I.

JUDUL : Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

II. TUJUAN
1. Menentukan komposisi eluen yang tepat dengan metode cincin terkonsentrasi.
2. Menentukan nilai Rf dari zat warna pada tanaman dengan menggunakan pelat
KLT.

III. DASAR TEORI

Dasar pemisahan pada KLT = Kromatografi Kertas Tipis atau TLC = Thin
Layer Chromatography adalah perbedaann kecepatan migrasi di antara fasa diam
yang berup0a padatan dan fasa gerak yang merupakan campuran solven (eluen)
yang juga istilah pelarut pengembang campur. Pada prinsipnya, KLT sama dengan
kromatografi kertas, hanya saja sebagai fasa diam digunakan lapis tipis adsorben
yang disalutkan pada sebuah pelat dari kaca, aluminium foil tebal, atau plastik
sebagai pengganti kertas.
Pelat KLT dibuat dengan mencampurkan adsorben dengan suatu bahan
pengikat, misalnya Kalsium sulfat (gips) dan air sehingga menjadi suatu bahan
kental dan menyalutkannya pada pelat dengan ketebalan sekitar 0,1 0,25 mm
(untuk tujuan analitik) atau sekitar 1 2 mm (untuk KLT preparatif). Setelah itu
pelat dikeringkan dan kemudian diipanaskan dalam oven pada suhu 110 0 C selama
beberapa jam untuk mengaktifkan adsorben tersebut. Barium sulfat, polivinil
alkohol, atau kanji dapat pula dapat berperan sebagai suatu bahan pengikat.
Sebagai adsorben digunakan silika gel, alumina dan serbuk selulosa. Partikel
silika gel mengandung gugus hidroksil di permukaannya yang akan membentuk
ikatan hidrogen dengan molekul molekul polar, sedangkan pada alumina selain
mengandung gugus hidroksil juga mengandung atom atom oksigen. Alumina
lebih disukai untuk memisahikan senyawa senyawa polar lemah, sedangkan
silikia gel lebih disukai untuk memisahkan molekul molekul seperti asam asam
amino dan gula. Kadang kadang magnesium silikat, kalsium silikat dan arang
aktif juga dapat digunakan sebagai adsorben. Kemampuan adsorben untuk
memisahkan berbagai senyawa dipengaruhi oleh jumlah air yang terikat, karena air
terikat sangat kuat pada adsorben, sehingga menghambat terjadinya kesetimbangan
dengan molekul molekul analit. Adsorben tersebut mengalami deaktivasi karena
mengandung air sehingga perlu memanskannya dalam oven untuk mengaktifkan
kembali. Tetapi aktivasi yang terjadi tidak boleh terlalu tinggi karena dapat
mengakibatkan terjadinya penataan ulang (dekomposisi) dari molekul molekul
analit.
Ukuran partikel fasa diam pada KLT lebih kecil daripada ukuran partikel pada
Kromatografi Kertas, sehingga pemisahan akan lebih efisien. KLT digunakan dalam
bidang industri obat obatan untuk uji kemurnian, dalam bidang klinik dan
biokimia untuk pemisahan dan identifikasi asam asam amino.
Analisis dengan KLT diawali dengan pemilihan pelaryt pengembang (eluen)
yang digunakan. Jenias eluen yang digunakan bergantung pada jenis sampel yang
akan dipisahkan. Untuk hidrokarbon, digunakan campuran heksana atau petolium
eter dengan toleuna atau eter dengan toleuna atau eter pada berbagai perbandingan.
Campuran pelarut ini memilki kepolaran sedang . untuk sampel polar digunakan
campuran pearut etil asetat, aseton atau metanol. Dalam kromatografi adsorbsi,
pengelusi eluen naik sejalan dengan polaritasnya (misal dari heksana aseton
alkohol air). Eluen pengembang dapat berupa pelarut utnggal dan campuran
susunan tertentu. Pelarut pelarut harus mempunyai kemurnian yang tinggi.
Terdapatnya sejumlah kecil air atau zat pengototr lainnya dapat menghasilkan
kromatografi yang tidak diharapkan. Eluen yang menyebabkan seluruh noda yang
ditotolkan pada pelat naik sampai batas atas pelat (solven front) tanpa mengalami
pemisahan, dikatakan terlalu polar, apabila noda yang ditotolkan samaa sekali tidak
bergerak, berarti eluen tersebut kurang polar.
Cara termudah untuk memilih jenis eluen yang tepat adalah dengan
menggunakan metode cincin terkonsentrasi. Hasil yang didapatkan dibandingkan
dengan gambar barikut

Noda sampel Kurang polar Cukup polar Terlalu polar

Gambar. Metode cincin terkonsentrasi

 Setelah diketahui pelarut pengemabang yang sesuai, langkah selanjutnya
adalah menyiapkan Chamber. Chamber ini dapat berupa bejana atau gelas atau
botol dari kaca dengan dasar rata. Dasar chamber yang rata berguna agar noda yang
terbnetuk berjalan lurus (tidak miring). Kemudian bagian dalam chamber ini
dilapisi dengan kertas saring yang dipotong sedemikian rupa sehingga menutup
sekeliling chamber dengan tepat. Bagian atas chamber yang tidak tertutup kertas
saring sekitar 2 3 cm. Ini dilakukan untuk mengetahui apakah chamber telah
jenuh dengan uap dari pelarut pengembang. Jika telah basah, berarti chamber telah
jenuh denngan uap.
Sebelum digunakan, kertas saring di dalam chamber tersebut perlu dibasahkan
dengan uap dari campuran pelarut pengembang. Volume pelarut di dalam chamber
pada saat chamber tersebut telah jenuh dengan uap, harus sekitar 5 mm dari dasar
chamber. Bagian atas chamber harus ditutup selama proses penjenuhan dan
pengembangan sampel. Untuk penutup dapat digunakan aluminium foil atau pelat
kaca.
Mula mula pelat tersebut diberi tanda garis dengan pensil berjarak sekitar 1
cm dari bagian bawah dan 0,5 cm dari bagian atas. Setelah itu sampel yang akan
diuji ditotolkan sepanjang garis tersebut dengan jarak antar noda sekitar 0,5 1,0
cm. Selanjutnya pelat tersebut dimasukkan ke dalam chamber yang berisi pelarut
pengembang campur (eluen) yang telah dijenuhkan. Penempatan pelat
tersebutdilakukan dengan hati hati sehingga lapisan tipis pada fasa diam pelat
tidak bersentuhan dengan kertas saring di dalam chamber dan noda yang ditotolkan
tidak terkena pelarut.
Setelah pelat ditempatkan denngan benar, chamber ditutup dan biarkan eluen
merambat naik secara kappiler. Setelah eluen mencapai batas atas pelat, maka pelat
segera diangkat dan noda yang terbentuk diberitanda dengan pensil, kemdian diukur
Rf-nya. Besaran Rf menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fasa diam. Rf
juga disebut faktor retensi atau faktor refensi atau faktor retardasi. Harga Rf
dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak yang
ditempuh oleh eluen (fasa gerak). Harga Rf dapat dirumuskan sebagai berikut :
 jarak yang ditempuh oleh komponen
Rf = jarak yang ditempuh eluen

Setiap komponen mempunyai harga Rf masing masing. Dengan

menggunakan zat baku, noda dapat diidentifikasi. Bila warna noda tiak dapat
terlihat, langkah pertama yang harus dilakukan menampakkan noda tersebut. Untuk
menampakkan noda, dapat dilakukan dengan cara berikut :
1. Menyemprotkan kertas dengan pereaksi penimbul warna seperti
ditizon, ninhidrin, kalium kromat, amonium sulfonat dan lain lain.
2. Menyinari kertas dengan sinar ultra violet.
3. Mendedahkan kertas pada uap iodium.
4. Harga Rf dari masing masing noda dapat ditentukan.

IV. ALAT DAN BAHAN

1. Alat :
Pelat KLT berukuran 5x2 cm 1 lembar
Pelat KLT berukuran 3x5 cm 1 lembar
Pipa kapiler 8 buah
Gelas dengan dasar rata (lurus) sebagai chamber 1 buah
Gelas kimia 50 mL 2 buah
Gelas ukur 10 mL 1 buah
Corong pemisah 1 buah
Spatula 1 buah
Vial-vial 6 buah
Kertas saring Whatman secukupnya
Pelat kaca 1 buah
Pipet tetes 6 buah
Pinset panjang 1 buah
Palet 1 buah
Statif dan klem 1 buah
 2. Bahan :
Metanol 25 mL
Daun pandan betawi yang sudah diblender kering 25 gram
Diklorometana 25 mL

V. CARA KERJA

1. Persiapan Sampel
Pertama, 25 gram daun pandan betawi yang telah diblender direndam dalam
25 mL metanol dengan mengaduk-aduk agar terendam sempurna, kemudian
diambil filtrat dari campuran daun pandan betawi dengan metanol. Filtrat
dimasukkan ke dalam corong pisah dan ditambakan 25 mL diklorometana, lalu
campuran didalam corong pisah dikocok dengan arah yang sama sambil sesekali
membuka tutup corong pemisah atau diekstraksi. Diamkan campuran hingga
terbentuk dua lapisan. Kemudian mengambil lapisan bawah sebagai pigmen
sampel.

2. Persiapan Pelat
Pertama, pelat KLT ukuran 3x5 cm yang telah dioven selama 10 menit
diberi titik-titik dengan pensil sebanyak 6 titik, lalu dalam penentuan Rf pelat KLT
ukuran 2x5 cm yang juga telah dioven diberi batas dengan pensil, yaitu batas
bawah 1 cm dan batas atas 0,5 cm.

3. Persiapan Eluen
- Cincin terkonsentrasi
Pertama, dicampurkan metanol dan diklorometana dalam vial-vial dengan
perbandingan metanol : diklorometana sebagai berikut:
A. 3 : 7 D. 6 : 4
B. 4 : 6 E. 7 : 3
C. 5 : 5 F. 8 : 2
 - Penentuan Rf
Pertama, kertas saring dimasukkan ke dalam gelas hingga menutupi dinding
dalam gelas, tetapi tidak melebihi bagian atas gelas. Kemudian memasukkan 5
mL campuran eluen dengan perbandingan yang sesuai dan menutup gelas
dengan pelat kaca.

4. Penotolan dan pengembangan sampel

- Cincin terkonsentrasi
Pertama, pigmen sampel ditotolkan pada pelat KLT dengan pipa kapiler
sebanyak 2-3 kali hingga warnanya cukup jelas pada tempat yang sama, lalu
pada setiap noda diberi kode A-F. Eluen pada vial A dengan pipa kapiler pada
noda A, eluan B pada noda B dan seterusnya. Kemudian membandingkan
bentuk cincin yang terjadi dan menentukan eluen yang paling sesuai untuk
sampel.

- Penentuan Rf
Pertama, pigmen sampel ditotolkan sebanyak 2-3 kali pada batas bawah pelat
KLT hingga noda cukup jelas sebanyak 3 noda. Pelat KLT dimasukkan ke dalam
gelas dengan pinset sampai menyentuh dasar gelas dan menutup gelas dengan
pelat kaca. Kemudian pelat diambil, memberi tanda pada noda yang terjadi,
mengeringkan dan menutup noda dengan selotip. Pada setiap noda ditentukan
nilai Rf.
 VI. DATA PENGAMATAN
Dari percobaan yang telah dilakukan diperoleh data sebagai berikut:
HASIL PENGAMATAN
PERLAKUAN
SEBELUM SESUDAH
1. PERSIAPAN SAMPEL
25 gram daun pandan betawi yang telah Daun pandan : hijau Campuran : hijau tua
diblender direndam dalam 25 mL metanol. Metanol : jernih
Mengambil filtrat dari campuran yang telah
berwarna cukup tua. Filtrat : hijau tua
Memasukkan filtrat ke dalam corong pisah,
kemudian menambahkan 25 mL Filtrat : hijau tua Campuran : hijau tua
diklorometana. Diklorometana : jernih

Mengocok campuran dalam corong pisah Campuran : jingga keruh

dengan arah yang sama sambil sesekali Campuran hijau tua

membuka tutup corong pisah.

Mendiamkan campuran hingga terbentuk dua Lapisan atas : kuning

lapisan, lalu mengambil lapisan bawah Campuran : hijau tua kecoklatan

sebagai pigmen sampel. Lapisan bawah : hijau tua

2. PERSIAPAN PELAT
Memberi titik-titik dengan pensil pada pelat - -
3x5 cm yang telah dioven selama 10 menit,
sebanyak 6 titik (untuk metode cincin
terkonsentrasi).
Pelat KLT 2x5 cm yang telah dioven diberi - -
batas dengan pensil, batas bawah 1 cm dan
batas atas 0,5 cm (untuk penentuan Rf).
3. PERSIAPAN ELUEN
a. Cincin terkonsentrasi
Mencampurkan metanol dan diklorometana Metanol : jernih Pada berbagai
dalam vial-vial dengan perbandingan metanol Diklorometana : jernih / tak perbandingan, campuran
: diklorometana sebagai berikut: berwarna tetap jernih tak berwarna
A. 3 : 7 D. 6 : 4
B. 4 : 6 E. 7 : 3
C. 5 : 5 F. 8 : 2
b. Penentuan Rf
Memasukkan kertas saring hingga menutupi Eluen : jernih tak berwarna Kertas saring basah
dinding dalam gelas, tetapi tidak melebihi Jenis eluen : eluan dari vial seluruhnya
 bagian atas gelas., kemudian memasukkan 5 B
mL campuran eluen dengan perbandingan
yang sesuai. Lalu menutup gelas dengan pelat
kaca.
4. PENOTOLAN DAN PENGEMBANGAN
SAMPEL
a. Cincin terkonsentrasi

Menotolkan pigmen daun pandan betawi 2 - Noda : hijau kekuningan

3 kali denngan pipa kapiler pada 6 titik yang

telah diberi tamda pada pelat KLT, masing
masing A, B, C, D, E, F
A = 3:7 , B = 4:6 , C= 5:5 , D= 6:4 ,
E = 7:3 , F = 2:8 - Eluen pada tiap noda

Mengambil eluen dengan pipa kapiler: menyebar ke samping

- Vial A ditotolkan pada noda A

- Vial B ditotolkan pada noda B - Eluen vial A kurang polar

- Vial C ditotolkan pada noda C Eluen vial B cukup polar

- Vial D ditotolkan pada noda D Eluen vial C terlalu polar

- Vial E ditotolkan pada noda E Eluen vial D terlalu polar

- Vial F ditotolkan pada noda F Eluen vial E terlalu polar

Eluen vial F kurang polar
b. Penentuan Rf
Menotolkan sampel pada pelat KLT dengan - Noda : hijau muda

pipa kapiler sebanyak 2-3 kali pada batas

bawah hingga noda cukup jelas sebanyak 3
noda.
Memasukkan pelat KLT ke dalam gelas Titik noda : hijau tua -

dengan pinset sampai menyentuh dasar gelas,

menutup gelas dengan pelat kaca hingga
eluen mengembang menyentuh batas atas.
Mengambil pelat KLT, memberi tanda pada R fx 0,6190
- R fy 0,5741
noda yang terjadi, mengeringkan dan
R fz 0,5524
menutup noda dengan selotip.
R f rata rata 0,5809
Menentukan nilai Rf tiap noda.
-

VII. DISKUSI DAN PEMBAHASAN

A Pembahasan
 Daun pandan betawi yang telah diblender kering ditambah dengan metanol.
Fungsi penambahan metanol pada daun pacar adalah untuk melarutkan pigmen yang
terkandung di dalamnya. Setelah itu dilakukan pemisahan (pengabilan filtrat) dengan
menggunakan sendok. Hal ini dilakukan karena pelarut yang digunakan adalah
metanol yang mana dalam jangka lama dapat menyebabkan karsinogenik dan
menyebabkan kebutaan. Pemisahan tidak boleh dilakukan dengan kertas saring
karena akan menyaring pigmen.
Filtrat yang dihasilkan tersebut selanjutnya diekstrak dengan menambahkan
diklorometana sebagai pelarut organik yang bersifat non polar di dalam corong pisah,
sehingga warnanya berubah menjadi hijau tua, karena pigmen yang bersifat non polar
terekstrak dan larut dalam diklorometana, sampai terbentuk dua lapisan yaitu lapisan
atas berwarna kuning kecoklatan dan lapisan bawah berwarna hijau tua. Lapisan
bawah ini yang digunakan sebagai pigmen sampel.
Pelat yang akan digunakan dioven dalam suhu 110 0 C selama 10 menit. Hal
ini dilakukan untuk mengaktifkan pelat dan untuk menghilangkan molekul air yang
mungkin terikat dalam pelat yang akan dapat memengaruhi hasil kromatografi dan
hasil Rf .
Langkah berikutnya, menyiapkan eluen dengan mencampurkan metanol dan
diklorometana dalam vial-vial dengan perbandingan sebagai berikut:
A. 3:7 D. 6 : 4
B. 4:6 E. 7 : 3
C. 5:5 F. 8 : 2
Eluen dengan berbagai perbandingan di atas bertujuan untuk memilih eluen yang
paling baik untuk digunakan dalam penentuan Rf.
Pada cincin terkonsentrasi, plat diberi titik-titik dan kode A-F dengan pensil,
karena dengan bolpoin tinta akan ikut tercampur pada eluen. Kemudian menotolkan
sampel pada titik-titik tersebut sebanyak 3 kali dan eluen dengan kode A-F ditotolkan
sesuai dengan kode sampel A-F pada plat. Berdasarkan percobaan diperoleh noda
yaitu pada kode Adan F cenderung bersifat kurang polar, kode B bersifat cukup polar
sedangkan kode C, D, E bersifat terlalu polar. Dengan demikian eluen yang sesuai
adalah kode B.
 Kemudian dalam penentuan Rf keras saring dimasukkan ke dalam gelas yang
tegak, dan permukaaan dalamnya rata, kertas saring tersebut harus sesuai dengan
tinggi gelas. Kemudian memasukkan eluen yang perbandingan sesuai B sebanyak 5
mL dan ditutup dengan pelat kaca yang bertujuan untuk menjenuhkan eluen.
Kejenuhan eluen ditunjukkan dengan kertas saring yang basah seluruhnya, karena
sifat eluen yang mudah menguap. Selanjutnya, pada penentuan Rf pelat diberi tanda
batas atas 0,5 cm dan batas bawah 1 cm. Pelat tersebut diberi 3 titik-titik dengan
pensil dan setiap titik ditotolkan sampel sebanyak 3 kali. Kemudian plat dimasukkan
dalam gelas dengan posisi tegak agar hasil pengembangan sampel tidak miring. Pelat
diambil setelah eluen mencapai batas atas, dengan terbentuknya noda yang bagus,
dikeringkan dan ditutup selotip agar warnanya tidak memudar. Lalu, diukur Rf nya
dan didapat nilai Rf: sebagai berikut:
R fx 0,6190
R fy 0,5714
R fz 0,5524

B Perhitungan
Penentuan Rf
Noda 1
1,8 cm
Rfx (noda 1) = 3,5 cm = 0,5143

2,0 cm
Rfy (noda 1) = 3,5 cm = 0,5714

2,7 cm
Rfz (noda 1) = 3,5 cm = 0,7714

0,5143 0,5714 0,7714

Rf (noda 1) = = 0,6190
3

Noda 2
1,6 cm
Rfx (noda 2) = 3,5 cm = 0,4571
 1,9 cm
Rfy (noda 2) = 3,5 cm = 0,5428

2,5 cm
Rfz (noda 2) = 3,5 cm = 0,7143

0,4571 0,5428 0,7143

Rf (noda 2) = = 0,5714
3
Noda 3
1,4 cm
Rfx (noda 3) = 3,5 cm = 0,4000

1,6 cm
Rfy (noda 3) = 3,5 cm = 0,4571

2,4 cm
Rfz (noda 3) = 3,5 cm = 0,8000

0,4000 0,4571 0,8000

Rf (noda 3) = = 0,5525
3

C. Diskusi
Dari percobaan diperoleh noda yang tidak bagus, yaitu noda tidak
mengembang dengan sempurna (tidak bergerak menurut garis lurus). Hal tersebut
disebabkan oleh beberapa hal antara lain:
1. Kertas saring yang digunakan kertas saring biasa seharusnya yang digunakan
adalah kertas saring Whatman. Dengan kertas saring biasa yang mempunyai pori-
pori lebih besar daripada kertas saring Whatman, sehingga kertas saring cepat
basah padahal eluen dalam chamber kemungkinan belum jenuh.
2. Pada pelat yang digunakan terdapat tinta bolpoin dari menggarisi pelat sebelum
dipotong. Hal ini menyebabkan proses pengembangan eluen terganggu karena
eluen terkontaminasi.
3. Bagian dasar dari gelas yang diginakan ternyata tidak rata, hal ini menyebabkan
noda yang dihasilkan tidak dapat lurus dan memberikan hasil yang kurang
maksimal.
4. Bagian bawah dari pelat yang digunakan miring, sehingga noda yang dihasilkan
juga miring.
 5. Kocokan dalam ekstraksi oleh diklorometana kurang maksimal sehingga pigmen
yang terekstrak juga kurang sempurna.

VIII. SIMPULAN
Dari percobaan yang telah dilakukan didapat simpulan sebagai berikut:
1. Komposisi eluen yang sesuai untuk sampel pandan betawi berdasarkan metode
cincin terkonsentrasi adalah eluen dengan kode vial B yaitu campuran dengan
perbandingan 4:6.
2. Nilai Rf sampel dapat ditentukan menggunakan pelat KLT, yaitu R fx 0,4857 ,

R fy 0,5238 dan R fz 0,7619 dan nilai Rf dari masing masing noda adalah
sebagai berikut :
- Rf (noda 1) = 0,6190
- Rf (noda 2) = 0,5714
- Rf (noda 3) = 0,5525

IX. JAWABAN PERTANYAAN

1. Apa yang terjadi jika eluen yang digunakan sebagai pelarut pengembang pada KLT
terlalu polar atau kurang polar? Mengapa?
Jika eluen yang digunakan sebagai pelarut pengembang pada KLT terlalu polar akan
menyebabkan noda merambat naik terlalu cepat atau noda berlari, sedangkan jika
eluen yang digunakan sebagai pelarut pengembang pada KLT kurang polar akan
menyebabkan noda sama sekali tidak bergerak.
2. Apa fungsi kertas saring pada percobaan penentuan Rf ?
Fungsi dari kertas saring adalah untuk mengetahui eluen dalam chamber sudah jenuh
ataukah belum. Jika seluruh kertas saring telah basah, maka eluen dalam chamber
telah jenuh karena sifat eluen yang mudah menguap dan uap itulah yang membasahi
seluruh bagian dari kertas saring.
3. Mengapa permukaan pelat KLT tidak boleh rusak?
Karena jika permukaan pelatKLT rusak, maka eluen akan terhambat naik dan noda
juga akan terhalang sehingga hasil dari kromatografi juga tidak akan maksimal.
4. Mengapa pelat yang digunakan harus dikeringkan dulu dalam oven?
 Karena dalam pelat sangat mungkin terdapat molekul air yang terikat yang akan
menghalangi proses pengembangan sampel, sehingga untuk menghilangkan molekul
air inilah dilakukan pengeringan dalam oven selain juga untuk mengaktifkan daya
serap pelat terhadap eluen.
5. Mengapa batas atas dan batas bawah pelat harus diberi tanda dengan pinsil?
Pemberian tanda berupa garis adalah untuk meluruskan totolan noda, sehingga eluen
yang naik membawa sampel juga akan sama. Sedangkan penggunaan pensil adalah
karena noda pensil tidak akan ikut terbawa oleh eluen, sehingga noda dari sampel
tidak akan terkontaminasi. Jika digunakan bulpoin, maka tinta dari bulpoin akan
terbawa eluen (ikut terelusi) dan noda juga akan terpengaruh, sehingga hasil
kromatografi juga akan jadi kurang maksimal.

DAFTAR PUSTAKA
.

Azizah, Utiya, dkk. 2007. Panduan Praktikum Mata Kuliah Kimia Analitik II: Dasar-

Dasar Pemisahan Kimia. Surabaya: UNESA University Press.

Sianita, Maria Monica. 2006. Kromatografi. Surabaya: UNESA University Press.

Soebagio, dkk. 2002. Kimia Analitik II. Malang : Universitas Negeri Malang Press.