REPRODUCCIN ASISTIDA EN EL VACUNO DE LECHE

Congelacin

J. De la Fuente
INIA Reproduccin Animal y
Conservacin Recursos Zoogenticos
jfuente@inia.es

Mster Interuni versitario en Zootecni a y Gestin Sostenible:

ganadera ecolgica e integrada.

Instituto de Estudios de Postgrado

Universidad de Crdoba Crdoba , Mayo 2009
TRANSFERENCIA DE EMBRIONES BOVINOS

SELECCIN DE DONANTES

SUPEROVULACIN

MANIPULACIN:
OBTENCIN
EVALUACIN
CONSERVACIN

TRANSFERENCIA
Que es la criopreser vacin?
Enfriamiento reversible de clulas hasta una
temperatura en la cual cesa la actividad biolgica.

3 pasos:
* Preparacin y enfriamiento
* Conservacin a baja temperatura
* Descongelaci n
 Mecanismos de da o celular durante la
criopreservaci n

Formacin de cristales de hielo

Dao osmtico
Efecto txico del crioprotector
Fractura de la zona y del embrin
Dao en las organelas intracelulares
Ruptura de los contactos entre clulas
 CRIOPROT ECTORES
Son necesarios en las soluciones de congelacin para prevenir el dao celular
durante la congelacin y descongelacin.

Grupos de crioprotectores:

1.- De bajo Pm y permeables , como: Etilenglicol, 1-2 Propanodi ol, Glicerol y otros.
- Reemplazan el agua intracelular minimizando la formacin de cristales.
- Regulan la deshidratacin y protegen la estructura proteica.

2.- De bajo Pm y no permeables , como: Glucosa, Sacarosa y otros azucares.

- Deshidratan las clulas antes de la congelacin minimizando la formacin de cristales.
- Estabilizan la estructura de la membrana.

3.- De alto Pm no permeables , como: Polivinilpirrolidona, Polivinil alcohol

y otros polmeros como el Ficol.
- Protegen en congelacin/descongelacin alterando el tamao y la forma de los cristales.

En la congelacin se utilizan concentraciones del ~10% de crioprotectores

En la vitrificacin se utilizan mezclas de altas concentrac iones de crioprotectores;
etilenglicol, glicerol y propanodiol ~40%, en combi nacin con azucares
 Adicin del crioprotector a la congelacin

Glicerol
Obtenci n

Glicerol
Sacarosa

Etilenglicol
Equilibrio Osmtico y formacin de cristales en la congelacin

H 2O
20C H 2O
-5C

Enfriamiento
Rpido Lento
H 2O H 2O
H 2O H 2O
H 2O
H 2O H 2O
Supervivencia

H 2O H 2O H 2O

intracelular
100 100

Hielo
0 0

0.5
Velocid ad (C/min) 1.5
CURVA DE CONGELACI N DE EMBRIONES

INTRODUCCI N EN EL CONGELAD OR
20
CRISTALIZACIN
10
TEMPERATURA

0
-6,5 -6,5
-10
8 8
0,5C/mi.
-20

-30
-35
-40
0' 16' 73'= 1h 13' LN 2
8
TIEMPO
 CURVA DE DESCONGELACI N DE
EMBRIONES
RETIRADA DEL CONGELADOR
20

10
TEMPERATURA

-10

-20

-30
-35
-40

TIEMPO LN2
Retirada del crioprotector a la descongelacin

TE
 DESCONGELACIN DE EMBRIONES

ETILEN GLICOL TRANSFERENCIA

1,5M DIRECTA

CAMBIO DE ESTADO
10 AIRE+
20 H2O A 27C

10% 5 5 5
GLICEROL 6,6% GLICEROL 3,3% GLICEROL 0% GLICEROL 5
+ + + PBS+0,4% BSA
SACAROSA 0,3M SACAROSA 0,3M SACAROSA 0,3M
en PBS+0,4% BSA en PBS+0,4% BSA en PBS+0,4% BSA

8
0% GLICEROL 5
+ PBS+0,4% BSA TRANSFERENCIA
SACAROSA 1M
en PBS+0,4% BSA
 Transferencia de embriones vacunos

Frescos Congelados

C1 C2 Total C1 C2 Total

Descongelados 224 74 298

Degenerados 25 (11%) 30* (40%) 55

TE 33 87 120 199 44 243

Gestaciones 20 53 73 108 23 131

% Gestacin 60.6 61 60.8 54.2 53.8 53.9

*: p<0.001
 RESULTADOS

CALIDAD EMBRIONES PARTOS

TRANSFERIDOS N %

C1 112 51 45,5 a
GLICEROL C2 17 8 47,1
TOTAL 129 59 45,7
C1 103 56 54,4 ab, c
ETILENGLICOL C2 24 6 25 d
TOTAL 127 62 48,8
C1 41 29 70,7 b, e
FRESCO C2+C3 46 18 39,1 f
TOTAL 87 47 54

TOTALES 343 168 48,9

a vs b: P<0.01; c vs d: P<0.01; e vs f: P<0.01

 Vitrificacin
- Es el trmino usado en la criopreservacin a bajas temperaturas creando un estado vitreo
completo (congelamiento sin cristales de hielo). Para suprimir la formacin de cristales
al bajar la temperatura, la solucin ha de alcanzar una alta viscosidad y eventualmente
entrar en una fase vtrea.

- Para lograr la vitrificacin en tasas de enfriamiento prcticas se necesitan concentraciones

multimolares de los crioprotectores permeables (mayor al 30%), la toxicidad de los
solutos involucrados es muy alta.

-Los mtodos para minimizar los efectos txicos de altas concentraciones de crioprotectores,
incluyen:
La equilibracin de los embriones en dos pasos
El equilibrado a bajas temperaturas
La reduccin de los tiempos de equilibrio
El uso de sustancias como la sacarosa que pueden disminuir la toxicidad.
 Vitrificacin

Para alcanzar la vitrificaci n:

Inmersin directa en LN 2 en pajuelas de 0.25 a ~2500 C/mi n.
Altas concentraciones de crioprotectores (del 30%) implican
una alta toxicidad celular al tener que equi librarse con el material biolgico.

Mtodos para disminuir la toxicidad de altas concentraciones de cr ioprotector:

Equilibracin de embriones en dos pasos.
Equilibracin a bajas temperaturas .
Reduccin del tiempo de equi librado.

La formaci n de cristales letales depender de:

El volumen de la muestra a c ongelar.
La velocidad de enfri amiento.
La viscosidad de la solucin.

Mtodos para vitrificar:

Pldoras.
Open pull straw (OPS).
Cryo-loops (CLV).
 Vitrificacin
- Resulta mayor el dao producido por la formacin de cristales durante
la descongelacin que durante l a vitrificacin.

- Incrementar la concentracin de solutos con crioprotectores no permeables

permite poder disminuir los crioprotectores permeables ms txicos.

- La probabilidad de formaci n de cristales es directamente proporci onal al

volumen e inversa a la viscosidad y a la vel ocidad de enfriamiento.

- Una reducc in del volumen de 20 l (pajuelas de 0.25 ml ) a 0.1 l hace

incrementar la velocidad desde 1,200 C/min (inmersin en LN 2 de pajuelas
de 0.25 ml ) a 5.300 C/min (OPS) .

- El mtodo OPS (Vajta, 1998) resulta el mas eficaz actualmente.

Aunque el contacto directo con el nitrgeno es una limitante importante,
por la posible contaminac in.

* En la actualidad aun no se puede abordar c omercialmente la vitrificacin

en las especies domsticas.
 Congelacin rpida

- La congelacin rpida es la criopreservacin de embriones parcialmente

deshidratados antes de aplicarles tasas de enfriamiento de aproximadamente 1.250 C/min.

- Se utiliza una solucin con 2 a 4,5M de un crioprotector permeable (glicerol, propanediol,

DMSO o etilenglicol), y 0,25 a 0,5M de otro no permeable (sacarosa, tetralosa, lactosa).

- Despus de un perodo de equilibracin (30 seg. a 3 min.) los embriones en estado de

deshidratacin parcial se enfran en vapor de nitrgeno antes de sumergirlos en LN2.

- En contraste con la vitrificacin, el agua extracelular se congela y la osmolaridad de la

solucin aumenta, causando la prdida de agua del embrin.

- La congelacin de embriones bovinos ha resultado en tasas de supervivencia

menores (33,3%) cuando se compar con mtodos convencionales de congelado.
VENTAJAS DE LA CONGEL ACIN Fin

A) Difusin de genes:
Incremento de la produccin
Implantacin rpida de cambios en la produccin
B) Sanidad:
Limita la transmisin de enfermedades
Permite la limpieza sanitaria de las ganaderas
C) Conservacin:
Animales en peligro de extincin (incrementa el n)
Permite la limpieza sanitaria de las ganaderas
D) De cobertura mundial ilimitada