Unidad Curricular: Virologa y Micologa Veterinaria

TRABAJO PRCTICO No. 2

EXTRACION DE ACIDO NUCLEICO VIRAL

Las pruebas para el diagnostico especfico de una infeccin viral se clasifican en dos tipos:
1. Aquellas en las que se demuestra la presencia del virus infeccioso, el antgeno viral o
el acido nucleico viral.
2. Aquellas en las que se demuestra la presencia de anticuerpos especficos contra el
virus.
Uno de los mayores esfuerzos en el desarrollo del diagnostico virolgico ha sido el diseo de
mtodo rpidos que provean una respuesta definitiva en menos de 24 horas o incluso durante
el curso de la evaluacin inicial del animal. El mejor de estos mtodos debe cumplir con los
siguientes prerrequisitos: a) rapidez; b) simplicidad; c) sensibilidad; d)
especificidad; e) bajo costo. Comercialmente, existen pruebas diagnsticas estandarizadas
para muchos virus; muchas de estas pruebas han sido miniaturizadas para utilizar la menor
cantidad posible de reactivos y mantener un bajo costo; se han desarrollado instrumentos que
permiten la automatizacin de las pruebas y adicionalmente se dispone de anlisis
computarizados que permiten una interpretacin de los resultados de la manera mas objetiva
posible.
En medicina veterinaria comparada con la medicina humana, hay una rpida expansin en el
nmero de estuches diagnsticos disponibles, en funcin al retorno econmico de la inversin
y el rango de pruebas necesarias para cada especie animal. Estas pruebas detectan los
antgenos virales, permitiendo el diagnstico a partir de una sola muestra tomada directamente
del animal durante la fase aguda de la enfermedad, as como la deteccin de anticuerpos
producidos contra estos antgenos. No obstante, muchos ensayos moleculares requieren de la
extraccin y purificacin del genoma viral como paso previo a la realizacin de la prueba de
identificacin bien sea su finalidad diagnstica o de investigacin. En algunos casos, es
posible identificar la etiologa mediante la visualizacin del(los) componente(s) genmico(s)
de un virus a travs de electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida e incluso su
tipificacin, una vez que se ha extrado el acido nuclico que lo compone, principalmente los
virus con genoma de doble cadena.
El genoma viral puede ser de tipo ADN o ARN, de cadena doble o de cadena sencilla. Segn
sea el caso se requerir de un procedimiento apropiado que permita la extraccin del acido
nuclico, libre de protenas y lpidos de la envoltura, en el caso que el virus sea envuelto.

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 Existen diversos mtodos a travs de los cuales es posible la extraccin y purificacin de
acido nuclico, ya sea de origen viral, bacteriano, parasitario, mictico, clulas animales, de
plantas, etc. Entre los ms utilizados se encuentran aquellos que utilizan agentes caotrpicos
conjuntamente con la propiedad de partculas de slica para unir cido nuclicos bajo
condiciones particulares. Otros utilizan mezclas de solventes orgnicos que permitan disolver
la envoltura y desestabilizar la cpside y nucleocpside de manera de liberar el cido nuclico
que se encuentra en su interior. Hoy en da se dispone de ensayos que permiten la extraccin
de cidos nucleicos de cualquier tipo de muestra, ya sea, sangre, saliva, heces, orina, etc. Sin
embargo, el procedimiento a seguir depender entonces del tipo de acido nuclico que se
desee extraer, en este caso depender del tipo de genoma que posea el virus.

Extraccin de ARN, mtodo Fenol/Cloroformo con Trizol LS

El Trizol LS es una solucin monofsica de fenol e isotiocianato de guanidinio, durante el
paso de homogenizacin o lisis se debe mantener la integridad del ARN mientras se rompen o
lisan las clulas y se disuelven los componentes celulares. La adicin de cloroformo, seguida
de centrifugacin separa la solucin en una fase acuosa y una fase orgnica. El ARN se
mantiene exclusivamente en la fase acuosa. Despus de transferir la fase acuosa, el ARN es
recuperado por precipitacin con isopropanol (hasta una concentracin final de 45%). Una
vez removida la fase acuosa, el ADN y protenas de la muestra pueden recuperarse a travs de
precipitaciones y centrifugaciones secuenciales. La precipitacin con etanol permite extraer el
ADN y la precipitacin posterior con isopropanol permite la extraccin de protenas, de la
interfase orgnica.
En este caso, es de nuestro inters la obtencin de ARN total libre de ADN y protenas. As,
se obtiene ARN una variedad de tipos de molculas de ARN de pequeo y de gran tamao. El
ARN extrado puede ser utilizado para Northern blot, hibridacin dot blot, traduccin in vitro,
clonamiento, PCR y visualizacin de segmentos genmicos, por ejemplo. El ARN puede ser
extrado a partir de fluidos biolgicos, tejidos, monocapas de clulas y clulas en suspensin.
Reactivos
Trizol LS
Cloroformo
Isopropanol
Etanol 75%
Agua libre de RNasa
Muestra: fluido biolgico (en este caso clarificado de heces)

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 Procedimiento
Preparacin del clarificado: para llevar a cabo la extraccin de ARN total a partir de
muestras de heces, se requiere de la preparacin de un clarificado fecal a partir de
suspensiones fecales al 10% p/v de cada una de muestras recolectadas. Dicha suspensin se
prepara en tubos eppendorf de 1,5ml usando agua bidestilada o fosfato buffer salino (PBS).
Las suspensiones se someten a homogenizacin fuerte durante 10min en vortex y se clarifican
por centrifugacin a 14000rpm por 5min, a temperatura ambiente.
Para ello: Se pesan 0,1gr de la muestra y se homogeniza en 1ml de agua bidestilada o PBS y
luego se centrifuga. La preparacin quedara separada en dos fases, se recupera la fase acuosa
(clarificado) en la porcin superior del preparado.

Extraccin de ARN propiamente dicha

1. Homogenizacin
- Por cada 0,25ml de muestra se agrega 0,75ml de Trizol LS. La relacin
Trizol:muestra siempre debe ser 3:1, a excepcin de fluidos biolgicos como
sangre que debe ser 1:1, debido al alto nivel de material contaminante.
La muestra y el trizol deben mezclarse pasando el fluido varias veces por la punta
de la micropipeta. Se incuba durante 5minutos entre 15C a 30C para permitir la
completa disociacin de los complejos nucleoproticos.
- Agregar 0,2ml de cloroformo por cada 0,75ml de Trizol LS, cerrar completamente
los tubos y mezclar vigorosamente por 15 segundos, luego incubar entre 15C y
30C durante 2 a 15minutos.
- Centrifugar las muestras a no ms de 12000 x g durante 15 minutos entre 2C y
8C. Seguido de la centrifugacin, la mezcla se separara en una fase roja en el
fondo del tubo (fase fenol-cloroformo), una interfase y una fase incolora en la
porcin superior del tubo (fase acuosa). El volumen de la fase acuosa es cerca del
70% del volumen de Trizol LS utilizado en la homogenizacin.
2. Precipitacin de ARN
- Se transfiere la fase acuosa a un tubo nuevo (la fase orgnica puede guardarse
para la extraccin de ADN o protenas si se requiere).
- El ARN se precipita de la fase acuosa mezclando con isopropanol.
- Se agregan 0,5ml de isopropanol por cada 0,75ml de Trizol LS usado en la etapa
inicial de homogenizacin.
- Se incuban las muestras entre 15C a 30C por 10 minutos.

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 - Centrifugar a no ms de 12000 x g por 10 minutos entre 2C y 8C.
El ARN precipita, a menudo visible antes de la centrifugacin, forma un sedimento a
manera de gel a un lado y en el fondo del tubo.
3. Lavado del ARN
- Una vez precipitado el ARN, se retira con la micropipeta el sobrenadante. El ARN
precipitado adherido a las paredes y fondo del tubo se lava una vez con etanol
75%, agregando por lo menos 1ml de etanol 75% por cada 0,75ml de Trizol LS
utilizado durante la etapa inicial de homogenizacin.
- Se mezcla la muestra haciendo uso del vortex y se centrifuga a no ms de 7500 x g
durante 5 minutos entre 2C y 8C.
4. Resuspensin del ARN
- Al final del procedimiento, se elimina el etanol 75% usado para el lavado del
ARN.
- El ARN se debe secar ligeramente al aire o al vacio entre 5 y 10 minutos. No se
debe dejar secar completamente ya que esto disminuye su solubilidad.
- Una vez seco el ARN, se resuspende en agua libre de RNasa pasando la solucin
varias veces a travs de la punta de la micropipeta.
- Se incuba entre 55C y 60C durante 10 minutos.
- El ARN extrado puede ser utilizado de inmediato o almacenado a -20C hasta su
uso.

Extraccin de ADN, mtodo Fenol/Cloroformo con Trizol LS

El fundamento de la extraccin de ADN viral por este mtodo es el mismo explicado para
ARN. La principal diferencia se presenta en el proceso de precipitacin del ADN y los
sucesivos lavados que se realizan.
Reactivos
Trizol LS
Etanol 100% y 75%
0,1M Citrato de sodio en etanol
8mM NaOH
Muestra: fluido biolgico (en este caso clarificado de heces)
1. Homogenizacin
Este paso se realiza exactamente igual que para el caso de ARN.

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 2. Precipitacin de ADN
- Una vez homogenizada la muestra y separada por centrifugacin en la fase acuosa
y la fase orgnica, se remueve con micropipeta la fase acuosa ubicada encima de la
interfase orgnica.
- Para precipitar el ADN se agregan 300ul de etanol 100% por cada 750ul de trizol
utilizado en la homogenizacin inicial. Se mezcla la muestra por inversin.
- Luego, se incuba la muestra entre 15-30C durante 2-3minutos.
- El ADN se sedimenta por centrifugacin a 2000 x g durante 5 minutos entre 2
8C.
3. Lavado de ADN
- Con una micropipeta se elimina el sobrenadante que corresponde a la mezcla
fenol-etanol. Esta mezcla tambien puede reservarse para extraer protenas.
- El ADN sedimentado se debe lavar dos veces con una solucin de 0,1M de citrato
de sodio en etanol 10%. Para ello se utiliza 1ml de esta solucin por cada 750ul de
trizol utilizado inicialmente. Durante cada lavado el ADN debe mantenerse en esta
solucin por 30 minutos entre 15 30C con mezclado peridico.
- Luego, se centrifuga a 2000 x g durante 5 minutos entre 2 8C.
- Finalizados estos dos lavados se agrega 1,5ml de etanol 75% y se mantiene
durante 10 20 minutos entre 15 - 30C, con mezclado peridico. Luego se
centrifuga a 2000 x g durante 5 minutos entre 2 8C. Eliminar el sobrenadante
con micropipeta.
4. Resuspensin del ARN
- Secar brevemente el ADN al vaco y disolver en 8mM NaOH pasando suavemente el
sedimento a travs de la pipeta. Generalmente se utiliza entre 300 y 600ul de la solucin
de NaOH.

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