Random shearing as an alternative to digestion for

mitochondrial DNA processing in droplet digital PCR

ABSTRAK

Droplet digital PCR (ddPCR) adalah tes kuantitatif yang membutuhkan fragmentasi DNA untuk
memaksimalkan efisiensi reaksi. Dalam jurnal ini, kami mengukur proporsi DNA mitokondria
(mtDNA) yang membawa "penghapusan umum," yang merupakan peristiwa langka, untuk
membandingkan kepekaan kuantifikasi antara metode alternatif fragmentasi DNA (sonication dan
QIAshredder kolom spin) terhadap proses pencernaan enzimatik (digunakan secara tradisional).
QIAshredder menunjukkan sensitivitas tertinggi bila dibandingkan dengan metode sonication, diikuti
oleh pencernaan. Dan juga metode sonikasi dan fragmentasi QIAshredder memiliki waktu pengolahan
yang lebih pendek dbandingkan pencernaan enzimatik; Oleh karena itu, metode QIAshredder
fragmentasi dan sonikasi merupakan metode pengolahan DNA alternatif yang memaksimalkan
ddPCR kuantifikasi untuk mendeteksi peristiwa langka.

1. PENDAHULUAN

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) adalah generasi ke-3 tes kuantitatif yang
memanfaatkan teknologi tetesan dari emulasi air-minyak untuk partisi sampel ke dalam ribuan tetesan
di mana reaksi PCR individu terjadi. Dalam rangka untuk memaksimalkan efisiensi reaksi ini, ddPCR
membutuhkan kerangka DNA yang akan terfragmentasi. proses pencernaan enzimatik adalah metode
standar fragmentasi DNA, meskipun metode lain telah dikemukakan. Sementara metode sonication
DNA banyak digunakan untuk generasi berikutnya mempersiapkan prodses sequencing, metode ini
belum digunakan atau diuji untuk ddPCR. QIAshredder kolom Spin juga dapat memfragmentasi DNA
dan telah digunakan di ddPCR untuk mendeteksi DNA HIV yang terintegrasi dan mitokondria DNA
(mtDNA) dalam sampel secara klinis. Fragmentasi DNA menggunakan kolom ini dapat
meningkatkan deteksi DNA HIV melalui proses pencernaan. peningkatan efisiensi ini dianggap
disebabkan oleh menurunnya viskositas sampel dan kemungkinan penurunan hambatan garam reaksi
PCR bila dibandingkan dengan proses pencernaan enzimatik (Yukl et al., 2014). Di sini, kita langsung
membandingkan enzimatik, kolom dasar dan sonication fragmentasi kerangka DNA untuk ddPCR
untuk mengukur yang merupakan peristiwa langka, misalnya mitokondria "penghapusan umum".
"Penghapusan umum" adalah 4977 bp mtDNA penghapusan yang memengaruhi transfer RNA dan
transpor elektron rantai gen yang telah dikaitkan dengan proses penuaan dan penyakit fungsi syaraf,
termasuk penyakit Parkinson dan demensia. Kuantifikasi akurat dari "penghapusan umum" bisa
memberikan wawasan penuaan fisiologis jaringan tubuh

2. KESIMPULAN

Kesimpulannya, fragmentasi DNA oleh QIAshredder dan sonication harus dipertimbangkan

sebagai metode pengolahan alternatif untuk enzimatik digestion untuk digunakan dalam ddPCR untuk
mendeteksi peristiwa langka bila dibandingkan terhadap kedua target yang sering terjadi dan standar
dalam sampel yang berharga. Perbedaan antara metode fragmentasi ketika membandingkan frekuensi
terhadap target standar tidak konsisten, meskipun dalam penelitian ini QIAshredder masih
menawarkan sebagian besar kesensitifan. QIAshredder fragmentasi DNA peningkatan deteksi dari
target langka dan target umum sekaligus juga memberikan pengurangan yang besar dalam waktu
pemrosesan.

Sumber:

Jurnal Random shearing as an alternative to digestion for mitochondrial DNA processing in

droplet digital PCR disusun oleh Andrej Vitomirov , Miguel Ramirez-Gaona , Sanjay R. Mehta, dan
Josu Prez-Santiago pada tahun 2016 di USA