Recibido:
31 de marzo de 2017
Aceptado:
19 de julio de 2017
Publicado en lnea:
21 de agosto de 2017
Abstracto
Introduccin
Resultados
Figura 1
El calcio extracelular modula la diferenciacin de los adipocitos
marrones. ( A ) Recorrido temporal del contenido lipdico de adipocitos
marrones diferenciados in vitro . Las clulas se trataron con 1,8 mM
(control), 10 mM de magnesio, 10 mM de calcio o calcio medio libre
durante 8 das (da 0-8), slo durante la induccin (da 0-2), o despus
de la induccin (da 2-8 ). Se muestran los contenidos de lpidos
sustrados de fondo, medidos por Oil Red O (500 nm) (n = 6) e
imgenes representativas de clulas teidas al da 8 despus del
control o tratamiento con calcio 10 mM. (Barra de tamao = 20 \ mu
m). ( B ) expresin de PPAR normalizada en TBP durante un curso de
tiempo de ocho das en las condiciones anteriores (n = 5). ( C) Western
Blot para PPAR y -actina durante el transcurso de ocho das de
diferenciacin con calcio normal 1,8 mM (control), calcio 10 mM
(Ca2 ), magnesio 10 mM (Mg2 ) y medio libre de calcio durante la
+ +
indicada puntos de tiempo. ( D ) La expresin gnica de los
marcadores osteognicos ColI y Runx2, as como los marcadores
musculares ACTA2 y MyoD normalizaron en TBP durante el transcurso
del tiempo de diferenciacin de ocho das en las condiciones indicadas
(n = 3). Para ( A , B y D ) los datos se muestran como media
SEM. ANOVA bidireccional con la prueba posthoc de Dunnett ( A , B ) y
la prueba posthoc de Tukey ( D); P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, ****
p <0,0001. Las imgenes completas de Western Blot se proporcionan
en la Informacin Complementaria.
Figura 2
El calcio extracelular regula las MAPKs y la actividad de C / EBP
independientemente del calcio intracelular. ( A ) expresin de C / EBP
y C / EBP normalizada a TBP durante las primeras 48 horas de
diferenciacin en 1,8 mM de calcio (control), 10 mM de magnesio, 10
mM de calcio y libre de calcio medio (n = 6). ( B ) Western Blot para
fosfo- (Thr235) / C / EBP total as como fosfo / total ERK y fosfo-
(Ser473) / AKT total durante las primeras 48 horas de diferenciacin
bajo 1,8 mM de calcio (control), 10 mM Magnesio (Mg2 ) y 10 mM de
+
para ERK y -Actina fosfo- y total como control de carga de los ciclos
de 8 das de tiempo bajo control (1,8 mM de calcio), 10 mM de calcio y
10 mM de magnesio, as como condiciones de control y libres de calcio
durante la duracin indicada . ( D ) El aumento relativo de calcio
intracelular en preadipocitos marrones se mantuvo en 1,8 mM de calcio
(control) o 10 mM de calcio directamente y 10 minutos despus de la
inyeccin de IBMX o mezcla de induccin mostrada como incremento
porcentual de fluorescencia al nivel basal. Las clulas se cargaron con
el fluorforo de unin de calcio Fluo-4 (4 M) y la fluorescencia se
registr en Ex / Em = 485/520 en promediacin orbital (n = 3 con 3-4
repeticiones cada una). ( E) La expresin de PPAR se normaliz en
TBP en preadipocitos (da 0) y clulas diferenciadas en da 8 tratadas
da 0-8 con 1,8 mM de calcio (Da de control 0-8) o 10 mM de calcio (10
mM Ca da 0-8) suplementado Con DMSO, ionomicina (2 M) y / o el
2+
figura 3
El calcio extracelular modula la identidad de los adipocitos marrones y
los marcadores termognicos. ( A ) La expresin de UCP1 y PRDM16
normaliz a TBP de preadipocitos diferenciados in vitro en un curso de
tiempo de ocho das bajo condiciones normales de calcio 1.8 mM
(control), 10 mM de calcio, 10 mM de magnesio y libre de calcio
durante los das 0-8 y los das 0 -2 (UCP1, PRDM16 n = 5). ( B )
expresin de UCP1, PGC1- y PRDM16 normalizada en TBP en estos
diferentes grupos de tratamiento durante los das 2-8 (UCP1, PRDM16
n = 7, PGC1- n = 4). ( C ) Western Blot para UCP1 y -actina durante
el curso de tiempo de diferenciacin de ocho das con calcio normal 1,8
mM (control), calcio 10 mM (Ca2 ), magnesio 10 mM (Mg2 ) O medio
+ +
Discusin
Quedan por determinar las seales aguas arriba que median la mayor
fosforilacin de ERK. En el contexto del calcio, es factible especular que la
calcineurina fosfatasa sensible al calcio, que se sabe que modula la actividad
ERK 27 , 36 , media estos efectos. Sin embargo, no se detecta un aumento de las
concentraciones intracelulares de calcio en respuesta a un aumento del calcio
extracelular que sera necesario para activar la calcineurina. Adems, la
inhibicin de la calcineurina no restaura la diferenciacin de adipocitos
marrones. Estos resultados estn en lnea con los datos anteriores de Jensen y
colegas que muestran que el alto calcio extracelular inhibe la adipognesis en
3T3-L1 clulas sin aumentar los niveles intracelulares [ 29], Lo que sugiere que
el calcio extracelular acta fuera de la clula para modular la actividad de las
protenas transmembrana. El receptor de deteccin de calcio acoplado a
protena G (CaSR), por ejemplo, se mostr que se expresaba en adipocitos y
activaba cascadas de sealizacin intracelular, especialmente ERK sobre unin
de calcio 46. Sin embargo, no se detect la expresin de CaSR en ni adipocitos
marrones aislados ni en nuestro modelo celular. Adems, no se observ un
aumento en el calcio intracelular asociado con la activacin CaSR. Por lo
tanto, aunque la implicacin de este receptor parece ser muy improbable, es
presumible que el calcio promueva la unin del receptor a ligandos, tales como
integrinas o cadherinas, lo que a su vez alterara la sealizacin
intracelular. En general, nuestros datos sugieren un papel muy general del
calcio extracelular durante la fase temprana de la diferenciacin de los
adipocitos, que parece conservarse entre los adipocitos blancos y marrones. En
futuros estudios, tambin se puede abordar por qu los adipocitos derivados de
mdula sea parecen responder de manera diferente.
Mtodos
Aislamiento celular y cultura
Se aislaron preadipocitos marrones de acuerdo con 48De adultos de ocho
semanas de edad C57Bl / 6 ratones. En detalle, se diseccion tejido adiposo
pardo murino (BAT) de la regin interescapular de ratn, se cort en trozos de
~ 1 mm y se digiri durante 30-45 minutos a 37C en DMEM que contena 1
mg / ml de colagenasa tipo IV (Gibco) y 10 mg / Ml de BSA (fraccin de
albmina V, Roth). La digestin se detuvo lavando las clulas con PBS
(Gibco) que contena 10 mg / ml de BSA. Se eliminaron los adipocitos
maduros y se cultivaron preadipocitos en medio Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM + GlutaMAX + glucosa alta, Gibco). Se inmortalizaron las
clulas utilizando un retrovirus T grande SV40 ecotrpico. Los experimentos
con animales se realizaron de acuerdo con la ley alemana de bienestar animal.
QPCR
La extraccin de RNA (RNeasy Mini Kit, Qiagen) y la sntesis de cDNA (0,5-
1 \ mu g de ARN total, Kit de Transcripcin Reverse Transcription cDNA de
Alta Capacidad, Applied Biosystems) se realizaron de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. El qPCR se realiz en un termociclador tctil
C1000 (Bio Rad), utilizando cebadores directos e inversos de 300 nM y una
supermezcla iTaq Universal SYBR Green (BioRad). La expresin del gen de
destino se normaliz en la expresin de la protena de unin a la caja de TATA
del gen de limpieza (TBP) [ 49] . Las secuencias de cebadores se muestran en la
Tabla 1 complementaria . Los clculos para la expresin relativa (RE) de los
genes de inters (GOI) se realizaron de la siguiente manera: 2 CT (TBP) -CT (GOI) .
Mancha occidental
Las clulas se lisaron en Tris 25 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%,
EDTA 1 mM, glicerol al 5%, SDS al 0,1% que contena inhibidor de proteasa e
inhibidores de fosfatasa (Sigma). Se cargaron 15-20 g de protena (15-30 g
para la deteccin de UCP1) en geles de SDS prefabricados de 4-12%
(Invitrogen) o en geles de SDS de acrilamida al 10% y se transfirieron sobre
membranas de PVDF de 0,45 m, las cuales se bloquearon en 5 % De BSA en
TBS con Tween 20 al 0,1% (TBS-T) una hora a temperatura ambiente (2 horas
para UCP1). Las membranas se incubaron con anticuerpos primarios (lista en
la Tabla Suplementaria 2) Durante la noche a 4C, se lavaron en TBS-T y se
incubaron con los anticuerpos secundarios acoplados a HRP apropiados una
hora a temperatura ambiente. Las membranas se desarrollaron con un sustrato
de HRP quimioluminiscente (Immobilon Western, Millipore) usando pelculas
(Hyperfilm ECL, GE Life Sciences, CL-XPosure Film, Thermo Scientific). La
cuantificacin de Western Blots se realiz utilizando el software ImageJ.
Ensayo de lactato
Las clulas se diferenciaron en 1,8 mM de calcio (control) o para el da 2-8 en
alto de calcio (10 mM) medio. El sobrenadante de clulas al da 8 se diluy y
se midi el lactato con el Kit de Ensayo Colorimtrico / Fluoromtrico de
Lactato (Biovision).
Anlisis estadstico
Los datos se presentan como medias SEM. Todos los anlisis estadsticos se
realizaron con GraphPad Prism. Las muestras se sometieron a prueba para la
distribucin normal con la prueba de normalidad de D'Agostino-Pearson, la
prueba de normalidad de Shapiro-Wilk o la prueba de Kolmogorov-Smirnov
con Dallal-Wikinson Lillie para el valor de P. Las pruebas paramtricas o no
paramtricas se realizaron segn lo indicado en las leyendas de la figura. La
prueba t de Student de dos colas, ANOVA unidireccional y bidireccional para
comparaciones mltiples se utilizaron con el nivel a 0,05 para determinar los
valores de P.
Disponibilidad de datos
Los conjuntos de datos generados durante y / o analizados durante el presente
estudio estn disponibles en el autor correspondiente a peticin razonable.
Informacin Adicional
Nota del editor: Springer Nature permanece neutral con respecto a las
reclamaciones jurisdiccionales en los mapas publicados y en las afiliaciones
institucionales.
Referencias
1. 1.
o Mostrar contexto
o
o
CAS
Artculo
PubMed
2. 2.
3. 3.
5. 5.
6. 6.
PubMed
7. 7.
8. 8.
9. 9.
10. 10.
12. 12.
13. 13.
14. 14.
15. 15.
16. 16 diecisis.
17. 17.
18. 18.
Agata, U. et al . Home Idiomas Ingresar a Epistemonikos Bsqueda
avanzada El efecto de diferentes cantidades de ingesta de calcio en el
metabolismo seo y calcificacin arterial en ratas
ovariectomizadas. Revista de Ciencias de la Nutricin y Vitaminas 59 ,
29-36 (2013).
19. 19.
20. 20.
21. 21.
22. 22.
23. 23.
24. 24.
25. 25.
27. 27.
28. 28.
29. 29.
30. 30.
31. 31.
32. 32.
33. 33.
34. 34.
35. 35.
36. 36.
37. 37.
38. 38.
40. 40.
41. 41.
42. 42.
43. 43.
44. 44.
45. 45.
Bost, F., Aouadi, M., Caron, L. y Binetruy, B. El papel de las MAPKs
en la diferenciacin de los adipocitos y la obesidad. Biochimie 87 , 51 -
56, doi: 10.1016 / j.biochi.2004.10.018 (2005).
46. 46.
47. 47.
48. 48.
49. 49.