16

METODE PENELITIAN

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni sampai Juli 2011 bertempat di
Laboratorium Helmintologi Bagian Parasitologi dan Entomologi Kesehatan, serta
Laboratorium Terpadu, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan
Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.

Metode
1. Koleksi Serum Contoh
Tahap koleksi serum contoh dalam penelitian ini dilakukan pada bulan
Oktober 2009 sampai Juni 2011. Tahap koleksi ini dilaksanakan oleh tim peneliti
mahasiswa Pascasarjana Program Studi Kesehatan Masyarakat Veteriner, Institut
Pertanian Bogor. Serum contoh yang dikoleksi diambil secara purposif yaitu
berasal dari babi yang diizinkan oleh pemiliknya untuk diambil darahnya dan
dipelihara secara diumbar.
Dalam penelitian ini diperiksa sebanyak 39 serum contoh yang terdiri atas
26 serum yang dikoleksi pada tahun 2009 dan 13 serum pada tahun 2010. Serum
tersebut diperoleh dari babi asal Distrik Assologaima dan Wamena Kota (Tabel
1). Babi tersebut terdiri atas 18 ekor jantan dan 21 ekor betina. Serum kontrol
positif yang digunakan dalam penelitian ini dikoleksi dari babi yang dalam
pemeriksaan postmortem ditemukan adanya sistiserkus dalam dagingnya. Babi
tersebut berasal dari peternakan rakyat di Kabupaten Jayawijaya. Serum kontrol
negatif yang digunakan dalam penelitian ini dikoleksi dari babi yang berasal dari
peternakan di Jawa Tengah.
Pembuatan serum dilakukan dengan cara mengambil darah babi melalui
vena jugularis menggunakan spuit 5 mL. Darah yang telah diambil tersebut
selanjutnya diinkubasi dalam suhu ruang selama satu jam dengan posisi mendatar.
Darah tersebut kemudian diinkubasikan kembali selama 24 jam dalam suhu 4 C.
Serum yang terbentuk selanjutnya dipanen dengan meletakkannya dalam tabung
 17

mikro berukuran 1.5 mL. Penyimpanan serum dilakukan dalam suhu -18 C
hingga akan digunakan.

Tabel 1 Daerah asal dan jumlah babi yang dilakukan pemeriksaan serologis
Jenis Kelamin
Jumlah
No. Daerah asal (Distrik) Jantan Betina Tidak
(ekor)
diketahui
1. Assologaima 22 7 15 -
2. Wamena Kota 17 11 6 -
Jumlah Total 39 18 21 0

2. Protokol ELISA
Penelitian ini dilakukan dengan metode sandwich ELISA untuk mendeteksi
Cysticercus cellulosae yang dikembangkan oleh Institute of Tropical Medicine
Antwerpen, Belgia (ITM 2009). Metode ini menggunakan antibodi monoklonal
sebagai bahan pendeteksi keberadaan antigen Cysticercus cellulosae dalam serum
contoh. Tingkat spesifitas dari metode ini adalah 98.7% dan tingkat
sensitifitasnya adalah 92.3% (Van Kerckhoven et al. 1998, diacu dalam Dorny el
al. 2000). Metode ini terdiri dari delapan tahap, yaitu pre-treatment serum,
coating sumuran cawan, blocking, peletakan serum contoh (sampel), pemberian
antibodi pendeteksi, konjugat, substrat, stop solution, dan pembacaan nilai
absorbansi.
Pre-treatment serum dilakukan dengan mencampurkan 75 L serum dan 75
L larutan TCA (tricloroacetic acid 5% dalam akuabides) dalam tabung mikro.
Campuran tersebut dikocok menggunakan vortex dan diinkubasi selama 20 menit
pada suhu ruang. Setelah diinkubasi, campuran tersebut kembali dikocok
menggunakan vortex dan disentrifus selama sembilan menit dalam kecepatan 12
000 g. Supernatan yang diperoleh selanjutnya diambil menggunakan pipet mikro
dan dicampurkan dengan larutan karbonat/bikarbonat pH 10 sebanyak 75 L di
dalam tabung mikro. Campuran tersebut kemudian disimpan dalam suhu 4 C
sampai akan digunakan. Setelah tahap pre-treatment dilakukan, selanjutnya
dilakukan pembuatan pola peletakan sampel.
 18

Coating dilakukan dengan melapisi sumuran cawan dengan antibodi

penangkap dalam konsentrasi 5 g/mL coating buffer karbonat/bikarbonat pH 9.8.
Antibodi penangkap yang digunakan dalam penelitian ini berupa antibodi
monoklonal anti Taenia saginata (kode produksi: B158C11A10) hasil produksi
Institute of Tropicaledicine Antwerpen, Belgia. Antibodi penangkap sebanyak
100 L dimasukkan ke dalam masing-masing sumur kecuali sumur A1 dan B1.
Sumur A1 dan B1 merupakan sumur kontrol untuk substrat buffer, kedua sumur
ini hanya diisi dengan 100 L coating buffer. Inkubasi dilakukan di dalam shaker
inkubator selama 30 menit pada suhu 37 C. Setelah inkubasi selesai, dilakukan
pencucian dengan PBS Tween-20 0.05% (buffer pencuci) sebanyak satu kali
menggunakan pipet mikro multi channel.
Blocking dilakukan dengan tujuan untuk menutup permukaan sumur yang
tidak dilekati oleh antibodi penangkap. Tahap ini dilakukan dengan cara
memasukkan 100 L larutan blocking berupa New Born Calf Serum 1% di dalam
buffer pencuci pada setiap sumur. Cawan tersebut diinkubasi dalam shaker
inkubator selama 15 menit pada suhu 37 C.
Pemasukan sampel dilakukan dengan memasukkan serum contoh yang
telah dipre-treatment sebanyak 100 L ke dalam masing-masing sumur sesuai
dengan pola. Cawan tersebut diinkubasi dalam shaker inkubator pada suhu 37 C
selama 15 menit. Tiap-tiap sumur dalam cawan kemudian dicuci sebanyak lima
kali menggunakan buffer pencuci.
Pemberian antibodi pendeteksi. Antibodi pendeteksi yang digunakan
dalam penelitian ini berupa antibodi monoklonal anti Taenia saginata yang telah
dikonjugasikan dengan biotin (kode produksi: B158C11A10) produksi Institute of
Tropical Medicine Antwerpen, Belgia. Sebanyak 100 L antibodi pendeteksi
dengan konsentrasi 1.25 g/ mL larutan blocking dimasukkan ke dalam setiap
sumur kecuali sumur A1 dan B1. Sumur A1 dan B1 hanya diisi dengan larutan
blocking sebanyak 100 L. Selanjutnya cawan tersebut diinkubasikan di dalam
shaker inkubator pada suhu 37 C selama 15 menit. Pencucian dilakukan
sebanyak lima kali dengan buffer pencuci setelah inkubasi selesai.
Pemberian konjugat. Konjugat yang digunakan berupa streptavidin
(1/10000 l larutan blocking) sebanyak 100 L pada semua sumur kecuali sumur
 19

A1 dan B1. Kedua sumur ini diisi dengan 100 L larutan blocking. Cawan
tersebut diinkubasikan dalam shaker inkubator selama 15 menit pada suhu 37 C.
Selanjutnya dilakukan pencucian sebanyak lima kali dengan buffer pencuci.
Pemberian substrat. Substrat yang digunakan berupa ortho phenil diamine
(OPD) yang dibuat dengan cara melarutkan 1 tablet OPD dalam 10 mL akuabides
dengan ditambahkan H2O2 sebanyak 2.5 L. Tahap ini dilakukan dengan cara
meletakkan 100 L substrat ke dalam setiap sumur dan dilaksanakan dalam
kondisi ruangan gelap. Cawan tersebut diinkubasi pada suhu 30 C selama 15
menit di dalam inkubator.
Pemberian stop solution. Tujuan dari tahap ini adalah untuk menghentikan
reaksi pada sumur. Larutan stop solution yang digunakan berupa asam kuat yaitu
H2SO4. Tahap ini dilakukan dengan cara menambahkan 50 L larutan stop
solution pada setiap sumur.
Pembacaan nilai absorbansi dilakukan dengan menggunakan ELISA
reader dengan panjang gelombang 492 nm dan 655 nm. Penghitungan rataan
nilai absorbansi dari masing-masing serum contoh dilakukan setelah diperoleh
data nilai absorbansi dari hasil pembacaan. Penentuan nilai cut off didapatkan dari
hasil perhitungan nilai t-student dari kontrol negatif (Sokal & Rohlf 1981).
Status serum contoh ditentukan berdasarkan rasio dari rata-rata nilai
absorbansi (OD) terhadap nilai cut off. Serum dinyatakan positif mengandung
antigen sisrkulasi Cysticercus cellulosae bila nilai rasio antara rataan nilai
absorbansinya dengan cut off bernilai lebih besar dari 1. Serum dinyatakan
negatif mengandung antigen sirkulasi Cysticercus cellulosae bila nilai rasio antara
rataan nilai absorbansinya dengan cut off bernilai kurang dari 1. Serum positif
menandakan bahwa di dalam serum tersebut mengandung antigen Cysticercus
cellulosae. Sedangkan serum negatif menandakan bahwa serum tersebut tidak
mengandung antigen Cysticercus cellulosae. Data hasil pemeriksaan ELISA
selanjutnya dianalisis menggunakan metode deskiptif.