparacin con la goma de borrar de un lpiz.

La solucin de lactofenol azul sirve como tincin y adems el fenol mata la porcin de cultivo que
se examina, disminuyendo as las posibilidades de infeccin en el laboratorio.

Tcnica de cinta adhesiva o Scotch

Mtodo que puede considerarse como el ms simple, econmico y adecuado para la identificacin
de hongos.

Tcnica de Rivalier

Es una tcnica de microcultivo que permite evidenciar de forma clara las estructuras morfolgicas
en su arreglo y disposicin natural.
Se realiza para la identificacin de cultivos o bien, para preparar material de enseanza.

Mtodo

a) Sumergir un portaobjetos estril en medio de cultivo a 56C.

b) Colocar el portaobjetos sobre un caballete en una caja de Petri

c) Inocular el centro del portaobjeto con elongo a estudiar

d) Depositar en la caja de Petri 10 ml de agua destilada estril, sin mojar el cultivo.

e) Incubar a 25C en la oscuridad

f) Cuando el cultivo alcance su madurez, desprender el exceso de agar y secar en la estufa a 37 C

durante 24 horas

g) Sumergir la preparacin en colodin ligero.

h) Escurrir el exceso de colodin y dejar secar durante 24 horas en posicin horizontal

Preparacin del colodin:

-Colodin oficial (sin aceite de ricino) 1ml

-Alcohol absoluto 2ml

-ter sulfrico 2ml

Bibliografa:
- http://www.biblioteca.upibi.ipn.mx/Archivos/Material%20Didactico/T%C3%A9cnicas
%20microbiol%C3%B3gicas/T%C3%A9cnicas%20Microbiol%C3%B3gicas%20Parte%202
.pdf
- http://fytam.blogspot.mx/2016/03/microcultivo.html
- http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=213016797002
- Arenas, R. (1993). Micologa Medica. Ed. Interamericana McGraw-Hill. Mxico.
- Lpez, R. (2006). Micologa Mdica (Procedimientos para el Diagnostico de
Laboratorio). Ed. Trillas. Mxico.