Guia de Microbiología para Genetica y Biotecnologia 16 IIcorreg 1

Prctica N1
Bioseguridad en el laboratorio de Microbiologa
OBJETIVOS.-
Conocer las normas fundamentales para prevenir accidentes y enfermedades en

el laboratorio de Microbiologa, en base al conocimiento de los riesgos existentes.
Los errores humanos, las prcticas incorrectas de laboratorio y el empleo inapropiado del
material de experimentacin son causa de la mayor parte de accidentes de laboratorio e
infecciones afines.
El riesgo relativo que entraan los microorganismos infectantes, se clasifica por grupos de
riesgo: Grupo de Riesgo I, II, III y IV y los laboratorios donde se trabaja con
microorganismos se dividen segn sus caractersticas de diseo, construccin y medios
de contencin en tres tipos: laboratorio bsico, de contencin y contencin mxima.
RIESGOS DEL LABORATORIO
- BIOLGICOS
- QUIMICOS
- FISICOS
El riesgo biolgico se clasifica en grupos de acuerdo al tipo de microorganismos que se

manipula en grupos como:
GRUPO DE RIESGO I
Escaso riesgo individual y comunitario. Microorganismos con pocas probabilidades de

provocar enfermedades.
TIPO DE LABORATORIO: Bsico. Laboratorio de Enseanzas en Universidades.
Microorganismos: Bacillus subtilis

Escherichia coli
Guia de prcticas de Microbiologa EAP Gentica y Biotecnologa 2016 II
GRUPO DE RIESGO II
Riesgo individual moderado y comunitario moderado.Agente patgeno que puede

provocar enfermedades en humanos, el riesgo de propagacin es limitado.
TIPO DE LABORATORIO: Bsico. Cmaras de seguridad biolgica, dispositivos de

proteccin personal (Servicios primarios de salud, laboratorios de diagnstico, de
enseanza universitaria, consultorios mdicos).
Microorganismos: Salmonella typhi

Virus de la Hepatitis B
GRUPO DE RIESGO III
Riesgo individual elevado y riesgo comunitario escaso.

Agentes patgenos que provocan enfermedades graves en humanos, pero no se propaga
de una persona a otra.
TIPO DE LABORATORIO: Contencin. Laboratorios de diagnstico especializado.

Requiere Cabina de seguridad Clase II. Filtrado del aire que sale del ambiente.
Microorganismos: Brucella sp
Histoplasma capsulatum
Mycobacterium tuberculosis.
GRUPO DE RIESGO IV
Elevado riesgo individual y comunitario.

Agentes patgenos que provocan enfermedades graves en personas y que se pueden
propagar fcilmente de un individuo a otro.
TIPO DE LABORATORIO Contencin mxima Requiere Cabina seguridad Clase II.

Filtrado de aire que entra y sale del ambiente.Trajes presurizados. Ducha sptica al salir
del laboratorio (Laboratorios que trabajan con agentes patgenos peligrosos).
Microorganismos : Virus Hanta

VIH
Ebola
Virus fiebre aftosa
PROBLEMAS EN EL LABORATORIO
El laboratorio bsico comprende todos los laboratorios que trabajan con agentes que
entraan un riesgo escaso o moderado para el personal de laboratorio, por lo cual habr
que prestar atencin a los factores conocidos por plantear problemas:
La formacin de aerosoles
El trabajo con grandes cantidades y/o concentraciones elevadas de microorganismos
Exceso de personal y material
Infestacin por roedores e insectos
La entrada de personas no autorizadas
Material de bioseguridad recomendado
Dispositivos manuales de pipeteo, para no utilizar la boca.

Cmaras de seguridad biolgica que se utilizaran cuando se apliquen
procedimientos con grandes probabilidades de producir aerosoles peligrosos y
cuando se manejen concentraciones elevadas de agentes infecciosos.
Microincineradores de asa.
Frascos y tubos con tapa rosca.
Autoclaves.
Decontaminacin y eliminacin de desechos
La decontaminacin y la eliminacin de desechos son operaciones de laboratorio

ntimamente relacionadas, ya que la desinfeccin la esterilizacin constituyen la primera
fase de la eliminacin. El tratamiento en autoclave constituye el procedimiento de eleccin
para todos los procesos de decontaminacin.
Si no se dispone de este elemento, se puede recurrir a los siguientes mtodos:
Ebullicin en agua que contenga bicarbonato.
Empleo de una olla a presin al nivel mximo de presin de trabajo.
Hay que establecer un sistema de identificacin y separacin de material contaminado:
Desechos no contaminados que pueden eliminarse con la basura.
Objetos aguzados y cortantes.
Material contaminado para tratamiento en autoclave y reutilizacin.
Material contaminado para eliminacin.
Riesgos qumicos
La inhalacin excesiva de vapores de solvente puede tener efectos txicos como

embotamiento, falta de coordinacin En otros casos pueden producirse consecuencias
adversas como lesiones en sangre, pulmones, hgado, riones y aparato gastrointestinal.
Seguridad qumica, elctrica, radiolgica y proteccin contra incendios
Los incendios los accidentes de orgen qumico, elctrico radiolgico pueden tener
como consecuencia indirecta un fallo de las medidas de contencin de microorganismos
patgenos. Es por eso menester mantener un elevado nivel de seguridad en estos
aspectos.
COMPROBACIN DE LA BIOSEGURIDAD
Observe el laboratorio donde efectuar las prcticas de Microbiologa y determine el tipo

de laboratorio al que pertenece.
Medida de Medida de
Accidentes Tipo de riesgo
Seguridad bioseguridad
La ocurrencia de un incendio
Los sismos
Irradiacin UV
Uso de lquidos inflamables
Derrame de un cultivo bacteriano sobre la

mesa de prctica
Eliminacin de desechos, contaminados
Pincharse con aguja de extraccin de sangre
Conexiones elctricas
TAREA:
Investigue acerca de las especies microbianas que se ubican en cada nivel de
bioseguridad
Esquema de cabinas de Seguridad Biolgica de Tipo II

Prctica N2
Utilidad y preparacin de materiales usados en
microbiologa
OBJETIVOS.-
- Familiarizar al alumno con el material de vidrio y de otra naturaleza de uso

frecuente en Microbiologa.
- Adiestrar al alumno en la limpieza y preparacin del material para su
esterilizacin.
I. MATERIAL DE VIDRIO
Aparte del instrumental y variado equipo que se requiere en todo laboratorio de

Microbiologa, el MATERIAL DE VIDRIO constituye una de las principales herramientas
de esta disciplina.
Como requisito general, el MATERIAL DE VIDRIO debe ser:
de vidrio neutro,
resistente a cambios de temperatura,
transparente, de superficie lisa,
sin rajaduras,
que contenga una mnima cantidad de lcali libre y
de bajo coeficiente de dilatacin.
Actualmente existen marcas con estas propiedades. como: PIREX, SIMAX, KIMAX,
KIMBLE, GENA, GLASS, ASSISTENT y otros.
El material indispensable para el funcionamiento de un Laboratorio de Microbiologa:
1.- TUBOS DE PRUEBA:
Condiciones.- Que sean de paredes gruesas, bien equilibrados, de preferencia

sin reborde para facilitar el taponamiento.
Medidas.- de 16 x 150 mm y 15 x 125 mm para cultivos microbianos puros y para

diluciones de anlisis cuantitativos. Para efectuar estudios de fermentacin,
hemlisis y utilizacin de sustratos se recomienda usar tubos de 13 x 100 mm y
para estudios serolgicos de 10 x 75 mm.
Tubos de centrfuga.-
De vidrio: Pueden ser de varias medidas, desde 10

mL hasta 25 mL, graduados en cc o en mm.
Pueden ser de fondo cnico o redondo y siempre
de paredes gruesas.
De polietileno: De idnticas medidas a las anterio-
res, se utilizan para centrifugaciones a altas revo-
luciones (p.e. en ultracentrfugas.
2.- CAPSULAS O PLACAS DE PETRI:

Compuestas de dos cristalizadores, de los
cuales el ms grande hace de tapa. Las ms
usadas son de 10, 12 20 mm x 100 mm y se
emplean para el cultivo y aislamiento de
microorganismos. La tapa puede ser
reemplazada por material de porcelana o metal
sin esmalte en la superficie interna.
3.- PIPETAS: Las primeras son terminales y con capacidad de 0.1 a 25 mL. Las
mejor aforadas, son las de las marcas PIREX y EXAX. Las de mayor uso son
para medidas de lquidos en pequeos volmenes:
Pipetas de 10 mL
" " 5 mL
" " 1 mL
" " 0.1 mL
4.- PIPETAS PASTEUR: Confeccionadas de varillas de vidrio de 4mm de dimetro

y de 20 30 cm de longitud. La calidad del vidrio debe facilitar reblandecimientos
a la accin directa de la llama del mechero, para conseguir por estiramiento la
capilaridad deseada; es decir, es una pipeta con porcin capilar. Se las emplea
para la toma de pequeos inculos de siembra.
NOTA: La tcnica de preparacin se especifica en el procedimiento respectivo.
5.- MATRACES y BALONES: Recipientes volumtricos de gran utilidad para la

preparacin y almacenamiento de soluciones, colorantes, reactivos, medios de
cultivo, etc. La calidad debe ser la misma, recomendada en los requisitos
generales.
Los balones se diferencian de los matraces por tener una base esfrica con
fondo plano. En ambos los cuellos terminan en un discreto reborde lo que les
confiere resistencia.
Los ms comunes son: 100, 250, 500, 1000 y 2000 mL. Hay de menores
medidas a las de 100 mL.
6.- ESPATULAS DRIGALSKY: Se confeccionan a partir de varillas de vidrio

macizo, la fraccin recta y horizontal facilita la siembra y aislamiento de bacterias
por diseminacin.
NOTA: La tcnica de preparacin se especifica en el procedimiento respectivo.
7.- PROBETAS: Recipientes cilndricos con base para la estabilidad, sus paredes
son ms gruesas que el material antes indicado. Pueden estar o no graduadas;
las primeras para medidas de lquidos en la preparacin de cualquier solucin y
las segundas, como depsito de desinfectantes para pipetas, baguetas, etc. Las
hay de diferentes capacidades; las de 100, 250, 500 y 1000 son las de mayor
uso en el laboratorio.
8.- VARILLAS DE VIDRIO MACIZO: fragmentos de 30 a 60 cm, que sirven para la

confeccin de agitadores o baguetas y esptulas de Drigalsky; los ms cortos
son empleados regularmente como mangos para asas de siembra.
9.- BEAKER o VASOS DE PRECIPITACION: Recipientes cilndricos de amplia

utilidad en la preparacin de soluciones y medios de cultivo. Se fabrican en
varias medidas. El vidrio debe ser necesariamente resistente al calor.
10.- FRASCOS VIALES PARA HEMOCULTIVOS, VACUNAS, CULTIVOS DE

TEJIDOS: Son de vidrio neutro, resistentes al calor, transparentes y con tapa de
rosca. Con capacidad de 50, 100 y 150 mL.
Los frascos de vidrio neutro de 50 y 100 mL, blancos o de color mbar pueden
ser aprovechados para la reserva de soluciones y medios de cultivo en stock,
previamente taponados con algodn esterilizado.
II. MATERIAL DE OTRA NATURALEZA
La lista tambin es enorme; mencionaremos los que ms se utilizan:
1.- MANGOS DE KOHLE: Vstagos de metal con su cubierta de ebonita aislante

del calor y en el extremo proximal una tuerca para insertar el alambre de platino
o nicrom en el asa de siembra. Pueden ser reemplazados por mangos de vidrio,
ya descritos anteriormente.
2.- ESPATULAS DE METAL CON MANGOS DE MADERA: De preferencia de

material inoxidable, su uso es muy conocido.
3.- MECHEROS DE BUNSEN: Imprescindibles en Microbiologa. Son de metal con

una tuerca movediza para medir la intensidad de la llama. Algunos modelos
llevan una llave de control ad-hoc.
4.- CANASTILLAS O CESTOS DE METAL: Las mejores son de aluminio.

Favorecen el mejor almacenamiento de tubos de prueba en medidas conocidas.
Sin riesgos de rotura.
5.- SOPORTES UNIVERSALES: Con tenazas y aros de metal, para asegurar

cuellos y bases de matraces, balones, beakers, etc.
6.- RECIPIENTES DE POLIETILENO o DE METAL: Cilndricos con bases

circulares o cuadrangulares, para lavado de pipetas. Puede ser de manejo
manual o automtico.
7.- ADEMAS: Gradillas de madera o metal para tubos de prueba de varios tamaos
y para frascos, goteros, rejillas de asbesto, hilos de platino, aplicadores o
vstagos de metal o madera para confeccin de hisopos, tapones de jebe o
corcho para tubos, algodn, papel filtro, papel kraft envolvente, papel engomado
en tiras, papel platina, lpiz graso para escribir en fro o plumones de tinta
indeleble, mangueras de jebe de 10 20 cm de dimetro, bandejas de fierro
enlozado, instrumental quirrgico, hilo de sutura, papel indicador de pH, etc.
PREPARACION PARA SU ESTERILIZACION - LIMPIEZA
El material de vidrio nuevo o usado, debe limpiarse en forma tal que elimine toda huella
de suciedad original. Se evita as la precipitacin y depsito de los agentes que ejercen
poder limpiador. El cristal de borosilicato (PYREX) o los instrumentos de vidrio sdico
lavados en fbrica, no requieren tratamiento alguno antes de su utilizacin, salvo el
lavado normal. El material de vidrio sdico nuevo debe sumergirse en HCl durante una
noche, para neutralizar el lcali contenido en el vidrio.
Es importante:
a.- Conocer el grado de dureza del agua (exceso de Ca, Fe, Mg, Cu).
b.- Usar detergentes (Haemosol, p.e.) que no contengan lcalis, que ablanden el
agua, que sean fcilmente soluble en agua tibia y no precipiten en agua fra, tibia
o caliente.
c.- Eliminar los residuos ms tenaces: protenas y grasas con facilidad y por
completo.
d.- No producir deterioro alguno en los materiales de los instrumentos ni en la piel.
e.- No usar jabn ni detergentes no garantizados.
En caso de material de vidrio usado, la limpieza debe hacerse tan pronto como sea
posible. Los pasos a seguir son:
1.- Los recipientes con cultivos descartados o contaminados, se deben

decontaminar en autoclave, quitando luego tapones y contenido en caliente. Las
pipetas u otros dispositivos se deben desinfectar en las probetas cilndricas sin
graduar conteniendo solucin bactericida sulfocrmica o detergentes ms 1%
de fenol, durante 24 hrs.
2.- Hacer hervir el material en una olla con agua y detergente por lo menos 30
minutos. Se recomienda remojar el material en la mezcla de un da para otro.
3.- Frotar por dentro con escobilla a la medida. Cuando sta por el uso queda en
alambre en su extremo distal, se recomienda desechar para evitar roturas.
4.- Enjuagar con agua de cao a chorro continuo hasta eliminar el detergente o
agente bactericida. Continuar el enjuague con agua tibia y luego con 2 3
cambios de agua destilada.
5.- Escurrir el material sobre soportes de madera ad-hoc y esperar que sequen por
s solos.. De ninguna manera se deben usar lienzos para el secado, por los
restos de hilachas que quedaran sobre la superficie del material. En caso de
porta y cubre objetos, como paso final se pasan por alcohol de 70 para su
desengrase.
En tubos de prueba con medios slidos no licuables (Suero humano coagulado,
medio de Loeffler) desalojar los cilindros de gel con un alambre o varilla de
madera, en caso de no contar con aire a presin para la extraccin.
RECOMENDACIONES GENERALES
* Elegir la mesa de trabajo, de preferencia cercana al equipo de esterilizacin.

* Colocar sobre la mesa y en forma ordenada todo el equipo a prepararse: matraces,

tubos de prueba, pipetas, etc.; trozos de papel engomado y de pabilo; lpiz graso.
* Rotular los materiales con datos de: medidas, fecha y nombre del grupo o persona a
quien pertenecen.
* No manipular bruscamente el material a fin de evitar posibles roturas.
* Nunca taponar o envolver los recipientes sin un previo y total secado de los mismos.
Caso contrario aparecern manchas negras despus de la esterilizacin.
III. EQUIPO DE LABORATORIO
1.- POTENCIOMETRO
Requerido para mediciones del pH de las soluciones buffer y medios de cultivo.

Constituido por un par de electrodos sensibles a concentraciones de hidroge-
niones, conectado a un circuito elctrico que mide las fuerzas electromagnticas
y a un potencimetro que indica las mediciones.
Los potencimetros emplean un electrodo de vidrio, unido a un electrodo de
calomel como standard. El electrodo de vidrio es una delgada membrana de
vidrio especial colocado entre una media celda de Plata-Cloruro de Plata y la
solucin cuyo pH se quiere conocer; el electrodo de calomel est formado por
HgCl slido sobre Mercurio metlico. Dentro de la celda de vidrio que contiene
el electrodo Ag-AgCl, se encuentra HCl 0.1 M lo que establece en uno de los
lados de la membrana de vidrio un pH constante y conocido con exactitud. La
solucin de pH desconocido y la media celda estn unidos por un "puente" de
KCl. El electrodo de vidrio vara con los cambios de pH de la solucin problema,
este potencial es una funcin lineal de pH.
Debe tenerse extremado cuidado en el manejo de electrodos, especialmente con
la membrana del electrodo de vidrio que es muy delicada y se rompe al primer
contacto con punzo-cortantes. El electrodo de calomel debe estar siempre lleno
con solucin adecuada de sal, usualmente cloruro potsico saturado.
2.- CENTRIFUGA
Equipo para acelerar el proceso de sedimentacin, donde la clula o partcula a

sedimentar se ve sujeta a dos fuerzas de sentido opuesto: una dirigida al centro
del tubo y la otra que se opone debido a la viscosidad del medio.
La primera responde a la frmula: f1=my; donde y es la aceleracin debido al
peso, y = 1 g (unidad de gravitacin); m es la masa de la partcula.
La segunda es donada por la frmula de Stockes: f 2=6 nrv y depende del radio
(r) de la partcula, de la viscosidad del medio (n) y de la velocidad de migracin
(v). Cuando se acelera el valor de y utilizando la fuerza centrfuga, la operacin
se denomina CENTRIFUGACIN.
CENTRIFUGAS.- Aparatos diseados para acelerar la separacin de partculas
slidas suspendidas en lquidos. La velocidad a la cual sedimentarn las
partculas en un lquido depende de varios factores:
- Tamao de la partcula.
- Peso de la partcula.
- Viscosidad del lquido.
- Fuerza gravitacional.
La fuerza gravitacional es incrementada mecnicamente. El grado de incremento

de la fuerza gravitacional se mide por comparacin con una fuerza centrfuga
relativa (FCR expresada en G) del siguiente modo:
FCR = 1.118 x 10-5 x R x rpm2
Donde R es el radio de la centrfuga en cm; rpm es la relacin del nmero de

revoluciones por minuto.
El radio corresponde a la distancia del tubo al eje de rotacin.
Factores que influyen en una centrifugacin eficiente:
-TIEMPO: El desplazamiento de una partcula en el tubo est en

funcin de la duracin de la centrifugacin.
-TEMPERATURA: Las centrfugas refrigeradas se emplean para

aquellos productos que se deterioran fcilmente por el calor
desprendido por la friccin de los tubos.
ULTRACENTRIFUGACION
Para obtener aceleraciones elevadas (mayores o iguales a 50,000 G) se

necesitan motores que establezcan un vaco a fin de evitar el calentamiento del
rotor por friccin con el aire.
Existen dos tipos:
- Ultracentrifugacin Analtica: Para determinacin de

caractersticas fsicas de protenas o de cidos nucleicos. La
migracin de estas molculas es seguida gracias a un
estroboscopio.
- Ultracentrifugacin Preparativa: Permite la separacin de

organelas (mitocondrias, microsomas). La separacin de
macromolculas se debe efectuar en gradiente de densidad.
3.- INCUBADORAS y HORNOS: Se basan en el mismo principio. Son gabinetes

provistos de un calentador interconstrudo. La temperatura requerida puede
controlarse mediante un termostato. El termostato se compone de una tira
bimetlica que opera como un conmutador o interruptor elctrico conectado a un
aparato de calentamiento. Si se sueldan entre s dos metales con ndices de
expansin diferentes, uno de ellos se dilatar ms rpidamente que el otro,
haciendo que toda la tira se doble; esta tira est conectada a un interruptor
elctrico; se interrumpir el circuito y el calentador dejar de funcionar hasta que
la temperatura descienda lo suficiente para que la tira metlica vuelva a su
posicin original.
La diferencia entre los hornos y las incubadoras radica simplemente en la
temperatura que puede obtenerse en el interior. Un aparato capaz de soportar

temperaturas de 100 C o mayores se denomina usualmente HORNO.
Hay dos tipos bsicos de incubadoras: en el tipo de conveccin por gravedad,
se hace circular el aire por medio de las corrientes de conveccin, son
inadecuadas para circular aire caliente a travs de toda la cmara, cuando debe
elevarse la temperatura slo muy ligeramente sobre la del exterior. Cuando la
incubadora es ms grande, ms serio es el problema. En los tipos de corriente
mecnica de conveccin, el aire circula por accin de un ventilador.
Un punto importante que con frecuencia se descuida, es la carga de las
incubadoras. Si se colocan los paquetes que van a esterilizarse o los cultivos
para su incubacin, en recipientes que no permiten un precalentamiento
adecuado, disminuye la eficacia del instrumento.
Las incubadoras ms costosas vienen provistas de un humedecedor, pues los
microorganismos desarrollan mejor en una atmsfera hmeda.
4.- BAOS DE AGUA: Estn constituidos por una bandeja que posee un dispositivo
enrollable que puede sumergirse en ella para calentarlo. Estos dispositivos estn
protegidos por una rejilla que impide el contacto directo entre enrollamiento y los
objetos que van a incubarse, adems de promover una distribucin ms uniforme
en las corrientes de conveccin formadas. Un buen bao de agua es la
incubadora ms sensible que pueda tenerse.
Bajo condiciones ptimas puede regularse la temperatura dentro de lmites. La

cubierta o tapa de la incubadora tiene la finalidad doble de mantener la
temperatura requerida en el interior del aparato y reducir el ndice de
evaporacin. El agua de condensacin se acumular en la parte interior de la
tapa, para impedir que esta agua gotee a los tubos de ensayo, debe tener una
tapadera que permita un adecuado drenaje.
Para evitar la formacin de precipitados o costras debe emplearse siempre agua
destilada; para impedir la contaminacin con algas y bacterias puede agregarse
1 mL al 10% de Zafiran por cada galn (3.785 lt) de agua. Se debe comprobar a
diario la temperatura y nivel de agua.
5.- REFRIGERADORAS y CONGELADORAS: Son incubadoras de temperatura

fra. Se requiere para almacenar medios de cultivo, sueros y reactivos
perecederos. Las congeladoras se requieren para almacenamiento ms
prolongado de sueros, enzimas, etc.
Debe localizarse lejos de los hornos de aire caliente, de radiadores, de tuberas
de agua caliente.
6.- FILTRACION: La filtracin bacteriolgica generalmente libera los lquidos de

partculas no deseadas. Se ve favorecida por la aplicacin de presin a travs
del filtro, bien sea presin positiva sobre el lquido no filtrado. Se emplean para
lquidos y soluciones que resultaran alterados por el calor.
-Filtros de Membrana: Discos de elevada porosidad de steres de celulosa

(acetato de celulosa), con gama de formas, dimetros y poros. Retienen en su
superficie aquellas partculas que sobrepasan el tamao dado. El tamao del
poro ms grande es menor que las ms pequeas partculas retenidas. La
retencin de partculas se efecta por medio de poros y no por atraccin o
adsorcin electrosttica.
Ejm. Millipore grado 08, dimetro de poro 0.22-0.02 , 0.45 para bacterias.
Las membranas de nitrato de celulosa se conocan con el nombre de
Oradocel, dimetro 3-10 , son usadas para determinar el tamao de
muchos virus.
ULTRAFILTRACION
La ultrafiltracin bajo membrana de permeabilidad selectiva permite la

separacin de sustancias segn su tamao molecular, las membranas juegan
un papel de filtros a nivel molecular.
Las membranas ms utilizadas son de Digflo (Amicon), fuerza que permite la
ultrafiltracin, es una presin ejercida sobre el lquido a filtrar por el nitrgeno. La
ultrafiltracin puede ser utilizada con centrifugacin, la fuerza motriz de la
ultrafiltracin ser entonces la fuerza centrfuga.
APLICACIONES:
1. Concentracin de macromolculas.
2. Eliminacin de sustancias de bajo peso molecular.
3. Separacin de virus, con utilizacin de membranas especiales cuyos lmites
alcanzan pesos moleculares de 300 000.
7.- LIOFILIZADOR: Procedimiento de conservacin que es acompaado de una

transformacin de la sustancia a conservar, la que contiene al principio una
concentracin elevada.
El principio de liofilizacin consiste en congelar bruscamente a bajas
temperaturas. El procedimiento comprende varias etapas: Congelacin,

eliminacin del agua (directamente del estado slido al vapor, sin pasar por lqui-
do). Este procedimiento permite conservar al estado seco un nmero de
productos que pueden reconstituirse por hidratacin.
Para la congelacin es necesario que el solvente sea acuoso, ya

que la mayor parte de solventes disminuyen el punto de
congelacin bajo el riesgo de desnaturalizacin, sobre todo si el
material es proteico.
El liofilizador comprende una o dos bombas de vaco (la segunda
bomba permite obtener presiones residuales inferiores a 0.1 mm
Hg y un sistema que permite obtener el vapor de agua).
8.- ESPECTROFOTOMETRO: Es un instrumento que permite medir la intensidad

de la luz transmitida; se utiliza mucho en anlisis bioqumicos. Comprende un
espectrmetro y un fotmetro. Mediante una fuente de luz y un dispositivo de
monocroma el espectrmetro puede emitir frecuencias luminosas conocidas
que varan segn el tipo de aparato empleado pero que corresponden a la regin
del espectro visible entre 400 y 700 nm. El fotmetro es una clula fotoelctrica
sensible a la gama de longitudes de onda de la luz emitida y un galvanmetro
que registra los potenciales originados por la clula fotoelctrica. Estos
potenciales son transcritos a una escala donde figuran lecturas por 100 de
transmitancia o de absorbancia.
Las sustancias disueltas tienen determinados colores porque absorben ciertas

longitudes de onda de la luz y dejan pasar otras. Cada sustancia absorbe energa
radiante de una u otra longitud de onda.
Ejm. La hemoglobina tiene color rojo porque absorbe los colores

complementarios del rojo, es decir las longitudes de onda ms cortas del
azul y del verde.
MATERIAL.-
1.- Trozos de algodn de varias dimensiones.

2.- Papel kraft en tiras y trozos rectangulares y cuadrados.
3.- Pabilo.
4.- 10 a 12 tubos de prueba de 16 x 150 mm.
10 a 12 tubos de prueba de 13 x 100 mm.
10 a 12 tubos de prueba de 10 x 75 mm.
5.- Matraces Erlenmeyer y Kitasato de 1000, 500 y 250 mL. Uno de cada uno.
6.- Probetas de 1000, 500 y 100 mL, dos de cada una.
7.- Pipetas graduadas de 10, 5 y 1 mL, dos de cada una. Pipeta volumtrica de 100
50 mL.
8.- 4 5 placas Petri de 10 x 100 mm
PROCEDIMIENTO.-
I. CONFECCION DE TAPONES DE ALGODON
Mtodo N1
Tomar un trozo rectangular de tamao adecuado para adaptar al dimetro de la boca

del recipiente a taponar. Practicar un doblez en tres a lo largo de la fibra.
Hacer una torsin de 90 en el primer tercio, doblar sobre el tercio medio y plegar el
ltimo tercio sobre el primero. Rotar con los dedos el trozo confeccionado para darle
forma y dimetro a la medida de los tubos y matraces.
Mtodo N2
Tomar un trozo rectangular, practicar a lo largo el doblez en tres y enrollarlo

transversalmente a su eje longitudinal hasta darle la medida y dimetro deseado. Para
mejor duracin del tapn, amoldar un trozo de gasa que lo cubra totalmente.
El tapn en los tubos, matraces u otro recipiente debe quedar introducido en sus dos
terceras partes; no muy ajustado ni muy flojo, para evitar contaminaciones y dificultades
en su manipulacin.
II. PREPARACION DE TUBOS DE PRUEBA
Hacer manojos de tubos taponados (10 a 12) sujetos con pabilo y cubrir por sus
bordes con el papel envolvente asegurando el paquete con pabilo o papel engomado.
Los paquetes deben corresponder a tubos de iguales medidas. Se colocan en latitas o
canastillas para facilitar su esterilizacin.
III. PARA LOS MATRACES, KITASATOS, FRASCOS Y PROBETAS
Despus de su taponamiento, cubrirlos aisladamente con un capuchn de papel.

Para la confeccin seguir instrucciones del profesor.
Se puede prescindir de los tapones y del papel kraft, cubriendo las bocas de los
recipientes con trozos de papel platina ajustados ntimamente a su superficie.
Preparacin de Matraz Kitasato

La tcnica es idntica a la de los matraces. En este caso, se tapona adems la
tubuladura lateral y se cubre con un papel.
Aparte se envuelve el tapn de jebe correspondiente, que despus de esterilizarse
se adaptar al Kitasato para la filtracin.
IV. PREPARACION DE PIPETAS SEROLOGICAS Y VOLUMETRICAS
a.- Colocar tapones de algodn a manera de filtros moderadamente ajustados, en

las boquillas de las pipetas.

b.- Colocar oblicuamente la pipeta serolgica a una tira de papel y hacer un doblez
de ste en un extremo, cubrir el extremo proximal (punta de la pipeta).
c.- Deslizar el papel en espiral sobre la longitud de la pipeta hasta la boquilla. Hacer
torsin de la tira de papel para tener la proteccin completa (sin vacos).
V. PREPARACION DE LAS PLACAS PETRI
Se pueden envolver aisladamente o en nmero de 2 3, con los trozos rectangulares

de papel kraft.
a.- Colocar las placas sobre el papel en posicin invertida y doblar los mrgenes
uno sobre otro, a manera de cubrirla.
b.- Completar el doblez con los extremos del papel sobrante asegurndolos con
papel engomado. Los bordes de las placas deben quedar ntimamente adheridos
al papel que los cubre, para evitar vacos.
VI. PREPARACION DE PIPETAS PASTEUR
a.- Lisar los extremos de la varilla de vidrio hueco a la llama del mechero. Introducir
los taponcitos de algodn en 2/3 quemndose el excedente.
b.- Calentar el centro de la varilla en forma continuada, rotando a la vez ambos

extremos para evitar el cierre de la luz interna del tubo reblandecido.
c.- Retirar de la llama la regin calentada y reblandecida de la varilla y tirar de los

extremos para obtener la capilaridad. El calibre vara con el tiempo de
estiramiento.
d.- Separar las dos pipetas por estiramiento brusco despus del calentamiento y
refrendar el cierre a la llama de la porcin distal capilar.
VII. CONFECCION DE ESPATULAS DE DRIGALSKY
Se preparan a partir de la pipeta Pasteur.
a.- Calentar en un punto del tercio anterior de la zona capilar doblando en ngulo el
resto de la fraccin capilar.
b.- Mediante dos calentamientos sucesivos en dos puntos equidistantes del tercio
medio, formar una varilla capilar horizontal, de manera que los bordes de la
esptula formen un tringulo abierto, entre la fraccin capilar distal y el ngulo
del tercio anterior.
1 2
3 4 5
Figura 1. Confeccin de esptulas de Drigalsky
Figura 2. Confeccin de tapones de algodn

Figura 3. Armado del asa de siembra
Figura 4. Confeccin de pipetas Pasteur
CUESTIONARIO
1.-Por qu es necesario preparar el material de vidrio antes de hacer los cultivos?
2.- Por qu no se pueden usar tubos con tapones de jebe?

3.-Qu efecto tendra el algodn quemado sobre el crecimiento de los

microorganismos?
4.- Por qu no se puede utilizar material de vidrio roto con rayaduras?

Prctica N3
Preparacin de medios de cultivo (comunes y
especiales)
OBJETIVOS.-
Aprender a preparar los diferentes tipos de medios de cultivo.
A. MEDIOS DE CULTIVO
DEFINICION
Son sustancias nutritivas lquidas o slidas, que se utilizan en el laboratorio para el
crecimiento de los microorganismos, pudiendo ser similares a sustratos naturales, en
los cuales estos crecen normalmente.
COMPOSICION
Sus componentes bsicos deben satisfacer las mnimas exigencias nutricionales
para el desarrollo microbiano y varan segn el tipo de bacteria. Incluyen: agua,
nutrientes como fuentes de nitrgeno, carbono y energa; y en ciertos casos, factores
de crecimiento. Se considerarn adems para el crecimiento necesidades de O2
(aerobios), CO2 parcial o total (microaerfilos o anaerobios) y condiciones ptimas de
pH y temperaturas de incubacin.
Los medios de cultivo de acuerdo a su naturaleza pueden ser animal-vegetal
(orgnicos) y mineral (inorgnicos). La mayora de los medios de cultivo empleados para
el desarrollo inicial y aislamiento de microorganismos heterotrficos, son ricos en
componentes proteicos derivados de carnes, corazn, cerebro, casena, fibrina, soya,
por digestin con enzimas proteolticas (pepsina, tripsina, papana). Estos derivados son
principalmente pptidos, peptonas, proteosas, aminocidos, sales inorgnicas como
fosfatos y trazas de K y Mg que los organismos utilizan como compuestos parcialmente
degradados, al ser incapaces la mayora de hidrolizar protenas completas. Los
EXTRACTOS DE CARNE son los nutrientes bsicos de muchos medios de cultivo a los
cuales suele aadirse carbohidratos y sales inorgnicas, para constituir MEDIOS
BASALES. Contienen los productos de degradacin proteica: gelatina, albumosas,
peptonas, proteosas, aminocidos y otras fuentes de nitrgeno como creatina,
carnosina, anserina, purina y glutatin. Tambin contiene sales minerales (KH2PO4) y
NaCl), factores de crecimiento (tiamina, cido nicotnico, riboflavina, piridoxina, c.
pantotnico y colina) y algunos carbohidratos. El EXTRACTO DE LEVADURA que se
utiliza como fuente de factores de crecimiento y que sustituye al extracto de carne, se
prepara a partir de clulas lavadas de levadura de cervecera y de panadera, que son
inducidas a autolisarse por calor a 55C o pueden ser hidrolizadas con HCl o enzimas
proteolticas. Los extractos son ricos en protenas de bajo peso molecular y en factores
de crecimiento. El NaCl que se aade al nutriente aumenta la presin osmtica del
medio.
El AGAR es el agente solidificante de un nutriente lquido, al igual que la gelatina y
el gel de slice; ste ltimo es utilizado para aislamiento de microorganismos
autotrficos. El agar se prepara a partir de una variedad de algas (Gelidium, Euchema,
Pterocladia) en estado seco, por procesamiento con agua caliente. El producto es luego
clarificado, secado y luego suministrado en grnulos, en hebras o en polvo. Su principal
componente es un polisacrido de cadena larga, mayormente constituido por D-
galactopiranosa.
Tambin contiene una variedad de impurezas incluyendo sales inorgnicas, pequea

cantidad semejante a protenas y trazas de cidos grasos de cadena larga que son
inhibitorios del crecimiento. Los minerales presentes son: Mg y Ca; antes se pensaba
que el agar era un ster de sulfato de Mg o de Ca del polisacrido. Para eliminar
impurezas y exceso de fosfatos, se ajusta el pH a 8.0, se mantiene a 100C para
precipitar fosfatos, se separa y al enfriar se reajusta el pH del agar a 7.4.
CLASIFICACION
Segn su composicin y objetivos se clasifican de la siguiente manera:
1.- MEDIOS COMUNES

Aquellos que contienen los mnimos componentes nutricionales para organismos
heterotrficos no exigentes. Estos pueden ser LIQUIDOS, SOLIDOS y SEMISOLIDOS.
Ejm.:
- Medios Lquidos: Caldo nutricio, caldo peptonado, caldo triptosa, caldo carne y
otros.
-Medios Slidos: Nutrientes compuestos de un medio lquido base, al que se le

agregan sustancias orgnicas de poco o nulo valor nutritivo como el agar o gelatina,
para darle al medio una consistencia de gel.
Ejm.: Agar nutricio, agar peptonado, agar almidn, medio de gelatina y otros. El agar
nutricio depositado en grandes recipientes de superficie plana como placas Petri,
permite el aislamiento de bacterias no exigentes al estado de pureza, a partir de una
fuente problema.
Tambin es importante su utilidad para otros fines como para la preparacin de

cosechas bacterianas masivas en la elaboracin de antgenos, vacunas, conserva-
cin de cepas para estudios culturales en tubos de prueba, etc.
-Medios Semislidos: Compuesto por cualquiera de los medios lquidos antes

mencionados, a los que se adiciona una cantidad suficiente de agar para obtener un
estado de gel blando (0.5%). Principalmente se les usa para estudios de motilidad
macroscpica en columna de los microorganismos, mantenimiento en cepario y
estudios de la capacidad respiratoria.
2.- MEDIOS ENRIQUECIDOS O SUPLEMENTADOS

Preparados para reunir los requerimientos nutricionales de bacterias ms exigentes.
Se componen de un medio basal ordinario suplementado con factores de crecimiento
como sangre, suero sanguneo, lquido asctico, lquido pleural, vitaminas, extracto
de levadura, bases nitrogenadas, carbohidratos y sales minerales. Estos medios
pueden ser: LIQUIDOS o SOLIDOS.
Ejm.:
-Medios Lquidos: Caldo cerebro corazn, caldo extracto de levadura, caldo suero,
caldo asctico, caldo tripticasa soya, etc.
-Medios Slidos: Agar cerebro corazn, agar extracto de levadura, agar sangre, agar
chocolate, suero coagulado de Loeffler y otros.
3.- MEDIOS SINTETICOS DEFINIDOS O QUIMICAMENTE DEFINIDOS

Preparados exclusivamente de sustancias qumicas.
-Medios Sintticos Simples: Contienen carbono como fuente de energa (glucosa o

lactato), una fuente inorgnica de nitrgeno (ClNH4); fosfato o sulfato y varias otras
sales minerales; sustancias tampn y agentes quelantes como el citrato.
Ejm.: Medio mnimo de Falkow, medio mnimo de Davis y Mingioli.
-Medios Sintticos Complejos: Incorporan aminocidos, purinas, pirimidinas y otros

factores de crecimiento, para cepas exigentes.
4.- MEDIOS ESPECIALES
Son aquellos que adems de contener los requerimientos nutricionales bsicos, llevan
en su composicin sustancias inhibidoras con carcter selectivo y compuestos
especficos e indicadores para poner de manifiesto los principales caracteres
bioqumicos esenciales para el diagnstico especfico. Entre las sustancias inhibidoras,
los medios pueden contener sales biliares, antibiticos, colorantes u otros; pueden
afectar el metabolismo o sistema enzimtico con carcter de seleccin.
Comprende:
-Medios de ENRIQUECIMIENTO: Que favorecen el crecimiento de uno o un grupo

de microorganismos en particular, e inhiben en lo posible a otros de la microflora
acompaante.
Ejm: agua peptonada alcalina (APA) para Vibrio parahaemolyticus, caldo selenito de
Leifson, caldo tetrationato de Kauffman (entricos patgenos), caldo GN y otros.
-Medios SELECTIVOS: Que favorecen el aislamiento de un determinado grupo de

microorganismos mediante la obtencin de colonias (cepas puras). Todos son
utilizados en condiciones slidas.
Ejm: Agar Staphylococcus N 110 (para el aislamiento de Staphylococcus patgenos);

Agar Chapman, Agar Mitis Salivarius (para el aislamiento de Streptococcus mitis y S.
salivarius); Agar Cetrimide y Agar GSP (para aislamiento de Pseudomonas); Agar
McConkey; Agar EMB y Endo (medios moderadamente selectivos para aislamiento
de Coliformes y entricos patgenos, lactosa negativos); Agar SS, Agar Verde
Brillante y Agar Sulfito de Bismuto (medios altamente selectivos para el aislamiento
de entricos patgenos, lactosa positivos).
-Medios DIFERENCIALES: Empleados para detectar reacciones bioqumicas, con

carcter diferencial de grupos, gneros y especies microbianas. Para algunos en un
solo medio diferencial se pueden interpretar dos o ms pruebas bioqumicas, como
el Agar TSI utilizado para estudios de fermentacin o no de lactosa y sacarosa de
organismos entricos, y fermentacin obligada de glucosa por los mismos; lectura de
produccin o no de H2S. El Agar SLU presenta una mayor ventaja sobre el primero,
porque le permite a la vez la interpretacin de varias pruebas bioqumicas:
fermentacin o no de lactosa, produccin o no de H 2S, produccin o no de ureasa,
produccin o no de indol, lectura de motilidad (para diferenciar entricos).
Otros medios diferenciales: Agar LIA, Citrato de Simmons, Medio SIM, Caldo KCN,
Caldo Malonato (para estudios de entricos); Medio de Hugh y Leifson (para lecturas
de oxidacin y fermentacin de carbohidratos).
MATERIALES.-
-Medios de cultivo deshidratados o sus componentes deshidratados:

Para Caldo Nutricio: Peptona
Extracto de Carne
NaCl
Para Agar Nutricio: Los antes mencionados ms Agar granulado
Para el Medio Selectivo: Agar McConkey deshidratado
-Una balanza ordinaria de 2000 gr de capacidad.

-Un matraz Erlenmeyer de 1000 mL de capacidad, con tapn de algodn.
-Una probeta graduada de 1000 mL de capacidad.
-Un litro de agua destilada.
-Varillas o baguetas de vidrio.
-Pipetas de 10 mL.
-Tubos de prueba de 16 x 150 mm con tapn de algodn.
-Placas Petri.
-Botellas de vidrio de 250 mL de capacidad con tapn de algodn.
-Solucin de HCl 0.1 N y NaOH 0.1 N.
-Papel indicador de pH.
PROCEDIMIENTO (Rotular datos: nombre del medio y fecha de preparacin)
1.- Pesar los ingredientes segn la cantidad requerida por los medios a preparar
(ver frmulas de los medios en la pgina ).
2.- Colocar la cantidad pesada en el matraz Erlenmeyer (con excepcin del agar
granulado que se adiciona en caliente), adicionar agua destilada en la proporcin
requerida. Homogenizar la mezcla mediante la varilla de vidrio.
3.- Colocar el matraz sobre un trpode provisto de una rejilla de asbesto. Calentar la
muestra (mezcla), empleando la llama del mechero, hasta lograr la total
disolucin de los ingredientes. En la preparacin del agar, se adiciona el agar
granulado en caliente y se sigue calentando hasta su completa disolucin.
4.- Disueltos los componentes, enfriar a 50-55C y ajustar el pH a 7.2 - 7.4 con HCl
0.1 N NaOH 0.1 N. Distribuir los medios en las botellas de vidrio hasta la mitad.
Taponar.
5.- Esterilizar al autoclave a 15 lb de presin (121C) por 15 minutos. Terminado el
tiempo de esterilizacin, esperar que la aguja del manmetro descienda y extraer
los medios.
6.- Para asegurar las condiciones de esterilidad de los medios, extraer
aspticamente alcuotas de cada medio en 1-2 tubos estriles e incubar a 37C
por 24 h, el resto del medio de cultivo mantener en stock conservando en refri-
geracin hasta su empleo.
7.- Los medios slidos sometidos al proceso de esterilizacin y enfriados a 50-55C,
deben de repartirse en alcuotas de 12 a 15 mL en 1-2 placas Petri en
condiciones aspticas; al solidificarse los medios invertir las placas para evitar
que el agua de condensacin se acumule sobre la superficie del agar. Incubar
las placas a 37C por 24 h, para control de esterilidad. Para medios slidos de
igual forma.
FORMULAS Y PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS COMUNES
- CALDO NUTRICIO
Composicin: - Bacto-Peptona 10 g
- Extracto de Carne 3g
- NaCl 5g
- H2O destilada 1000 mL
Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada;

calentar hasta su completa disolucin; enfriar y ajustar el
pH a 7.2 - 7.4; repartir en frascos y autoclavar a 15 lb de
presin (121C) por 15 minutos. Rotular datos y conservar
en stock.
- AGAR NUTRICIO
Composicin: - Peptona 10 g
- Extracto de Carne 3g
- NaCl 5g
- Agar-agar 18 g
Preparacin: Disolver los 3 primeros ingredientes en

agua destilada; calentar hasta su completa disolucin;
agregar luego el agar granulado; seguir calentando hasta
disolver completamente el agar; enfriar a 55C y ajustar el
pH a 7.2; repartir en frascos y autoclavar a 121C por 15
minutos. Rotular datos y conservar en stock.
PREPARACION DE MEDIOS SELECTIVOS: AGAR MacCONKEY
El agar McConkey es un medio diferencial empleado para el aislamiento de

ENTEROBACTERIACEAS y enumeracin de bacterias coliformes de aguas; productos
lcteos, productos crnicos y otras fuentes. Su carcter diferencial est basado en la
presencia de sales biliares y cristal violeta, adems de la base nutricional, que inhiben
el desarrollo de microorganismos Gram (+) y la presencia de lactosa como carbohidrato
diferencial de la capacidad fermentativa de las enterobactericeas. Los organismos
coliformes desarrollan dando colonias rojas o rosadas debido a la acidez que produce
por la fermentacin de la lactosa y por absorcin del Rojo Neutro que acta como
indicador. Los microorganismos entricos que desarrollan formando colonias incoloras
indican que no fermentan la lactosa, son presuntivas de entricos patgenos.
Composicin: - Peptona 17 g
- Proteosa peptona 3 g
- Lactosa 10 g
- Sales Biliares N 3 1.5 g
- NaCl 5 g
- Agar 13.5 g
- Rojo Neutro 0.03 g
- Cristal Violeta 0.001g
Preparacin: Suspender 50 g de agar McConkey en 1000

mL de agua destilada y calentar hasta disolver

completamente. Enfriar a 55C y ajustar el pH a 7.2 - 7.4;
distribuir en frascos hasta la mitad de su capacidad y este-
rilizar al autoclave a 15 lb de presin por 15 minutos.
Enfriar a 55C y repartir en placas Petri estriles.
CUESTIONARIO:
1.-Cul es la razn de calentar el medio slido en preparacin, antes de esterilizarlo?
2.- Puede usted medir y ajustar el pH a un medio caliente? Por qu?

Prctica N4
Coloracin Gram y Ziehl Neelsen
OBJETIVOS:
- Diferenciar a los microorganismos por su capacidad tintoreal.

- Relacionar la diferencia en composicin de pared celular en funcin a la
capacidad de tincin con el colorante de Gram.
I. COLORACION - GENERALIDADES
Debido a la naturaleza qumica de la clula bacteriana, su afinidad por los colorantes

bsicos es manifiesta, si tomamos en cuenta su principal contenido de cidos nucleicos.
Esta propiedad ha sido aprovechada para estudiar mejor los diferentes tipos
morfolgicos y estructuras (cpsulas, esporas, flagelos, etc.) que ayudan a la
identificacin de una especie o grupo en particular.
Los colorantes de mayor aplicacin son los derivados del alquitrn de hulla (anilinas):
Cristal Violeta, Violeta de Genciana, Fucsina Bsica, Safranina, Azul de Metileno y
Verde de Malaquita. Actan mejor mediante la adicin de mordientes, porque aumentan
la permeabilidad de la pared celular y membrana citoplasmtica.
Las coloraciones de rutina con un solo tinte no permiten observar con nitidez cada una
de las estructuras mencionadas. De mayor aplicacin prctica son las especficas o
diferenciales que requieren prolijidad para un resultado satisfactorio ya que intervienen
dos o ms colorantes.
Para mejor comprensin del mecanismo de coloracin en microorganismos, es

necesario referirse a la accin de los tintes, principalmente los utilizados en
microorganismos.
Las imgenes producidas por absorcin en las preparaciones coloreadas son ms
fciles de interpretar que las imgenes de difraccin dadas por las preparaciones
frescas, sobre todo, teniendo en cuenta que los diferentes elementos celulares poseen
casi el mismo ndice de refraccin, lo que hace su diferenciacin difcil.
En general, las bacterias tienen afinidad por los colorantes derivados de la anilina o en
especial por aquellos de carcter bsico. Estos colorantes llevan en su parte cromfora
carga electro-positiva, lo que tendra una fuerte afinidad por los grupos electronegativos
que normalmente presentan las bacterias en su protoplasma, entre los cuales se
encuentran los cidos nucleicos y sus derivados.
Para una breve tincin hay que tomar en cuenta la naturaleza de la bacteria; edad del
cultivo, muestra y preferentemente una buena aplicacin de la tcnica.
COLORANTE.-
Definicin.-
Sustancia que tiene la propiedad de comunicar color a otros cuerpos de cualquier
naturaleza.
Composicin.-
Para que una sustancia sea colorante debe estar compuesta por:
MOLECULA INCOLORA + CROMOFORO + AUXOCROMO = COLORANTE
Cromforo
N=N
Cromgeno
COLORANTE
Donde:
Cromgeno: Son las molculas que poseen potencialidad de coloracin; esta

potencialidad es conferida por un radical llamado CROMOFORO.
Cromforo: Son grupos de tomos no saturados susceptibles de dar

coloracin a las molculas de las cuales forman parte; la fuerza de los
cromforos vara con la naturaleza de sus tomos y de su estructura. Algunos
de estos grupos dan reaccin bsica. Ejm.: Grupo AZO (-N=N-), grupo
INDAMINICO (-N=), grupo AZINA (*). Otros dan reaccin cida,por ejm. grupos
Nitro: NO2.
Auxocromo: Sustancias no saturadas, debido a esta insaturacin influyen en el

color. Pueden ser:
Simples: Cuando cada uno encierra un tomo no saturado. Ejm.:

grupos -OH, -SO3H, NH2.
Compuestos: Cuando cada uno encierra dos tomos no saturados.

Ejm.: Grupos hidroxilaminados (-NHOH), grupos
hidroxnicos (-NHNH2), grupos Tiohidroxilaminados (-
SNH2).
En bacteriologa se emplean colorantes cidos y bsicos, siendo los bsicos de mayor

importancia para el bacterilogo.
CLASIFICACIN.-
Los colorantes se clasifican en lo posible de acuerdo con los grupos cromforos que
contienen.
1.- COLORANTES NITRO: El cromforo es -NO2; todos son cidos. El grupo

comprende: cido pcrico, aurancita, amarillo de Martens.
2.- COLORANTES AZOICOS: El cromforo es -N=N-; une anillos de benceno o

naftaleno.
a) Monoazoicos: Ejm.: Anaranjado de metilo, Sudn R, Anaranjado G, Amarillo

Brillante S, Rojo Burdens, Crisoldina Y, Rojo de Metilo.
b) Poliazoicos: Ejm.: Azul azoico, Sudn IV, Azul de Tripn, Negro Sudn B,
Rojo Congo, Escarlata Bielrich, Pardo Bismarck Y.
3.- COLORANTES DE ANTRAQUINONA: Derivan del Antraceno, el anillo qumico

es el cromforo y la antraquinona es el cromgeno.
Ejm.: Purpurina, Alizarina, Rojo de Alizarina.
4.- COLORANTES DE QUINONIMINA: Contiene dos cromforos: el grupo de la

Indamina N y el anillo quinnico.
Ejm.: Azul de Indofenol, Azul Celeste A y B, Azul Celeste de Metilo, Azul de

Metileno, Verde de Metileno, Violeta de Metileno, Tionina, Azul de Toluidina O,
Azul Brillante de Cresilo, Violeta de Cresilo, Resarzurina, Sulfato de Azul Nilo,
Rojo Neutro, Safranina O, Violeta Amatista, Indulina, Nigrosina.
5.- COLORANTES DE FENILMETANO: En este grupo figuran los colorantes de

mayor importancia en bacteriologa:
a) C. de Diaminotrifenilmetano: Son colorantes fuertemente bsicos.

Ejm.: Verde Brillante, Verde de Malaquita, Verde Claro Amarillento SF.
b) C. de Triaminotrifenilmetano: Fucsina cida, Violeta Cristal, Verde de Etilo,

Azul de Metilo, Verde de Metilo, Rosanilina, Azul Espritu, etc.
6.- COLORANTES DE XANTENO: Derivan del compuesto xanteno.
Ejm.:
-C. de Pironina: Pironina B, Pironina Y.

-C. de Rodamina: Rodamina B.
-C. de Fluorano: Eosina B, Rosa de Bengala.
-C. de Fenolftalena: Verde de Bromocresol, Prpura de Bromocresol, Azul de
Bromotimol, Fenolftalena, Rojo de Fenol y otros.
RECOMENDACIONES GENERALES PARA CUALQUIER COLORACION
Cualquiera de las tcnicas de coloracin bacteriana implica un cuidadoso

procesamiento del material a colorearse. La calidad de los tintes, fijadores, mordientes
y decolorantes debe estar garantizada al igual que la preparacin.
ETAPAS A SEGUIR:
(1) EXTENSION O FROTIS

La lmina debe estar transparente, desengrasada y limpia. Si el cultivo es
lquido, con el asa de siembra en aro esterilizada previamente al rojo, tomar 1-2
gotas y extender suavemente sobre el centro del portaobjetos. Si el cultivo es
slido, primero colocar con el asa 1 gota de agua destilada estril sobre el
portaobjetos y luego tomar el inculo, emulsionar y extender igual que en la
anterior.
(2) FIJACION
Someter el frotis a la llama del mechero con calentamiento moderado o con
alcohol de 70% u otro lquido fijador.
(3) COLORACION
Cubrir la extensin fijada con la solucin colorante ensayada. Evitar evaporacin
por el tiempo que debe actuar. Se intensifica la coloracin con el uso de mordien-
tes como el lugol en el caso de tincin GRAM, cido tnico para teir flagelos,
etc. El tiempo vara de acuerdo a la tcnica.
(4) DIFERENCIACION
Con alcohol simplemente, alcohol acetona o cidos fuertes, como agentes
decolorantes. El empleo de cada uno depende de la tcnica. Deben dejarse
actuar hasta que el lquido quede incoloro, para desprender el exceso de colo-
rante.
(5) LAVADO
Con agua corriente, para sacar el exceso de diferenciador; en algunos casos se
recomienda usar agua destilada.
(6) DECOLORACION
Para tincin de estructuras que se decoloran por la accin de los diferenciadores.
Hacer actuar los colorantes de contraste, el tiempo vara segn la tcnica.
(7) LAVADO FINAL

A chorro continuo de agua corriente hasta que arrastre todo exceso de colorante.
Es preferible para algunas tcnicas, el uso de agua destilada solamente. Evitar
formacin de precipitados.
(8) SECADO
Preferible al ambiente, colocando el preparado en plano inclinado para el
escurrimiento y con el frotis protegido de polvo o impurezas. Se puede acelerar
el secado con el calor del mechero, evitando sobrecalentamientos.
(9) OBSERVACION
Observar al microscopio con lente de inmersin y aceite de cedro. Conviene
primero enfocar con lente de menor aumento (10X).
II. COLORACION POR EL METODO DE GRAM
Es uno de los principales mtodos de amplia utilidad para clasificar a las bacterias en
dos grandes grupos: Gram positivos y Gram negativos. Las primeras toman el Violeta
de Genciana tindose de azul violceo y las segundas, pierden el Violeta de Genciana
al ser lavadas con el diferenciador (alcohol acetona); es necesario imprimirle un
colorante de contraste: fucsina o safranina, para ser observadas, tindose de rojo.
MECANISMO DE LA COLORACION GRAM
Se ha estudiado intensamente desde su iniciador (el dans Christian Gram, 1884) hasta
nuestros das, el mecanismo ntimo de la COLORACION GRAM, surgiendo varias
teoras al respecto:
La ms generalizada dice que el Violeta de Genciana en mezcla con el Lugol (mordiente)
forma en la clula el complejo CARBOHIDRATO-PROTEINA-RIBONUCLEATO DE
MAGNESIO, y luego sta, al ser tratada con el alcohol acetona (diferenciador) no cede
el colorante, quedando teida de violeta. En cambio las que ceden el colorante por el
tratamiento con el colorante de contraste (fucsina o safranina) se tien de color rojo
pudiendo ser observadas. Estudios recientes comparativos atribuyen el carcter de
gram positividad a la estructura qumica de las paredes celulares; entre otras,
principalmente, al contenido de lpidos. En las gram positivas la permeabilidad de las
paredes resistentes puede decrecer por el efecto deshidratante del alcohol, mientras
que en las gram negativas el alcohol extrae de sus paredes el gran contenido de lpidos
aumentando la permeabilidad. De esta manera, fcilmente escapa el complejo cristal
violeta-yodo o violeta de genciana-yodo.
Es evidente entonces que la pared de las bacterias Gram positivas interpone una barrera
que impide acceso al decolorante; en consecuencia, evita la prdida del complejo tinte.
Si las Gram positivas teidas se tratan con lisozima se liberan protoplastos que retienen
el colorante, mostrando que la clula misma y no la pared es el sitio de la reaccin Gram.
Sin embargo, al actuar el decolorante, los protoplastos pierden el tinte y se hacen Gram
negativas.
Otros experimentos como la rotura mecnica de la clula o el procesamiento con la
enzima ribonucleasa, convirtiendo en Gram negativas las que inicialmente fueron Gram
positivas, nos conduce al convencimiento que la integridad estructural fisiolgica de la
pared celular juega un papel importante en el mecanismo de este mtodo de coloracin.
Es evidente entonces que la causa de la coloracin Gram gravita en la diferencia de

composicin qumica de la pared y protoplasma celular de las Gram(+) y Gram(-).
Para una buena tincin hay que tomar en cuenta la naturaleza de la bacteria, edad del
cultivo o muestra, el carcter cido o bsico del medio y preferentemente una buena
aplicacin de la tcnica. Cualquier variacin puede alterar el resultado.
Cuando el cultivo es viejo, las bacterias Gram(+) se tornan Gram(-). En cultivos
demasiado jvenes, las clulas individuales pueden reaccionar con una u otra forma de
tincin. En el caso de ciertas especies bacterianas, por ejemplo Neisserias saprofticas
que son bacterias Gram(-) toman inicialmente en forma tan intensa la coloracin Gram,
que a una discreta coloracin puede que aparezcan como Gram(+), prestndose a
confusin en el diagnstico morfolgico.
Aparte de la reaccin Gram, hay otras caractersticas diferenciales entre ambos grupos
con propiedades fundamentales que guardan relacin con la Gram positividad.
CARACTERISTICAS DIFERENCIALES
PROPIEDAD GRAM (+) GRAM (-)
Susceptibilidad a penicilina y sulfonamida, efecto Marcada Mucho menos

bacteriosttico de tintes bsicos, detergentes
aninicos.
Susceptibilidad a baja superficie de tincin. Marcada Mucho menos
Digestin por tripsina o pepsina (clulas muertas). Resistente Susceptible
Pared celular solubilizada por lisozima. Muchas spp. Requiere pre-

tratamiento
Carcter fisico-qumico de la pared celular. Gruesa, pocos Delgada, de varias
Contenido en lpidos. aa., y 1-4% capas y ms
lpidos compleja, ms aa. y
22% lpidos
Proporcin de RNA y DNA en la clula. 8:1 Casi igual
Resistente al Azida de Sodio. Marcada Mucho menos
Requerimientos nutritivos. Complejos Relativa, simple
Ejemplos:
Bacterias Gram(+): Staphylococcus aureus, Streptococcus viridans,

Bacillus subtilis, Diplococcus neumoniae y otros.
Bacterias Gram(-): Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Salmonella typhi y otros.
MATERIAL.-
1.- Cultivos en caldo de 24 horas de Gram(+): Staphylococcus aureus,

Streptococcus faecalis, Bacillus subtilis. Gram(-): Escherichia coli.
2.- Batera Gram: Cristal Violeta, Fucsina Bsica, Lugol, Alcohol-acetona .
3.- Lminas limpias, asas de siembra, lpiz graso, gradillas.
4.- Microscopio y aceite de inmersin. Papel lente. Solucin desinfectante.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Del cultivo de bacterias Gram(+), tomar el inculo con el asa de siembra,
siguiendo las indicaciones del instructor. Extender sobre la lmina conforme se indica
en las recomendaciones generales. Flamear nuevamente el asa hasta quedar estril y
colocar en la gradilla.
2.- Fijar la preparacin a la llama o al ambiente. En el primer caso por pasadas
ligeras. Se controla sobre el dorso de la mano. Si el calentamiento es moderado, no
habr calcinacin.
3.- Cubrir con la solucin Cristal Violeta por 1 minuto.
4.- Lavar ligeramente con agua corriente.
5.- Cubrir la preparacin con Lugol, por 1 minuto.
6.- Diferenciar con alcohol acetona hasta que ste no arrastre colorante. Es mejor
regular la accin del alcohol con movimientos de balanceo con la preparacin antes de
ser descartado.
7.- Lavar con agua corriente.
8.- Contrastar con el colorante Fucsina bsica o Safranina, por 10 segundos a 1
minuto.
9.- Lavar con agua corriente. Prolongar el lavado para evitar precipitados.
10.- Secar al ambiente o con ayuda del mechero.
11.- Observar al microscopio con lente de inmersin y aceite de inmersin.
RESULTADOS.-
Se observarn cocos aislados, en parejas, en racimos regulares e irregulares y en

cadenas. Tambin bacilos rectangulares, aislados o en cadenas. Todos de color morado
intenso, si la tcnica ha sido bien seguida. Son los GRAM POSITIVOS.
Repetir la tcnica con el otro cultivo. Destacar la observacin de bacilos pequeos de

extremos romos, aislados de color rojo. Tambin cocos en forma de granos de caf y
por parejas. Son los GRAM NEGATIVOS.
III. COLORACION DE MICROORGANISMOS

ACIDO-RESISTENTES
Otra coloracin diferencial es la coloracin cido resistente o ZIEHL-NIELSEN que acta

fuertemente sobre un grupo de microorganismos llamados ACIDO-RESISTENTES,
porque toman el colorante en caliente y resisten a la decoloracin frente a alcoholes y
cidos fuertes.
Aunque son Gram(+) el carcter ACIDO-RESISTENTE se presta para una serie de
interpretaciones de acuerdo a la naturaleza qumica del microorganismo con este
carcter. Ejm.: Mycobacterium tuberculosis (bacilo tuberculoso) y formas afines. Con-
tiene en su citoplasma gran proporcin de lpidos y grasas insaturadas al igual que en
la cubierta.
Cuando la fucsina fenicada en solucin acuosa alcohlica acta en caliente tie de rojo
al bacilo y a la accin de cidos fuertes (HCl al 3%, H 2SO4 al 20%, HNO3 al 33%) resisten
a la decoloracin. Los organismos acompaantes que carecen del carcter de ACIDO-
RESISTENCIA se decoloran a este tratamiento, y en cambio se tien con el colorante
de contraste: AZUL DE METILENO (METODO DE ZIEHL-NIELSEN) y ACIDO PICRICO
(ZIEHL-COOPER).
INTERPRETACION DEL MECANISMO DEL METODO ZIEHL-NIELSEN
Existen 3 criterios o teoras para la interpretacin de este carcter:
(1) Segn concepto antiguo, la ACIDO-RESISTENCIA se deba solamente al

carcter seroso de la pared celular de este tipo de microorganismos. Mediante el
calentamiento era posible la impregnacin del colorante, quedando retenido no obstante
al tratamiento con cidos.
(2) Lamanna (1946) sostiene que se debe a solubilidades relativas: la fucsina

fenicada por ser ms soluble en fenol y ste en grasas y lpidos (presentes en el bacilo
tuberculoso y afines) el complejo tinte fenol se impregna fuertemente en el citoplasma
celular. Al hacer actuar cidos fuertes, una gran resistencia se manifiesta a la decolo-
racin alcohol-cida.
Es necesario que la cubierta celular permanezca intacta, de lo contrario los lpidos
abandonarn la clula y desaparecer la propiedad de cido-resistencia. Esta teora
impera hasta la fecha, por su interpretacin lgica.
(3) Yoguin y otros, consideran que la presencia del cido miclico en el protoplasma
bacteriano permite una tincin rojo tenue y que los grnulos ms intensamente teidos
se deben a la mayor parte del colorante que se halla libre en la clula. Por otro lado
sostiene que la cido resistencia depende de la presencia de una hemicelulosa o a una
sustancia protenica similar a la quitina.
MATERIAL.-
1.- Esputo de enfermos tuberculosos.

2.- Batera de coloracin: Fucsina fenicada de Ziehl, Azul de Metileno al 0.3%,
alcohol cido ntrico al 33%, cido clorhdrico al 3%.
3.- Lminas limpias, asas de siembra, lpiz graso, gradillas.
4.- Microscopio, aceite de cedro, papel lente.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Con sumo cuidado, tomar con el asa de siembra un poco de esputo. Extender
sobre la lmina sin llegar a los bordes exteriores.
2.- Quemar el asa de siembra para matar excedente de inculo. Regresar el asa de
siembra a la gradilla.
3.- Cubrir la preparacin con el colorante Fucsina. Calentar por 3 veces hasta el
desprendimiento de vapores blancos, evitar que hierva. A la evaporacin por
calentamiento, agregar ms colorante. Operar as por 5 minutos.
4.- Diferenciar con alcohol-cido hasta que corra incoloro.
6.- Recolorear con el azul de metileno, durante 1 minuto.
7.- Lavar con agua corriente. Prolongar el lavado para arrastre de precipitados.
8.- Secar al ambiente o a la llama del mechero.
9.- Observar al microscopio con lente de inmersin y aceite de cedro.
RESULTADOS.-
Los microorganismos ACIDO-RESISTENTES se observarn como bacilos delgados y

un poco alargados, teidos uniformemente de rojo o con granulaciones rojo intenso
sobre el fondo rosado del bacilo. La flora acompaante (no cido-resistente) aparecer
teida de azul: cocos, diplococos, o cocobacilos, macrfagos y otros elementos blancos.
Esquematice y analize sus resultados.
CUESTIONARIO
1.- Afecta la edad del cultivo a la coloracin de Gram?
2.- Existen diferencias qumicas que expliquen la velocidad de decoloracin en las

bacterias Gram (+) y Gram(-)?
3.- Qu componentes bacterianos permiten la resistencia a la decoloracin con alcohol

cido?
4.- Qu significa BAAR y cul es su interpretacin?

Prctica N5
Coloraciones especiales I
OBJETIVO:
Evidenciar las diferentes estructuras microbianas mediante coloraciones especficas.
En trabajos microbiolgicos de rutina, basta la coloracin Gram para detectar esporas

en microorganismos que las poseen, las que se observan incoloras en contraste con el
resto de la bacteria teida. Sin embargo, para observaciones ms detalladas de stas y
dems estructuras se requiere de mtodos especiales que siempre se hacen en base a
tintes bsicos.
I. COLORACION DE ESPORAS: METODO DE WIRTZ-CONKLIN
Los microorganismos que las forman deben encontrarse en condiciones adversas. Se

evidencian en la etapa de vida latente. Caracterizan a los gneros Bacillus y
Clostridium y su localizacin y forma ayudan en cierto modo a la identificacin
presuntiva especfica.
Por la naturaleza y grosor de la membrana y bajo contenido en agua, las esporas son
muy difciles de teir; se hace actuar el tinte en caliente en idntico procedimiento al
efectuado para ACIDO-RESISTENTES. La coloracin de contraste para el cuerpo
bacteriano se consigue con Safranina.
Si el cultivo es joven no hay esporas y los microorganismos se teirn uniformemente.
Es necesario que ste permanezca por 3-4 das a temperatura ambiente, despus de
una incubacin ptima de 24 horas o sembrar el cultivo en un medio especfico de
esporulacin. De esta manera el material resulta ideal para ensayos de cualquiera de
las tcnicas especficas de tincin (VER TECNICA).
MATERIAL.-
1.- Cultivo de 5 das de Bacillus subtilis (en caldo corriente).

2.- Batera de coloracin: Verde de malaquita al 5%, Safranina o Fucsina Bsica al
0.5%, agua destilada o corriente.
3.- Gradilla, lpiz graso, asa de siembra.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Fijar la muestra al calor y cubrir con Verde de Malaquita en caliente.
3.- Contrastar con Safranina o Fucsina por 1 minuto.
5.- Secar y observar (aceite de cedro y lente de inmersin).

RESULTADOS.-
Esporas verdes y el resto del cuerpo bacteriano rojo. Posicin de la espora central o
subcentral, sin deformacin del bacilo.
Figura 5. Algunos ejemplos de esporas.
II. COLORACION DE CAPSULAS: METODO DE TINCION NEGATIVA
De ordinario la cpsula se compone de material soluble en agua, as como de sustancias

no inicas, generalmente polisacridos. Las tcnicas de tincin frecuentemente se
basan en una interaccin qumica entre sustancias ionizadas. El mejor modo de
visualizar cpsulas consiste en usar el microscopio de fase para observar los
organismos en un medio que proporcione un fondo adecuado. En los laboratorios ms
modestos, donde no se cuenta con equipo de contraste de fase, es posible duplicar los
resultados preparando un montaje hmedo que contenga, junto con las bacterias
encapsuladas, algunas partculas de carbn en suspensin. Si se reduce la intensidad
lumnica con el iris del diafragma (o bajando el condensador) se puede obtener un efecto
como de contraste de fase y as, las cpsulas se observarn como halos o anillos
incoloros en derredor de los organismos. Algunas veces es posible emplear con xito
tcnicas de tincin en las que el material de la cpsula se deshidrata primero con
solucin salina concentrada; pero en los laboratorios estudiantiles esta tcnica rara vez
produce resultados.
MATERIALES.-
1.- Cultivos de 24 horas de Klebsiella pneumoniae y Staphylococcus epidermidis

en agar-fosfato-triptosa inclinado.
2.- Tinta china (recientemente filtrada).
3.- Azul de metileno Loeffler.
PROCEDIMIENTO.-
Prepare una suspensin diluida de Klebsiella pneumoniae mezclando, sobre el porta,

un poco de material del cultivo con varias gotas de agua; utilice nicamente tanto
material de cultivo como se le pegue al borde del asa al tocar ligeramente con sta el
cultivo. A esta suspensin diluida, agregue tinta china, apenas toque la tinta con el borde
del asa y luego mzclela con la suspensin de bacterias. Si hace esto correctamente,
despus de mezclar bien la suspensin quedar de un gris oscuro. Con cuidado coloque
el cubreobjetos sobre la preparacin y examnela con el objetivo de alto poder en seco.
Las partculas de tinta china se vern dotadas de movimiento Browniano muy rpido y
las bacterias de formas plidas como fantasmas. Al enfocar crticamente sobre una
clula bacteriana, reduzca la luz con el diafragma hasta que la clula se torne algo
oscura. Si la preparacin se hizo correctamente, se podr apreciar un efecto como de
halo alrededor del organismo; este halo representa la cpsula. Ntese como las
partculas de carbn en rpido movimiento rebotan con el halo sin llegar a tocar nunca
la clula bacteriana. Despus de observar con el objetivo de alto poder en seco, con
gran cuidado coloque una gota de aceite de inmersin sobre el cubreobjetos y examine
la preparacin con el objetivo de inmersin. Enfoque crticamente, encuentre un campo
demostrativo y dibjelo.
Repita el mismo procedimiento ahora con Staphylococcus epidermidis, Al examinar
cuidadosamente se observar que las partculas de carbn de hecho golpean las clulas
bacterianas puesto que stas carecen de cpsula que las proteja.
El mtodo de Gin es una sencilla modificacin de esta tcnica. Mezcle cantidades

iguales de agua y tinta china, y luego aada un asa con K. pneumoniae, y extienda la
suspensin suavemente sobre el porta. Permita que el frotis se seque pero no lo fije a
la llama. Contratia con azul de metileno, lave y seque. Examine con aceite de inmersin
y dibuje un campo tpico.
RESULTADOS.-
Diplococcus con cpsula azul suave, clulas acompaantes violeta o rosado (segn el
colorante empleado).
Figura 6. Ejemplos de cpsulas por tincin positiva (izq.) y tincin negativa (der.)
III. COLORACION DE FLAGELOS: METODO DE LEIFSON
Para teir los flagelos se requiere mucha experiencia de laboratorio. La teora de

procedimiento es bastante sencilla. El colorante se aplica junto con el cido tnico como
mordiente, el cual se adhiere a la clula y a los flagelos en capas sucesivas hasta que
la bacteria y los flagelos aumentan sus dimensiones. Esto es necesario debido a que
los flagelos son demasiado delgados para ser percibidos con el microscopio ptico. Las
clulas y los flagelos recubiertos por capas de mordiente nos dan una imagen algo
aumentada y distorsionada.
La ejecucin de la tincin de flagelos presenta muchos inconvenientes. Una de las cosas

que hay que evitar es la presencia de materia orgnica, ajena a las clulas a teir, en el
porta. El mordiente tiene una tremenda afinidad por cualquier tipo de materia orgnica
y, por eso, teir intensamente cualquier rastro de desecho orgnico presente en el
porta. Por lo tanto, antes de empezar debe asegurarse de que el portaobjetos este
extremadamente limpio. De preferencia, los portas deben ser nuevos y nunca haber sido
tocados con las manos excepto por los bordes. Otro problema con esta tincin es que
los flagelos son tan delgados y frgiles que tienden a romperse con facilidad. Debido a
esto, en cualquier preparacin donde se hayan teido flagelos se observarn gran
cantidad de flagelos libres, despegados de las clulas y desparramados por todo el
frotis. Sin embargo, su paciencia y atencin a los detalles lo recompensarn con una
preparacin excelente.
MATERIALES.-
1.- Una suspensin, en agua destilada, de un cultivo joven y de alta motilidad de

Proteus vulgaris (de 6 a 12 horas) y Pseudomonas aerugionsa..
2.- Portaobjetos qumicamente limpios (remojados 24 horas en cido crmico y
enjuagados con agua destilada) y nuevos. Estos se le distribuirn individualmente.
3.- Colorante Leifson para flagelos (recientemente filtrados).
4.- Pipeta estril de 1 mL.
5.- Pipeta Pasteur.
PROCEDIMIENTO.-
Lave suavemente con agua destilada la superficie de crecimiento de cultivo en

agar-nutriente inclinado y transfiera a tubos limpios la suspensin de bacterias as
obtenidas.
Proteus vulgaris es una bacteria pequea en forma de bastn que se encuentra en la
naturaleza donde quiera que se encuentre materia en descomposicin. Tambin se le
encuentra en la flora normal del aparato intestinal. La mayor parte de sus cepas
presentan gran motilidad activa.
Antes de empezar prepare el portaobjetos demarcando en l, con un crayn grueso, un
rectngulo completamente cerrado cuya rea sea dos tercios de] rea del porta, como
se aprecia:
Limtese a asir el porta por el rea no demarcada. Con una pipeta, saque 0. 1 mL de
suspensin bacteriana de la regin ms superficial de la suspensin acuosa de Proteus
vulgaris (aqu se encontrarn los organismos con ms motilidad) y deposite una gota
de esta suspensin cerca de uno de los lados del rectngulo demarcado. Incline el porta
unos 30-40 grados para que la gota de suspensin corra hasta el extremo opuesto del
rectngulo. Si el porta est meticulosamente limpio, la gota se deslizar en lnea recta
por el vidrio. Ponga el porta a secar al aire en posicin inclinada. No fije a la llama. Bae
el porta con colorante de Leifson; asegrese que el colorante cubra toda el rea
demarcada.
Despus de que la reaccin haya precedido por 10 minutos, elimine el exceso de
colorante y lave el frotis en la llave muy suavemente. Seque al aire y examine con el
objetivo de inmersin. Busque un campo donde puedan apreciarse claramente
organismos flagelados. Aunque es tpico de este tipo de preparacin el presentar
grandes reas borrosas o mal definidas, de ordinario habr un rea del frotis en donde
los flagelos se apreciarn claramente.
RESULTADOS.-
Se observarn flagelos como finos filamentos de color rojo. Cuerpo bacteriano de color
azul.
Figura 7. Algunas bacterias con flagelo(s).
IV. COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS: METODO DE

LOEFFLER
Muchas bacterias acumulan en su protoplasma grandes reservas de fosfato insolubles

en agua. Estos son los grnulos metacromticos o de volutina que aparecen como
grnulos refrctiles, cuando se observan al microscopio sin teir. Con colorante de Azul
de Toluidina u otros tintes azules, se tornan de color violceo o ligeramente rojo
violceo; de ah el nombre de metacromtico.
Los bacilos diftricos y difteroides, poseen numerosos grnulos de este material; los
primeros son agentes causantes de la difteria y slo estn presentes en casos agudos.
Los segundos, saprofticos, constituyen una material til para las experiencias de
coloracin. Se pueden encontrar en muestras de saliva de humanos.
MATERIAL.-
1.- Muestra de saliva de los alumnos.

2.- Solucin colorante de Azul de Metileno de Leffler.
3.- Agua corriente.
4.- Lminas limpias, asa de siembra, lpiz graso.
5.- Microscopio, aceite de cedro.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Extender y fijar la muestra al calor.

2.- Colorear con el Azul de Metileno por 1 minuto.
4.- Secar y observar.
RESULTADOS.-
Bacilos difteroides, largos y ligeramente gruesos de color azul claro, con granulaciones
de color azul intenso o violeta. En caso de coloracin purprea (violeta), el color se debe
a la oxidacin del colorante por el lcali que lleva la frmula.
TABLA
ESTRUCTURAS Y CORPSCULOS METODOS ESQUEMA OBSERVACIONES
Esporas Wirtz-Conklin
Cpsula Tincin negativa
Flagelo Leifson
Corpsculos Metacromticos. Leffler

Prctica N6
Coloraciones especiales II
OBJETIVO:
Evidenciar las diferentes estructuras microbianas mediante coloraciones especficas.
I. DEMOSTRACION DE PARED CELULAR BACTERIANA: METODO DE ROBINOW
La pared celular bacteriana se puede tornar visible, a pesar de que sta no se distingue
como entidad discreta en las coloraciones ordinarias. La tincin para la pared celular se
aprovecha del hecho de que los contenidos citoplsmicos se pueden hidrolizar
diferencialmente o fijar dejando la pared celular sin afectar.
Tambin es posible tornar visible la pared celular de una manera indirecta
aprovechndose del hecho de que ciertos colorantes simples (por ejemplo, azul de
metileno) no tien la pared celular mientras que otros (violeta cristal) tien tanto la pared
celular como el citoplasma. Esta es la razn por la cual las mismas clulas se ven ms
pequeas cuando se tien con azul de metileno que cuando se tien con violeta cristal.
MATERIALES.-
1.- Cultivo inclinado joven de Bacillus subtilis (12- 18 horas).

2.- Fijador de Bouin.
3.- Acido tnico (5-10%)
4.- Cristal violeta (0.02%)
PROCEDIMIENTO.-
Prepare un frotis relativamente concentrado de Bacillus subtilis sobre un portaobjetos

limpio.
Antes de que la suspensin bacteriana se seque sobre el porta, cbrala directamente

con el fijador de Bouin y djelo reaccionar unos 10 minutos.
Incline completamente el porta sobre el cao para drenar totalmente el fijador; luego
agregue el cido tnico durante 20-30 minutos.
Lave suavemente en la llave. Es inevitable que al lavar en la llave, algo de material se

desprenda del frotis; trate de minimizar el desprendimiento pero al mismo tiempo lave
bien, hasta que el agua ya no arrastre colorante.
Colorear con cristal violeta por 10-15 segundos. Lavar con agua y secar, despus
examine con aceite de inmersin.
Si ti correctamente, las paredes celulares aparecern de un azul intenso, mientras

que el citoplasma se ver de un color amarillo. Con esta tincin es necesario examinar
bien hasta encontrar el campo ms demostrativo; proceda a dibujarlo.
VI. COLORACION DE MEMBRANA CELULAR: METODO DE KNAYSI

La membrana citoplasmtica es de naturaleza lipoproteica y da una reaccin cida

tindose intensamente con colorantes bsicos y neutros.
No obstante esta propiedad, el doble contorno de la membrana se aprecia mejor cuando

se retrae el protoplasma o cuando se trata con algn solvente orgnico que pueda diluir
las grasas y deje expuesto el contorno a la accin de los colorantes.
MATERIAL.-
Cultivo de Bacillus subtilis.
Fijador de Bouin.
Lugol fuerte.
PROCEDIMIENTO.-
Preparar un frotis y dejar actuar vapores de eter sobre l durante cinco minutos; luego
fijar con lquido de Bouin durante 10 minutos.
Transcurrido este tiempo escurrir el lquido de Bouin y depositar una gota de lugol fuerte
sobre la preparacin.
Colocar un cubreobjeto y observar.
La membrana se visualizar de un color pardo oscuro y el citoplasma amarillo.

VII. TINCION DE NUCLEO BACTERIANO: METODO DE ROBINOW
Una estructura abundante pero difcil de visualizar dada su complejidad, es el ncleo

bacteriano, pues el RNA y el citoplasma se colorean tan intensamente que impiden la
visualizacin del DNA.
Esto se evita tratando los frotices con ribonucleasa o con cidos para destruir la afinidad
del citoplasma por el colorante y aumentar la del DNA.
MATERIAL.-
Cultivo de Bacillus subtilis y/o Escherichia coli.
Fijador de Bouin.
Etanol al 70%.
HCl 1N.
Buffer fosfato 0.01M pH 7,0.
Colorante Giemsa.
PROCEDIMIENTO.-
Preparar un frotis y fijarlo con el fijador de Bouin durante 1 a 2 minutos a 45 - 50C.
Enjuagarlo quitando el exceso de fijador y sumergirlo en etanol al 70% hasta su

coloracin; luego sumergirlo en HCl 1N previamente calentado a 60C por 10 minutos.
Eliminar el cido con agua de cao y luego lavar con agua destilada dos veces.
Sumergir la preparacin en una solucin de buffer fosfato al que se le han aadido dos
a tres gotas de colorante Giemsa por mililitr.
Colorear por 30 minutos a 37C.
Secar y observar con el objetivo de inmersin.
Observar el ncleo de color azul y el citoplasma incoloro.

VIII. TINCION DE NUCLEO EN LEVADURAS
Ciertos factores citoplsmicos (que normalmente interfieren con el teido del ncleo)
deben hidrolizarse antes de aplicar la tincin nuclear (azul de toluidina).
En el siguiente experimento tambin se tendr la oportunidad de estudiar la morfologa
general de la levadura tpica.
MATERIAL.-
Cultivo fresco (6-12 horas) de Saccharomyces cerevisiae en agar Sabouraud

inclinado.
Solucin de etanol (40%).
Solucin de hidrxido de potasio (0.1 M).
Solucin de toluidina 0.1% en etanol 10%.
Solucin de etanol (10%).
Solucin de yodo de Gram.
PROCEDIMIENTO.-
Prepare un frotis de regular densidad con las clulas de levadura en suspensin en agua
de la llave-, seque al aire. Fije a la flama muy suavemente. Bae el porta durante 1
minuto con solucin de etanol al 40%; lave en la llave.
Bae el frotis con solucin de KOH y djelo reaccionar una hora; si se empieza a
deshidratar, agregue ms KOH. Lave bien a la llave y luego aplique el azul de toluidina
por dos minutos. Lave con etanol al 10%, sacuda el exceso de alcohol y seque al aire.
Prepare un segundo portaobjetos como el anterior pero proceda nicamente hasta el
segundo paso, es decir, hasta el bao con etanol inclusive al 40%.
Omita el tratamiento con KOH. Aplique el azul de toluidina por dos minutos y contine
como en el primer frotis. Compare ambas comparaciones. La segunda demuestra que
la hidrolizacin previa del citoplasma (tratamiento con KOH) es necesaria antes de
aplicar el colorante.
Examine las preparaciones con el objetivo de aceite de inmersin y dibjelas. Los
ncleos se tien de azul obscuro o rosa y el citoplasma de un rosa mucho ms claro
(figura 2-3).
Para continuar el estudio de las levaduras, prepare un montaje hmedo usando yodo de
Gram en vez de agua. Trate de detectar las gmulas y las estructuras internas, tales
como grandes vacuolas. Dibuje algunas clulas representativas como se aprecian con
el objetivo de alto poder en seco y con el de aceite de inmersin.
TABLA DE RESULTADOS
ESTRUCTURAS Y CORPUSCULOS METODOS ESQUEMA OBSERVACIONES
Pared Celular
Membrana celular
Ncleo bacteriano
Ncleo en levaduras
Prctica N6
Cultivo de microorganismos aerobios
OBJETIVOS:
Aislar BACTERIAS AEROBIAS por los mtodos de ESTRIADO,

DISEMINACION Y DIFUSION.
Describir una colonia bacteriana
Relacionar la morfologa colonial con la capacidad tintoreal.
I. CULTIVO DE MICROORGANISMOS
1.- SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
En esta etapa el alumno inicia el aprendizaje e interpretacin de los cultivos bacterianos.

Gracias a la aplicacin de los medios de cultivo, se ha llegado a conocer ampliamente
el comportamiento cultural y fisiolgico de la variada flora microbiana que pulula en los
ambientes, permitindose la identificacin especfica.
Para ello es necesario considerar la metodologa que conduzca a la exacta
determinacin de la especie en el laboratorio.
a.- Siembra y Aislamiento de Microorganismos
Concepto de Siembra: acondicionamiento de un microorganismo en un medio de

cultivo, de acuerdo a sus exigencias vitales, para que en condiciones ptimas de
temperatura y tiempo de incubacin, pueda desarrollar y multiplicarse in vitro. Se
siembra con 2 finalidades: a) para hacer un aislamiento y b) para hacer un trasplante.
Aislamiento: permite la separacin de microorganismos al estado de pureza a partir de

una MUESTRA PROBLEMA. Se requiere un medio slido con gran superficie para que
los microorganismos al ser diseminados sobre el medio, generen su progenie formando
colonias separadas. Si se aislan colonias distintas, cada colonia tendr caracteres
especiales. La morfologa bacteriana ser tambin distintiva.
Transplante: significa la separacin primaria de la cepa a un medio de cultivo apropiado

en tubo, que puede ser lquido o slido. Se conserva la cepa pura y por tanto trasplantes
en medios especiales, se logran conocer las propiedades culturales y bioqumicas y
como resultado, la identificacin especfica.
Los transplantes pueden ser:

- De lquido a lquido
- De lquido a slido
- De slido a lquido
- De slido a slido
ELEMENTOS NECESARIOS PARA LA SIEMBRA

Conocer la procedencia de la muestra (tierra, heces, agua, secreciones, un cultivo en

particular, etc.)
El medio de cultivo frtil y apropiado que condiciona el crecimiento del microorganismo

que se quiere estudiar.
Los dispositivos de siembra: asas, agujas, pipetas Pasteur, pipetas graduadas, hisopos,
esptulas de Drigalsky, etc.. El uso de cada uno segn las indicaciones de siembra.
El cubculo de siembra apropiado, para los cultivos con asepsia. Deben ser instalados
sobre la mesa de trabajo en lugares fuera de corrientes de aire, lmparas germicidas
UV mechero de Bunsen, y equipo que garantice esterilidad y visibilidad durante las
manipulaciones.
Equipo complementario: gradillas, lpiz graso, lminas, desinfectantes, etc.
RECOMENDACIONES GENERALES PARA RECOLECCION Y PROCESAMIENTO

DE MUESTRAS ANTES DE LA SIEMBRA
Los cuidados y precauciones que el bacterilogo o laboratorista presta a las colectas y

manejo de las muestras nunca estn dems, si se persigue consciente y honradamente
aislar la verdadera flora bacteriana de la muestra en estudio. Esto se resume as:
Trabajar con responsabilidad y tener experiencia.
Tomar las muestras en condiciones aspticas en recipientes adecuados y estriles.
Rotular los datos: naturaleza de la muestra, procedencia, fecha de recoleccin y tipo de

examen a efectuarse. Por ejm. en anlisis de agua de regado, indicar la determinacin
de individuos coliformes, o de toda la flora contaminante.
Saber elegir la porcin de la muestra que se desea analizar.
Hacer el anlisis lo antes posible, para evitar la desecacin de la muestra, con la

consiguiente alteracin de la flora presente. En caso de dificultades de transporte o de
distancia, preservar la muestra en refrigerador o en lquidos preservantes. Se consigue
la supervivencia de los microorganismos.
Si la muestra es lquida y transparente, concentrar el inculo por centrifugacin. En caso

contrario (muy turbia), hacer diluciones y elegir la que garantice un buen aislamiento.
Saber escoger los medios de aislamiento y de identificacin para el tipo de

microorganismo que indica el anlisis o el que se desea aislar.
Contar con el equipo de siembra a la mano, adems de los medios de cultivo, asas,
pipetas, etc.; incubadoras, centrfugas, etc.
NORMAS PARA COLECTAR ALGUNAS MUESTRAS A SEMBRARSE EN LAS

CLASES PRACTICAS
(1) Muestras de Heces: usar frascos pequeos de boca ancha con tapas de metal
o bakelita en rosca o cajas pequeas cilndricas de cartn parafinado. Colocar 1 a 5 g.

(2) Muestras de Leche: botellas de 100 mL de capacidad con tapas de bakelita o
corcho. Tomar 50 a 100 mL.
(3) Muestras de Agua: si son transparentes, almacenar en recipientes de vidrio
blanco con capacidad de 250 mL. Es mejor colectar 100 a 200 mL, para asegurar la
pesquisa de los microorganismos. Si son turbias, 20 a 50 mL son suficientes, en frascos
de menor capacidad.
(4) Muestras de Tierra: si est abonada, basta 1 a 4 g, en tubos de prueba de 25 x
120 mm. En caso de tierra virgen el muestreo se har por horizontes de terreno o en
bolsas de polietilieno de mayor capacidad.
(5) Muestras de Orina: en la mujer, preferible sin caterismo (previa desinfeccin de
los genitales externos) en frascos de 100 a 200 mL de boca ancha con tapa de jebe o
bakelita. En el hombre, directamente del chorro de orina recibindola en frascos de boca
angosta. Se descarta el primer chorro.
(6) Regin nasofarngea, amgdalas, odo o cualquier proceso supurativo de la
piel: tomar un hisopo estril, rotarlo sobre la superficie de la zona elegida y colocarlo
dentro de un tubo que contenga un medio de transporte. En heridas supuradas,secre-
ciones uretrales y vaginales se recomienda desinfeccin previa con lquido germicida.
(7) Muestras de Esputo o Saliva: Espectorar directamente en una placa Petri vaca
y estril.
(8) En general, toda muestra slida, debe ser diluida, de preferencia en solucin
salina o en agua destilada estril, antes de la siembra.
(9) La cantidad de inculo a sembrarse debe dosificarse en relacin con la densidad
de la muestra, dispositivo de siembra y volumen de medio utilizado.
2.- AISLAMIENTO DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACAS PETRI
Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie del medio
slido. Se va descargando gradualmente el inculo, para que en los ltimos planos del
medio queden escasas clulas que en el ambiente nutricio se irn multiplicando
logartimicamente hasta formar colonias puras.
Los mtodos de aislamiento varan segn el dispositivo de siembra y la forma de
distribuir el inculo. Cualquiera que sea el mtodo ensayado, aprovechando el mximo
de superficie del medio, se logra el aislamiento del mayor nmero de cepas microbianas.
MATERIAL.-
1.- Cultivo en caldo nutricio, de mezcla de 5 especies bacterianas. Incubacin a

37C por 24 hrs.
Muestras de agua de regado, tierra, leche, regin nasofarngea, conservas
contaminadas, agua de mar, orina, procesos supurativos externos y secreciones
vaginales y uretrales.
2.- Tres placas de agar corriente o nutritivo. Tres ms para demostracin de
aislamiento por difusin. Un frasco con agar fundido.
3.- Un tubo con agua destilada estril, un tubo vaco estril, asa de siembra y varilla
de vidrio estriles, pipetas Pasteur, hisopos, gradillas, lpiz graso o plumn, batera de
coloracin Gram.
4.- Microscopio, centrfuga y estufa graduada a 37C.
a.- Aislamiento por el Mtodo del Estriado

Con el asa de siembra se distribuye el inculo por ESTRIAS en ZIG ZAG, con escasa
separacin unas de otras (1-3) mm). La distribucin puede ser por estra simple (inculo
descrito en un solo plano por todo el medio) y estra en tringulo, cuadrado o pentgono
(estras en 3, 4 5 planos en el mismo medio respectivamente). El nmero de estras
depende de la cantidad de inculo y los planos de siembra ensayados. Se evita romper
el medio.
TECNICA N1
1.- Con la mano derecha, cargar el asa en aro, previamente al rojo, con inculo de
cultivo mixto que sostiene la mano izquierda; destapar el cultivo con el dedo meique y
margen cubital de la mano derecha. Se debe flamear el tubo antes y despus de extrada
la muestra.
2.- Tomar con la izquierda la placa Petri con agar, descansando la base sobre los
dedos medio, anular y meique; el ndice acta de bisagra y con el pulgar, levantar la
tapa lo suficiente para el paso del asa cargada. Esta operacin se realiza a la altura del
mechero encendido.
3.- Descargar el inculo en un punto marginal de la superficie del medio y con el asa
misma, describir las ESTRIAS hasta el margen opuesto de la placa, cuidando de no
romper el medio (ESTRIADO SIMPLE).
En caso de estriado por PLANOS, repetir los pasos 1, 2 y 3 hasta la descarga del
inculo, diseminar en el primer plano. Hacer 1/4 de giro de la placa y continuar con el
estriado en el segundo plano. Volver a hacer 1/4 de giro ms para diseminar en estras
en el tercer plano, de igual modo en el cuarto plano. Puede hacerse el estriado en 5
planos y an en la parte central del medio, con un solo inculo.
4.- Dejar caer suavemente la tapa con el control de los dedos pulgar e ndice.
5.- Rotular datos sobre el dorso de la placa Petri sembrada as: nmero de grupo,
tipo de siembra y fecha.
6.- Incubar a 37C por 24 hrs. Colocar las placas en la estufa en posicin invertida.
TECNICA N2
1.- Levantar con la izquierda y a la altura de la llama el dorso o base de placa Petri
que est invertida sobre la mesa. Con la derecha cargar el asa y depositar el inculo
sobre el medio. Describir las ESTRIAS simples o por planos, manteniendo casi vertical
la placa, con la superficie del medio frente al operador.
2.- Regresar la base sembrada a su posicin normal en la mesa de trabajo.
3.- Poner datos e incubar en igual forma a la anterior.
NOTA: Cada grupo de alumnos debe ensayar el cultivo mixto, ensayando las dos
tcnicas.
Figura 8. Algunas tcnicas de estriado.

Figura 9. Direccin del estriado en placa Petri.

b.- Aislamiento por Diseminacin
Se practica mediante la pipeta Pasteur estril para la toma del inculo. Esta, por la
capilaridad, permite el ascenso del inculo a discrecin el cual es depositado en un
margen del medio y esparcido sobre el medio de cultivo con una esptula de Drigalsky.
La placa Petri del cultivo debe destaparse lo suficiente como para permitir la estrecha
penetracin de la esptula de siembra; as se evita la contaminacin. Ver los pasos de
la tcnica en la parte experimental.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Tomar el inculo del cultivo mixto con la pipeta Pasteur y depositar una gota
sobre el medio de la placa Petri N2, que descansa en posicin normal sobre la mesa.
2.- Devolver el sobrante al tubo de cultivo.
3.- Destapar con la izquierda la placa Petri, lo necesario para introducir la esptula
de Drigalsky y diseminar la gota por la superficie del medio, no pasando dos veces por
el mismo plano.
4.- Desechar la esptula en el frasco bactericida.
5.- Rotular: nmero de grupo, tipo de siembra y fecha.
6.- Incubar igual a los mtodos anteriores.
NOTA: En caso de cultivo muy turbio, el inculo debe ser muy pequeo. Si est diluido,
inocular en el medio ms de una gota.
Figura 10. Tcnica de aislamiento por diseminacin
c.- Aislamiento por Difusin

Se practica de preferencia en ANALISIS CUANTITATIVOS BACTERIANOS. Por
ejemplo, una muestra de agua en la que se desea conocer el nmero de
microorganismos por mL. Es diluida primero al 1/10, 1/100, 1/1000, etc. de acuerdo a la
turbiedad. Se toman alcuotas (1mL) de cada dilucin y se depositan separadamente en
placas Petri vacas y estriles. Sobre cada una se vierte agar fundido y enfriado a 45C
(10-15 mL). La mezcla se agita moderadamente con movimientos ondulantes; se espera
a que el medio solidifique, se rotulan los datos y se incuban las placas en posicin
invertida, a 37C. A las 24 horas aparecern colonias aisladas en superficie y
profundidad, a diferentes planos. Estas ltimas, de forma lenticular y de dimetros
diversos. Los clculos matemticos de las cuentas es motivo de otra prctica.
Una variedad del mtodo consiste en depositar los inculos en tubos de prueba
conteniendo agar fundido. Se agita vigorosamente cada tubo entre las palmas de las
manos y el medio se vierte sobre cada una de las placas estriles antes que solidifique.
Otra modificacin: se toma de la muestra una cantidad conocida del inculo, se vierte
en el primer tubo con el agar fundido, se agita para difusin uniforme, de ste se toma
igual cantidad y se vierte en el segundo tubo, se agita, se toma igual cantidad de inculo
y se vierte en el tercer tubo, se agita y con movimientos rpidos se vierten los 3 tubos
sembrados sobre las respectivas placas estriles. Se obtienen as las diluciones
seriadas y el nmero de colonias ser mayor en las ltimas diluciones. Las placas de
cultivo para incubacin se colocan invertidas para evitar que el agua de condensacin
de la cara interna de la tapa humedezca la superficie. Se asegura el crecimiento de
colonias aisladas.
PROCEDIMIENTO.-
El profesor har la demostracin con una muestra de tierra a 3 diluciones: 10 -1, 10-2 y
10-3. Para los fines de la tcnica seguir cuidadosamente lo indicado por el instructor
luego de la demostracin.
Figura 11. Tcnica de aislamiento por difusin, llamada tambin incorporacin.
MORFOLOGA DE COLONIAS
Ensayados los mtodos de aislamiento en la clase anterior, el alumno podr ahora

observar el resultado de sus siembras sobre el gel (agar corriente), en placas Petri, en
24 48 horas de incubacin.
Si ha seguido las instrucciones, podr visualizar sobre algunos planos del medio,
definidas masas microbianas separadas entre s: COLONIAS. cada COLONIA, no viene
a ser sino el resultado de la multiplicacin logartmica de una clula depositada en un
punto del medio slido, que en condiciones ptimas de crecimiento forma su progenie
con sus caractersticas distintivas de ESPECIES o GRUPOS BACTERIANOS.
La morfologa puede depender de varios factores: naturaleza del medio para el vigor del
crecimiento, temperatura y tiempo de incubacin, modo de divisin celular y tipo de
movimiento de post-fisin; en consecuencia, una variedad de bacteria tiende a formar
constantemente el mismo tipo general de colonia cuando crece sobre el mismo medio y
bajo iguales condiciones. De esta manera, por sus caracteres ayuda grandemente a la
identificacin.
Aunque la mayora de especies bacterianas forma colonias definidas, algunas dan un
desarrollo difuso, sobre todo el medio, debido a su extrema motilidad. Ejm. gnero
Proteus.
Tomando en cuenta la divisin celular y los movimientos de post-fisin, los caracteres
de las colonias se definen as:
a) DESLIZAMIENTO: Cuando las clulas se separan fcilmente despus de la divisin,
formando masas contorneadas, hmedas, de bordes lisos. As, por ejm. la familia Ente-
robacteriaceae.
b) LAZOS Y PLIEGUES: Cuando las clulas se dividen en cadenas largas que se
adhieren entre s, formando franjas o pliegues de paquetes de organismos (bacilos
rectangulares), que dan a la colonia un aspecto de cabellera despeinada o rizoide con
bordes irregulares. Por ejm. Gnero Bacillus.
Los principales caracteres tomados en cuenta para la descripcin de una colonia son:
FORMA, TAMAO, BORDE, ELEVACION, TEXTURA DE LA SUPERFICIE,
CONSISTENCIA, GRADO DE ADHERENCIA AL MEDIO, CROMOGENESIS.
Las variaciones de cada uno de los caracteres, se sintetizan en el siguiente Cuadro

Comparativo:
TAMAO FORMA BORDE ELEVACION TEXTURA DE
SUPERFICIE
Medida de Roco Entero Plana Lisa
dimetro en mm
Circular Dentado Convexa Rugosa
Elptica Lobulado Pulvinada Granular
Irregular Lacerado Umbilicada Escamosa
Ameboide Ciliado Cabezuela Plegada
Rizoide Ondulado Convexa-rugosa Cuarteada
Filamentosa o Rizado Elevada Acanalada
Miceloide
Toruloide Digitado
En roseta Filamentoso
CONSISTENCIA GRADO DE CROMOGENESIS CARACTERES

ADHERENCIA COMPLEMETARIOS
Cremosa Fuertemente adherente Amarillo limn Transparente
Mantecosa Moderadamente Amarillo oro Vidrioso
adherente
Viscosa Dbilmente adherente Anaranjado (varios tonos) Translcida
(fcilmente emulsionable)
Vidriosa Rojo, Violeta, azul, Verde Opaca
amarillento
Membranosa Verde azulado Aspecto de gota de agua
Gomosa
Mucosa
Algodonosa
REQUISITOS PARA LA DESCRIPCION DE COLONIAS ELEGIDAS
(1) Las colonias deben llegar a su mximo desarrollo. Generalmente se obtienen en

un tiempo de incubacin de 24 horas a 37C, en la mayora de especies que estudiamos.
(2) El medio sobre el que se desarrollan debe siempre conservar en el ltimo trazo
de aislamiento su aspecto transparente. Facilita su ubicacin en superficie, mirando por
el dorso de la placa.
(3) Las colonias de eleccin deben ser las que han desarrollado en el ltimo trazo
de siembra. Adems de presentar caracteres normales, garantiza el grado de pureza
por carecer de competencias vecinas.
(4) Se recomienda su ubicacin por trazos (crculos, cuadrados, etc.) con lpiz graso
o plumn, sobre la base de la placa Petri. Se evita confusin con las que no son de
inters para el estudio. En caso de describir ms de una, es mejor enumerarlas en el
dorso mismo de la placa.
(5) Proceder a la observacin macroscpica sobre la base de los caracteres del
cuadro. Para mejor observacin del la textura, es mejor el auxilio de una lupa o
microscopio estereoscopio. Para el estudio de la elevacin mirar la colonia de perfil,
levantando moderadamente la tapa de la placa a la altura de la llama del mechero.
(6) Ajustar las descripciones acompaadas de esquemas. Si son varias las
descritas, guardar relacin de forma, tamao, aspecto y otros.
(7) Relacionar morfologa de la colonia con morfologa bacteriana que la conforma.
La coloracin Gram adems de definir las formas y agrupaciones, nos indica la
diferenciacin en grupos tintoriales. Mediante este dato se adquiere mucha experiencia
en conocer de antemano la morfologa celular que caracteriza a un tipo de colonia.
II. Separacin de cepas puras a partir de las colonias estudiadas.- Morfologa

bacteriana de las colonias elegidas para cepas: procedimiento.
1.- Con el asa de siembra (de preferencia en aguja o en ngulo) picar el centro de
la colonia para desprender el inculo puro.
2.- Transplantar a un medio de cultivo en tubo (lquido o slido) siguiendo las
instrucciones del Jefe Instructor. Ambos pasos se realizan con mucha asepsia.
3.- Rotular datos: No. de colonia, medio en que ha sido aislada, , fecha y nombre
del grupo. Incubar a 37C por 24 hrs.
4.- Hacer la COLORACION GRAM del resto de masa microbiana de la colonia.
Observar y describir la morfologa celular y tipo de tincin.
5.- Relacionar la morfologa microscpica con los caracteres descritos de las
colonias en estudio.
MATERIAL.-
1.- Dos cultivos MIXTOS en placas Petri con agar (1 y 2), sembrados por estras y
diseminacin respectivamente. Un cultivo de MUESTRA PROBLEMA aportada por el
alumno, sembrada en placa Petri con agar corriente (3).
Tres cultivos de agar corriente (placa Petri) sembrados por difusin, a partir de AGUA
DE REGADIO con diluciones al 1/10, 1/100 y 1/1000 para demostracin.
2.- Asas de siembra, gradilla, lpiz graso, mezcla bactericida.
3.- Batera Gram: Cristal violeta, Lugol, alcohol acetona, Fucsina fenicada de Ziehl.
Lminas desengrasadas y limpias, papel lente, agua destilada.
4.- Microscopio y aceite de cedro.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Observar y comparar el desarrollo microbiano en las placas 1 y 2. Recordar que

ambas fueron inoculadas con el mismo cultivo usando un mtodo distinto de aislamiento.
2.- En el ESTRIADO SIMPLE o POR PLANOS, ver desarrollo difuso indiferenciado
sobre los primeros trazos; numerosas colonias puntiformes muy juntas no diferenciadas
sobre los trazos intermedios y escasas colonias aisladas bien definidas, sobre los
ltimos trazos de siembra.
3.- Observar 5 colonias diferentes, si el aislamiento fue bien llevado. Cada una,
corresponde a una especie bacteriana distinta. Idntico resultado se conseguir en la
placa 2.
4.- Con el lpiz graso limitar mediante un crculo o cuadrado sobre el dorso de la
placa, la colonia elegida y enumerarla.
5.- Describir caracteres morfolgicos consultando con el CUADRO
COMPARATIVO. En caso de duda, preguntar al instructor.
Para mejor observacin de TEXTURA, mirar con lupa u objetivo de 10X del microscopio,
a falta de estereoscopio. Para ELEVACION, observar de perfil la colonia levantando
discretamente la tapa de la placa Petri.
6.- Si en las placas 1 y 2 no hay buen aislamiento, elegir colonias de la placa 3
(muestra problema), previa consulta al instructor.
7.- En la MUESTRA PROBLEMA, ver colonias distintas o algunas idnticas a las del
cultivo. En muestras con escasos grmenes (sembradas con pipeta Pasteur), las
colonias crecern compartidas en la mayor parte de la superficie del medio.
Las muestras de SECRECIONES, REGION NASOFARINGEA, PROCESOS
SUPURATIVOS, formarn colonias en su mayora CIRCULARES, CONVEXAS,
SUPERFICIE LISA, HUMEDAS, CONSISTENCIA CREMOSA. Tambin otras de tipo

ROCIO, ELEVADAS, etc. Ambas son COCOS Gram(+).
8.- Describir algunas de las de MUESTRA PROBLEMA; las que indique el instructor,
siguiendo los pasos anteriores.
9.- Hacer esquemas y anotar descripciones.
10.- Los cultivos de demostracin en las placas, por el mtodo de difusin,
presentarn colonias en superficie en profundidad a varios planos.
Las primeras con caractersticas consignadas en el CUADRO COMPARATIVO; las
segundas, lenticulares, de varias dimensiones, opacas y transparentes.
a) En la placa 1 (dilucin 1/10): numerosas colonias pequeas difciles de estudiar,

tanto en superficie como en profundidad.
b) En la placa 2 (dilucin 1/100): colonias en menor nmero al anterior, an no
recomendadas para los recuentos bacterianos o para descripciones aisladas.
c) En la placa 3 (dilucin 1/1000): moderada cantidad o escasa en superficie y en
profundidad del medio. Apropiadas para cualquiera de las finalidades.
Representar esquemticamente el desarrollo de las 3 diluciones.
OBTENCION DE CEPAS PURAS A PARTIR DE LAS COLONIAS DESCRITAS.-

TECNICA :EMPLEO DE LA TINCION GRAM
TECNICA.-
1.- Picar con el asa en aguja o en ngulo, el centro de una de las colonias
estudiadas.
2.- Transplantar el inculo a un tubo con caldo corriente introduciendo el asa
cargada sin rozar las paredes internas del tubo. Estirar el asa para la cada del inculo.
Desechar restos microbianos. Flamear el asa.
3.- Rotular datos: nmero de colonia, nombre del medio de aislamiento, fecha y
nm. de grupo.
4.- Repetir los pasos 1, 2 y 3 con las dems colonias aisladas.
5.- Incubar las siembras a 37C, durante 24 a 48 hrs.
COLORACION GRAM DE LAS COLONIAS
6.- Hacer extensiones de cada resto de colonia estudiada, sobre lminas limpias,
siguiendo recomendaciones para la COLORACION GRAM.
7.- Poner los datos respectivos en cada preparacin.
8.- Aplicar la TECNICA DE LA COLORACION GRAM.
9.- Observar microscpicamente cada preparacin, con aceite de inmersin.
NOTA: Las preparaciones se deben hacer de colonias del cultivo mixto; si el caso lo
requiere, de la muestra problema.
RESULTADOS.-
Detectar las siguientes correlaciones del cultivo mixto:
a) COLONIAS TIPO ROCIO: cocos en cadena, Gram (+).

b) COLONIAS CIRCULARES (3mm): borde entero, cremosas, convexas y opacas.
Cocos con racimo. Gram(+).
c) COLONIAS IRREGULARES (3-4mm): aplanadas, borde erizado, blancas y
opacas. Bacilos rectangulares en cadena. Gram (+).

d) COLONIAS CIRCULARES (2-3mm): lisas, borde entero, transparentes y
convexas. Bacilos pequeos, aislados, Gram(-).
Figura 12. Algunos tipos de forma que presentan las colonias bacterianas.
Tipos de elevacin de las colonias bacterianas.

Cuestionario
Haga los esquemas de las colonias aisladas y la morfologa microscpica

correspondiente
Prctica N7
Nutricin microbiana y determinacin de requerimientos
nutricionales
Objetivo:
Determinar los requerimientos nutricionales de los microorganismos
Los microorganismos de acuerdo a sus requerimientos nutricionales se clasifican en

general en AUTOTROFICOS y HETEROTROFICOS, existiendo variaciones
nutricionales dentro de estos grupos.
-MICROORGANISMOS AUTOTRFICOS
Son aquellos que obtienen su energa de la oxidacin de sustancias inorgnicas
simples. Dentro de este grupo tenemos a los microorganismos LITO-AUTOTROFICOS,
QUIMIO-AUTOTROFICOS y los AUTOTROFICOS FOTOSINTETICOS, los cuales
extraen su energa de reacciones fotoqumicas o reacciones qumicas de oxido-
reduccin y fijan el CO2 como fuente de carbono. A este grupo de microorganismos se
les puede cultivar en medios de composicin qumica definida que satisfacen sus
exigencias nutricionales.
-MICROORGANISMOS HETEROTRFICOS
Son aquellos que requieren de compuestos orgnicos ms complejos como fuente de
carbono y nitrgeno, requieren del suministro de protenas, carbohidratos, lpidos,
vitaminas, sales inorgnicas y otros factores de crecimiento para la sntesis de
compuestos estructurales y citoplasmticos en su desarrollo; los organismos
heterotrficos pueden ser: FOTO-ORGANOTRFICOS y QUIMIO-
ORGANOTRFICOS.
- MICROORGANISMOS AUXOTRFICOS
Un microorganismo es auxtrofo cuando slo es capaz de proliferar en un medio de
cultivo si a ste se ha aadido alguna sustancia especfica, que el tipo silvestre, llamado
prottrofo, no requiere, porque es capaz de sintetizarla.
Tpicamente, la gentica subyacente a una auxotrofa es la carencia de una ruta
metablica funcional que genere la sustancia de la que depende el auxtrofo. Esta
carencia suele deberse a una mutacin que genera la carencia de capacidad biolgica.
Por ejemplo, existen cepas de levaduras empleadas en el laboratorio que, debido a una
carencia en una enzima requerida para la sntesis de uracilo, precisan de ste en el
medio de cultivo para poder crecer.
DETERMINACIN DE LOS REQUERIMIENTOS MNIMOS PARA EL CRECIMIENTO
Idealmente todos los medios que se emplean en microbiologa deberan ser del tipo
llamado sinttico. Un medio sinttico es aquel cuya frmula qumica estructural se
conoce con exactitud. Por otro lado, la gran parte de los medios microbiolgicos con-
tienen sustancias de frmula qumica desconocida. Tales sustancias, como extracto de
carne, varias protenas, peptonas, y extracto de levadura, representan mezclas
heterogneas de composicin y estructura qumica no identificada. Cuando las
protenas se someten a la accin de los cidos o al desdoblamiento enzimtico, se
acumulan distintos productos de varios tamaos intermedios, stos son simplemente
cadenas de aminocidos de longitud variable. En orden descendiente de tamao, se les
conoce como proteosas, peptonas y pptidos. En todas estas preparaciones tambin se
encuentran aminocidos libres. Por medio del control cuidadoso de las condiciones de
la hidrlisis, todas estas preparaciones se pueden estandarizar en productos
razonablemente uniformes; pero es imposible conocer con exactitud las frmulas
qumicas de todos los componentes del hidrolizado.
Siempre que se le aadan estos productos al medio de cultivo, ste deja de ser sinttico.
Por medio del empleo de medios sintticos se puede aprender mucho sobre la nutricin
microbiana. En el siguiente experimento usted emplear un medio simple para
demostrar que no todos los microorganismos tienen los mismos requerimientos
alimentarios.
DETERMINACIN DE LOS REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE UNA

MUTANTE AUXOTRFICA
TABLA PARA TEST AUXONOGRFICO
1 2 3 4 5
6 ADENINA GUANINA CISTEINA METIONINA TIMINA
7 HISTIDINA LEUCINA ISOLEUCINA VALINA LISINA
8 FENILALANINA SERINA TRIPTOFANO TREONINA PROLINA
9 GLUTAMICO TIROSINA ALANINA ASPARTICO ARGININA
En las mezclas la concentracin final de los aminocidos es de 2 - 2.5 g/ml y la de las

bases y vitaminas es 0.5 - 1 g/ml.
MATERIALES.-
1. Placas Petri con los siguientes tipos de medios.

a. Unicamente agar (lavado y purifcado antes de disolverlo).
b. Agar + Minerales (el agar tambin prelavado y purificado).
c. Agar + Minerales + fuente de carbono orgnico (azcar).
d. Agar + Minerales + Azcar + fuente de nitrgeno orgnico.
2. Placas de Agar mnimo de Davies con los grupos de aminocidos para efectuar
la prueba auxonogrfica
2. Cultivos de Eschericha coli, Streptococcus lactis y Saccharomyces
cerevisiae, Bacillus subtilis trp- .
PROCEDIMIENTO.-
Con un lpiz de cera, trace sobre el fondo de vidrio de cada placa Petri para dividirlo en
4 sectores y numere cada sector. Inocule los sectores correspondientes de cada placa
con uno de los tres organismos; deje el cuarto sector de cada placa sin inocular. Invierta
las placas, incbelos por 48 horas y observe el crecimiento en cada uno de los sectores
inoculados. La placa rotulada "Agar solo" no contiene nada ms que agua destilada y
agar. Los minerales de los otros tres medios incluyen fosfato de amonio (NH 4H2PO4),
cloruro de potasio (KCI) y sulfato de magnesio (MgSO4). La fuente de carbono orgnico
empleada en los dos ltimos medios es la azcar glucosa, y la fuente de nitrgeno
orgnico empleada es una peptona bacteriolgica. Es de esperarse que el estudiante
examine las frmulas de los distintos medios y analice el contenido de cada medio con
respecto a las fuentes de nitrgeno, energa y factores accesorios para el crecimiento.
La comprensin de por qu y para qu de cada ingrediente empleado ayudar a
entender muchos de los experimentos subsiguientes.
Prctica N8
Enumeracin de microorganismos
OBJETIVOS:
Cuantificar las poblaciones microbianas.
Ensayar diferentes mtodos para la cuantificacin de poblaciones microbianas
Mediante The American Public Health Association (APHA) se han estandarizado

mtodos a nivel internacional para determinar la calidad de saneamiento de algunos
alimentos, que por el sistema de almacenamiento y manipulacin estn afectos a la
contaminacin microbiana, hacindolos inapropiados para el consumo del hombre.
Aunque lo ideal sera el expendio en condiciones aspticas, el cdigo sanitario establece
un margen de tolerancia de flora bacteriana contaminante que no altera las propiedades
organolpticas y alimenticias de los elementos en estudio. Este se orienta por cuentas
generales en AGAR PARA RECUENTO cuentas de organismos coliformes en medio
selectivo EMB. Ejemplos:
MATERIA PRIMA CUENTAS GENERALES (EN CUENTAS DE ORGANISMOS

AGAR NUTRICIO) COLIFORMES EN EMB
Leche Pasteurizada No contener ms de 5,000 No contener ms de 1,000
bacterias/ml bacterias/ml.
Condimentos No mayor de 500,000 Ausencia total de grupo coli.
bacterias/ml.
Agua potable No mayor de 50/ml No mayor de 2/ml.
La enumeracin se puede seguir mediante mtodos directos e indirectos. A manera de

referencia se mencionan brevemente algunas de las tcnicas que se aplican en cada
mtodo.
I. METODOS DIRECTOS
Tenemos:
a) RECUENTO POR EL METODO DE LAS PLACAS

Este mtodo permite conocer el nmero de bacterias o de los grupos de bacterias (es
decir unidades formadoras de colonias) que se encuentran presentes en una muestra
siempre que el medio de cultivo y la temperatura de incubacin sean apropiados.
Lo usual es preparar diluciones de la muestra original y mezclar una cantidad de la
dilucin con agar fundido, una vez solidificada se incuban las placas, contndose luego
el nmero de colonias. Los recuentos deben hacerse en placas que contengan entre 30
y 300 colonias, debido a que si se excede este nmero el recuento dar cifras ms bajas
a causa del antagonismo bacteriano. Cuando se han preparado varias placas por cada
dilucin, el clculo se realiza averiguando la media aritmtica de los recuentos de
colonias de la dilucin elegida. Para determinar la validez del recuento, se calculan los
lmites de fiabilidad al 95% (es decir, aquella gama dentro de la cual el recuento es real
en un 95% de los casos). Esta gama se obtiene por medio de la siguiente frmula:
(nx ) 196
. (nx )
n
Donde:
nx : Nmero total de colonias contadas en todas las placas de la dilucin
correspondiente.
n : Nmero de placas de esa dilucin.
x : Equivale a la media aritmtica del recuento de colonias de la dilucin
seleccionada.
Cuanto ms pequeo sea el nmero de colonias contadas mayor ser el lmite de

fiabilidad al 95%.
MATERIAL.-
- Muestras problema de leche fresca y agua potable.

- 4 tubos estriles de 16 x 150
- 3 placas Petri estriles
- 2 pipetas graduadas de 10 y 1 ml
- 1 frasco con Agar Nutricio (licuado a 55C)
- 1 gradilla, lpiz graso, mechero de Bunsen
PROCEDIMIENTO.-
1) Hacer diluciones al 1/10, 1/100 y 1/1000 de alguna de las dos muestras que le
indique el instructor. Partir de la 1 ra dilucin para la 2da y de sta para la 3ra, sobre
volmenes de 10 ml por dilucin. Enumerar cada frasco.
2) Tomar 1 ml de cada dilucin con pipetas de 1 ml al 1/10 y depositar con asepsia
en cada una de las placas Petri, previamente rotuladas.
3) Vaciar en cada placa y con asepsia 10 ml de agar fundido a 50C mediante la
pipeta de 10 ml. Agitar con movimientos vasculantes para favorecer la mezcla. Evitar se
extravase la emulsin al agitar.
4) Solidificar el gel, invertir cada placa, rotular datos: dilucin, nmero del grupo y
fecha.
5) Incubar las placas en posicin invertida a 37C por 24 a 48 hrs.
RESULTADOS.-
Desarrollo de colonias en superficie y profundidad en cada placa. Mtodo de lectura en

la prxima prctica.
b) CONTEO DIRECTO
Las cmaras de recuento poseen una depresin central de profundidad conocida en la
que se coloca un volumen conocido de cultivo, enumerando individualmente las clulas
por control microscpico. Estas cuentas se pueden hacer tambin en frotices teidos en
lminas, en este procedimiento es esencial calibrar el microscopio previamente de modo
que se conozca de antemano el rea del campo microscpico.
Se extiende un volumen conocido de muestra (0.01 ml) o de la dilucin apropiada sobre
un rea dada (1 cm) de un portaobjeto.
Se cuenta cada bacteria sencilla como una. Las cadenas o grumos de bacterias tambin
se cuentan como una sola; ya que una cadena o grupo originar slo una colonia. Se
determina el nmero medio de bacterias por campo y se calcula el nmero por ml o g
de muestra.
MATERIAL.-
- Muestra problema
- Cmara de Neubauer
- Placas Petri con alcohol
- Solucin de mezcla sulfocrmica
- Microscopio ptico
PROCEDIMIENTO.-
1) Verificar la limpieza de la cmara de Neubauer, la que debe estar en una placa

Petri con alcohol para eliminar residuos de grasa.
2) Depositar con la pipeta una gota de suspensin bacteriana sobre la cmara.
Cubrir con cubreobjetos.
3) Observar con microscopio a 45X.
4) Efectuar el conteo por cinco campos.
5) Realizar los clculos para conocer el nmero de microorganismos por cm 3,
aplicando la siguiente frmula :
# de bacterias x factor de dilucin x a x 104

----------------------------------------------------------
N de cuadros contados
Donde:
a= 25 si se cuentan los 25 cuadrados
a= 400 si se cuentan los cuadrados ms pequeos
c) CUENTAS POR FILTROS DE MEMBRANAS

Los microorganismos quedan retenidos en los poros de las membranas de acetato de
celulosa, al ser filtrados y luego stas son colocadas sobre medios apropiados . La
cuenta total se confiere a organismos vivos .
II. METODOS INDIRECTOS

Mencionaremos:
a) DETERMINACION DEL VOLUMEN TOTAL

En tubo de Hopkins graduado en mm. Por centrifugacin los microorganismos , a
velocidad constante y tiempo medido, alcanzan una medida de masa en la columna
graduada del tubo.
b) METODOS TURBIDIMETRICOS
Empleando un ESPECTROFOTOMETRO y un cultivo en tubo transparente en el que

se interpone una fuente de luz y una clula fotoelctrica. La lectura depende del paso
de luz a travs del cultivo de la unidad de luz. Estos mtodos dependen de que las
bacterias en suspensin puedan bloquear un rayo de luz mediante la dispersin o absor-
cin, haciendo que la suspensin aparezca turbia. Cuanto mayor sea la concentracin
de bacterias menor ser la cantidad de luz que pueda penetrar en la suspensin y mayor
la luz que se dispersa.La capacidad de retencin de luz de una bacteria depende de su
tamao, forma y transparencia. En consecuencia, una medida de turbidez slo tiene
relacin con la cantidad de microorganismos si se trata de un cultivo puro. A un cultivo
se le determinar el nmero de microorganismos por turbidez comparando con la Escala
Mac Farland.
MATERIAL.-
Por mesa:
- Cultivos en caldo de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
albus y Alkaligenes faecalis.
- Escala turbidimtrica de Mac Farland.
PROCEDIMIENTO.-
Comparar los cultivos con los tubos de la escala de Mac Farland y buscar la equivalencia
en la tabla.
CUADRO I: ESCALA DE McFARLAND
TUBO N ClBa (1%) H2SO4 (1%) MILLONES DE

m.o./ml
1 0.1 9.9 300
2 0.2 9.8 600
3 0.3 9.7 900
4 0.4 9.6 1200
5 0.5 9.5 1500
6 0.6 9.4 1800
7 0.7 9.3 2100
8 0.8 9.2 2400
9 0.9 9.1 2700
10 1.0 9.0 3000
TUBO N Staphylococcus E. coli / Pseudomonas

1 379 379
2 758 757
3 1137 1136
4 1516 1515
5 1895 1894
6 2273 2272
7 2652 2651
8 3031 3030
9 3410 3408
10 3789 3787
c) RECUENTOS POR EL MTODO DEL NMERO MAS PROBABLE
En este mtodo, la suspensin se diluye progresivamente inoculando uno o ms tubos

de caldo con un volumen conocido de cada dilucin. Despus de la incubacin se anota
el nmero de tubos claros y turbios de cada una. Se considera que los tubos que
permanecieron claros no recibieron ningn microorganismo.
Proporciona una idea aproximada del nmero de bacterias vivas presentes en una
muestra. Lamentablemente este sistema presenta un margen grande de error, que para
ser reducido precisa de la inoculacin de varios tubos para cada dilucin y el nmero
aproximado de bacterias y el clculo en base a una tabla de probabilidades.
Se puede emplear el mtodo de dilucin en tubos, junto con medios selectivos , para
determinar la cantidad de grupos especiales de bacterias como coliformes y estrep-
tococos fecales contenidos en alimentos.
Cuestionario
1.- Cul de los mtodos de enumeracin le parece el ms exacto?
2.- En qu casos se emplea la Escala de Mac Farland?

PRCTICA N 9
Cintica de crecimiento de un cultivo por lotes
OBJETIVOS
Determinar la curva de crecimiento de un cultivo bacteriano.

Determinar los parmetros cinticos.
El conocimiento del transcurso temporal o cintico de crecimiento y produccin de

metabolitos resulta fundamental en el tratamiento cuantitativo de los procesos
biotecnolgicos. El adecuado conocimiento de la cintica de un cultivo permite la prediccin
del transcurso de la fermentacin. Asimismo, la evaluacin de las velocidades,
rendimientos y productividades nos entrega informacin til para establecer estrategias de
produccin y optimizacin del proceso.
El comportamiento cintico de un cultivo est determinado por un conjunto complejo de
factores genticos y ambientales. Entre estos ltimos destacan las denominadas
condiciones de operacin y la modalidad del cultivo.
Se entiende que un cultivo por lotes constituye un sistema cerrado en el cual no existe una
renovacin de nutrientes ni una eliminacin de productos, con excepcin de algunos com-
puestos gaseosos que fluyen con el aire a travs de los filtros del reactor. En esta
modalidad de cultivo se cargan los nutrientes inicialmente y luego se inocula con una
determinada cantidad de clulas viables. Se inicia as el cultivo, el que transcurre en una
forma caracterstica, dada por la llamada curva de crecimiento, hasta que algn evento, tal
como el agotamiento de un nutriente esencial, lo detiene.
La figura mostrada abajo representa una tpica curva de crecimiento. La forma que se
aprecia se da siempre que se cumplan ciertas condiciones: el cultivo se realiza por lotes,
todas las clulas que componen la poblacin se reproducen a intervalos regulares, no
existen en el medio de cultivo sustancias inhibidoras del crecimiento y su composicin es
simple, en especial en relacin a las fuentes de carbono y nitrgeno.
La curva presenta varias zonas o fases, a saber:
Fase de latencia (a): se produce inmediatamente despus de inoculado el cultivo. Durante

ella no hay iniciacin de replicacin de ADN ni separacin de nuevas clulas. Fase en la
cual se produce el reacomodo de la composicin macromolecular al nuevo ambiente en
que se encuentran las clulas inoculadas.
Fase de crecimiento exponencial o logartmico (b): las clulas se encuentran en plena

reproduccin a una velocidad que es la mxima para el juego de condiciones existentes,
por no existir limitacin de nutrientes.
Fase estacionaria (c): se alcanza cuando se agota un nutriente, razn por la cual se
detiene el crecimiento.
Fase de muerte o decaimiento (d): esta fase se presenta en aquellos cultivos en los que
se inducen enzimas autolticas en condiciones de inanicin.
Fase de crecimiento crptico (e): en algunos cultivos es posible apreciar una zona de
crecimiento lento despus de la fase de muerte. El contenido citoplasmtico liberado por
las clulas lisadas proporciona los nutrientes requeridos para el crecimiento.
PARMETROS CINTICOS
El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser representado por:
dX
X (1)
dt
donde es la velocidad especfica de crecimiento, cuyo valor es constante durante la fase

de crecimiento exponencial y en la Figura 1 corresponde a la pendiente de un grfico
semilogartmico en la fase exponencial, ya que:
1 dX d ln X
(2)
X dt dt
Durante la fase exponencial es posible integrar la ecuacin (1) entre lmites adecuados,
resultando:
X
ln t
Xo
de donde:
lnX - lnX0 = t
lnX = lnX0 + t (3)
ln X ln X o

t
o bien, de (3):
X = X0et
El parmetro es de especial relevancia en el estudio de la cintica de fermentaciones. Si

se examinan sus dimensiones bsicas, stas resultan de tiempo -1, por lo que se le expresa
en h-1 comnmente, o bien min-1 o s-1.
Relacionado con existe otro parmetro cuya interpretacin fsica puede parecer como
ms directa: el tiempo de duplicacin Td, definido como el intervalo de tiempo entre dos
duplicaciones. Si imponemos esos lmites para integrar la ecuacin (1), resulta:
2X o
ln t
Xo
ln2 = Td
ln 2
Td

MATERIAL
Cultivo en tubo de E. coli K-12 en Agar Luria en plano inclinado, de 18-24 hrs. de incubacin
a 37C.
Agar y Caldo Luria
Agar y Caldo Mnimo de Davies
Solucin salina peptonada
Tubos de prueba de 16 x 150
Placas Petri
Pipetas serolgicas de 10 y 1 ml
Espectrofotmetro
Bao Mara con agitacin
Recipiente con mezcla sulfocrmica
PROCEDIMIENTO
Sembrar E. coli K12 en Agar Luria en plano inclinado e incubar a 37C por 24 hrs.
Cosechar esta cepa en 150 mL de Caldo Luria y 150 mL de Caldo Mnimo de Davies e
incubar ambos caldos a 37C en agitacin por 16 - 18 hrs.
Inocular 2 ml de cada uno de los cultivos anteriores a matraces con 180 ml de Caldo Luria
y Caldo Mnimo de Davies respectivamente. Extraer una muestra de 4 ml para la
determinacin de la poblacin inicial (1 ml para recuento en placa, 3 ml para lectura de
absorvancia a 640 nm). Incubar los matraces a 37C por 12 hrs con agitacin constante.
Cada hora, tomar muestras de 4 ml de las cuales 3 ml se usan para medir la absorvancia
a 640 nm en un espectrofotmetro y 1 ml para practicar diluciones seriadas en solucin
salina peptonada de acuerdo al protocolo experimental. Tomar alcuotas de 0.1 ml de las
dos ltimas diluciones y sembrar por incorporacin en Agar Luria. Incubar las placas a
37C por 24-48h.
Efectuar el recuento de colonias en cada placa y determinar el nmero de m.o./ml para
cada tiempo.
Graficar los resultados de las lecturas de densidad ptica en funcin del tiempo y el ln del
nmero de m.o./ml en funcin del tiempo.
Determinar la duracin de cada fase de la curva de crecimiento.
Hacer un ajuste de regresin lineal a los datos comprendidos en la fase de crecimiento
exponencial y a partir de ellos trazar la recta de regresin.(Calcula velocidad especifica de
crecimiento y el tiempo generacional)
PROTOCOLO
TABLA 1: MEDIO AGAR LURIA
TIEMPO DILUCIONES N DE TUBOS SIEMBRA DE DILUCIONES N DE PLACAS

T0 10-1 a 10-6 6 10-5 ,10-6 4
T1 10-1 a 10-6 6 10-6 ,10-8 4
-1 -7 -8 -10
T2 10 a 10 7 10 ,10 4
T3 10-1 a 10-8 8 10-10 ,10-12 4
T4 10-1 a 10-10 10 10-12 ,10-14 4
T5 10-1 a 10-12 12 10-14 ,10-16 4
-1 -14 -16 -18
T6 10 a 10 14 10 ,10 4
T7 10-1 a 10-16 16 10-18 ,10-20 4
T8 10-1 a 10-17 17 10-20 ,10-22 4
T9 10-1 a 10-18 18 10-22 ,10-24 4
-1 -18 -24 -26
T10 10 a 10 18 10 ,10 4
T11 10-1 a 10-18 18 10-26 ,10-28 4
T12 10-1 a 10-18 18 10-26 ,10-28 4
TOTAL 168 52
TABLA 2: MEDIO MINIMO DE DAVIES Y MINGIOLI
TIEMPO DILUCIONES N DE TUBOS SIEMBRA DE DILUCIONES N DE PLACAS

T0 10-1 a 10-6 6 10-5 ,10-6 4
-1 -6 -5 -6
T1 10 a 10 6 10 ,10 4
T2 10-1 a 10-7 7 10-6 ,10-7 4
T3 10-1 a 10-8 8 10-7 ,10-8 4
T4 10-1 a 10-10 10 10-9 ,10-10 4
-1 -12 -11 -12
T5 10 a 10 12 10 ,10 4
T6 10-1 a 10-14 14 10-13 ,10-14 4
T7 10-1 a 10-16 16 10-15 ,10-16 4
T8 10-1 a 10-17 17 10-16 ,10-17 4
-1 -18 -17 -18
T9 10 a 10 18 10 ,10 4
T10 10-1 a 10-18 18 10-17 ,10-18 4
T11 10-1 a 10-18 18 10-17 ,10-18 4
-1 -18 -17 -18
T12 10 a 10 18 10 ,10 4
TOTAL 156 52
RESULTADOS
CRECIMIENTO DE E. coli K-12 EN CALDO LURIA
EDAD DEL CULTIVO D.O. N de m.o./ml ln del N de m.o./ml

T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10
T11
T12
ln X f ln X o ln 2
Td
(t f t o )
CRECIMIENTO DE E. coli EN CALDO MNIMO DE DAVIES
EDAD DEL CULTIVO D.O. N de m.o./ml ln del N de m.o./ml

T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10
T11
T12
A) u = B) Ng = C) Tg =
PRCTICA N 10
Cintica de muerte microbiana
OBJETIVO:
Elaborar la curva de decaimiento microbiano
Determinar la constante de inactivacin
En una poblacin bacteriana cada clula tiene una cierta probabilidad de sobrevivir a una
determinada dosis de radiacin ultravioleta, por ejemplo 0.1, es decir 10% de sobrevi-
vientes.
Entre los sobrevivientes cada
bacteria tiene de nuevo la
misma probabilidad de
sobrevivir una segunda dosis
similar. As, si la dosis se
duplica, el nmero de
sobrevivientes decae como el
producto de sus
probabilidades, 0.1 x 0.1 1%
(99% de muerte). Si se grfica
el nmero de sobrevivientes
contra el tiempo de irradiacin
(dosis), se obtendr una curva
de supervivencia exponencial.
Dos factores estn
involucrados en la accin letal
de la radiacin UV:
La facilidad con que el blanco
sensible a la luz UV puede ser
alcanzada.
El nmero de impactos
necesarios para matar una
clula.
La curva de absorcin de cidos nucleicos y la curva espectral
de accin para inactivar clulas presentan un mximo a 260 nm.
La facilidad con que un blanco
puede ser alcanzado, influenciara la pendiente de la curva de supervivencia. A mayor faci-
lidad para alcanzar el blanco, mayor ser la pendiente.
Algunos factores que tienen influencia en la pendiente son:
A) Intensidad de radiacin: est dado por el nmero de ergios/mm2/seg y se puede

medir utilizando el dosmetro de UV IL254. Se determina la intensidad en micro-amperes
emitidos por la fuente monocromtica a 2537 . Se continua con los clculos de
reconversin utilizando la frmula:
watt/cm2 = factor de calibracin
al final se refiere la dosis: ergios/mm2/seg emitida.
En nuestro experimento se puede medir la intensidad de radiacin partiendo de la

frmula:
(d) = (3.2 ergios/mm2/seg)(100 cm/d)2
B) Densidad de la suspensin: en una suspensin muy buena de bacterias algunas

protegen a otras, de manera que la curva de supervivencia es menos pronunciada que en

la de una suspensin muy diluida.
C) Naturaleza del lquido de suspensin: un caldo nutricio absorbe ms radiacin UV
que una solucin buffer. De manera que la dosis efectiva para clulas efectivas en
suspensin en el caldo, se reduce. Adems, se forman perxidos orgnicos txicos que
prolongan el efecto de la irradiacin mas all del tiempo real de exposicin.
D) Estado fisiolgico de las clulas: este hecho tambin afecta a la facilidad con
que un blanco (DNA) puede ser alcanzado. En una clula grande, el blanco sensible a
la luz UV es usualmente mas pequeo en relacin al volumen celular que en una
clula pequea. El nmero de impactos necesarios para matar una clula y el nmero
de blancos dentro de una clula influencia la forma de la curva. Si hay mas de un
blanco a dosis bajas, la curva presenta una meseta, ya que la probabilidad de que
cualquier clula reciba impactos mltiples es baja, pero aumenta conforme la dosis
aumenta. Las clulas multinucleadas dan curvas de supervivencia, tipo " multimpacto
".
El efecto letal a nivel molecular que ejerce la luz UV en las bacterias ha sido ampliamente
estudiado. Estudios "in vitro" han mostrado que la radiacin UV forman dmeros de timina
los cuales son biologicamente importantes. Tambin forman dmeros de citosina-citosina
y citosina-timina.
La radiacin UV se ha empleado mucho en la induccin de mutaciones. La longitud de
onda con mxima letalidad y mutagnesis es de 2357 , que coincide con el mximo
de absorbancia del ADN en la zona ultravioleta.
FOTORREACTIVACION
Adems del mecanismo de reparacin del ADN por "reactivacin en la oscuridad" o
"replicacin reparativa", la fotorreactivacin es otro de los mecanismos de reparacin del
ADN en culti-
vos
preirradiados
cuando estos
se someten a
la accin de
luz visible,
Esquema de la alteracin provocada al ADN por irradiacin con luz ultravioleta y los
procesos de fotorreactivacin y de reactivacin en oscuridad.
recuperandose la viabilidad de la poblacin. Ropert en 1960, demostr la participacin de

una enzima que forma un complejo con el ADN irradiado, actuando el dmero de timina
como sustrato de la enzima fotorreactivante.
Puesto que la bacteria posee mecanismos para la reparacin del dao que produce la luz
UV tanto en presencia de luz como en oscuridad, las condiciones de incubacin
influenciar su supervivencia. Por lo tanto es muy importante el uso de condiciones
estandarizadas para obtener resultados reproducibles.
MATERIAL
Cultivo de 10 hrs en caldo Luria de E. coli K-12 (aprox. de 1-2 x 108 cl/ml).
Solucin buffer 0.015M estril.
Tubos de 16 x 150 mm con solucin salina estril (9 ml c/u)
Placas Petri 20 x 100 mm estriles.
Placas Petri con agar Luria.
Pipetas terminales de 10 ml y 1 ml estriles.
Dos matraces de 50 ml de caldo Luria.
Tubos de centrfuga.
Esptulas de Drigalsky.
Vasos de precipitacin con alcohol comercial.
Lmpara germicida UV de 15 watts.
Papel platina.
Cubetas de plstico con hielo.
Bao Mara con agitacin.
Espectrofotmetro.
PROCEDIMIENTO
Irradiacin
DIA 1:
Encender la lmpara de luz UV una hora antes de usarse para permitir la estabilizacin de
la emisin de radiacin fijndola a 30cm de distancia (la distancia puede variar de acuerdo
a las condiciones).
Sembrar E. coli K12 en agar Luria en plano inclinado e incubar toda la noche.
Diluir la cepa en caldo Luria 1:50 e incubar a 37C con agitacin hasta que la poblacin
alcance una densidad de 1 - 2 x 108 cl/ml.
Repartir 5 ml de cultivo a cada uno de seis tubos, centrifugarlos a 4500 rpm x 15 minutos
y resuspender cada paquete celular en 4 ml de buffer fosfato a pH 7.2. Volver a centrifugar
en las mismas condiciones.
Eliminar el sobrenadante y resuspender cada paquete celular en 10ml de buffer fosfato,
ajustando la poblacin hasta 1 x 108 cl/ml aproximadamente.
Tomar 5 - 10 ml de cada suspensin celular y vaciar en placas Petri estriles. Separar 1
ml de cada cultivo para el recuento de clulas viables en el "tiempo cero" (poblacin inicial),
previas diluciones indicadas en las tablas.
Irradiar a intervalos regulares, destapando y agitando suavemente las placas Petri. Al

trmino de cada intervalo de irradiacin, taparlas, parar la agitacin y tomar alcuotas de 1
ml para hacer las diluciones indicadas.
Cubrir con papel platina o papel carbn los tubos con las diluciones iniciales por cada
tiempo de exposicin (para evitar exposicin a la luz) y si es posible, colocarlos en cubetas
de hielo.
Diluir en tubos con solucin salina cubiertos con papel platina o carbn, y sembrar 0.1 ml
de las ltimas 2 ms diluciones, por diseminacin, sobre placas Petri con agar Luria (por
duplicado).
Incubar las placas cultivadas a 37C por 24 hrs.
TIEMPO DE DILUCIONES # DE TUBOS # DE PLACAS CON

EXPOSICIN AGAR LURIA
T0 = 0" 10-6 ,10-7 7 4
T1 = 15" 10-5 ,10-6 6 4
T2 = 30" 10-4 ,10-5 5 4
T3 = 45" 10-3 ,10-4 4 4
T4 = 60" 10-1 ,10-2 2 4
T5 = 90" 100 ,10-1 2 4
Para cuentas viables de la poblacin fotorreactivada, hacer una dilucin ms por cada
tiempo de exposicin a la luz UV.
Fotorreactivacin
Someter las dos ltimas diluciones de cada poblacin irradiada a la accin de la luz visible
a temperatura ambiente durante 20 minutos, a una distancia de 15 - 20 cm de la fuente de
luz.
Espatular 0.1 ml de cada poblacin fotorreactivada sobre placas Petri con agar Luria, e
incubar a 37C por 24 hrs.
DIA 2:
Realizar el recuento de colonias y referir el nmero de bacterias por dosis de radiacin.
Graficar las curvas de porcentaje de supervivencia y de fotorreactivacin vs. tiempo, en
papel semilogartmico o milimetrado tomando en cuenta el tipo de datos a graficar.
Determinar las dosis de radiacin que han recibido las poblaciones por cada tiempo de
exposicin.
Elegir la dosis de radiacin que induzca mutacin, a menudo se encuentra entre el rango
de supervivencia de 0.1 - 1 ml (99 - 99.9%) de muerte de la poblacin, es decir, cuando la
poblacin se haya reducido en 3 - 5 logaritmos.
Discutir, interpretar y concluir resultados finales.
PRCTICA N11: ENZIMAS MICROBIANAS
OBJETIVOS:
Demostrar la actividad de las exoenzimas microbianas

Demostrar la actividad de las endoenzimas microbianas
Uno de los aspectos mas espectaculares de la actividad microbiana se refiere a las

capacidades metablicas de las clulas microbianas.
Entre mayor sea la variedad de enzimas que posee un microorganismo , mayor es la
diversidad de materias primas que ste puede utilizar metablicamente.
Al estudiar el metabolismo microbiano en el laboratorio debemos poner atencin a la
localizacin de sus enzimas. La mayora de sus enzimas se localiza en el interior se
cada clula y se denominan endoenzimas; otro grupo de enzimas se encuentran en el
exterior de las clulas y actan sobre las sustancias presentes en el ambiente y se
denominan exoenzimas.
Muchas de las sustancias orgnicas complejas en el medio ambiente son demasiado
grandes para que puedan penetrar a la clula, entonces las exoenzimas cumplen la
funcin de disminuir el tamao de las molculas complejas para que puedan difundir
al interior de la clula y sirvan de sustrato para las endoenzimas.
Las endoenzimas por su parte, convierten las molculas alimenticias que ingresan a la
clula en productos que se utilizan para crear mas masa celular ( reacciones
anablicas) y obtener energa ( reacciones respiratorias).
EXOENZIMAS
HIDROLISIS DE LA CASEINA
La casena es la principal protena de la leche. Una pequea cantidad de leche se

dispersa en el agar nutricio para proveer la casena para los organismos que se van a
sembrar all. El agar va a reducir una turbidez distintiva, que de otra manera no se vera
en una caja con agar nutricio normal. Esta turbidez se debe a que las molculas de
casena son coloidales, y la mayor parte de los coloides no transmiten la luz. Los rayos
de luz que pasan hacia una solucin coloidal se inciden y no pasan a travs del coloide.
Esta es la causa de que resulta imposible ver a travs de un vaso de leche, mientras
que una solucin de sal o azcar es transparente. Esta turbidez es funcin del tamao
de las molculas coloidales.
Algunos microorganismos son capaces de proliferar en este agar y de liberar
exoenzimas hidrolticas que atacan la protena. La hidrlisis de la casena no difiere de
la de cualquier otra protena tpica, la molcula proteica se desdobla en etapas
produciendo una sucesin de molculas de tamao decreciente llamadas proteosas,
peptonas, pptidos, hasta terminar en aminocidos libres, los cuales por su tamao son
ya cristaloides. As, una vez hidrolizada, la casena se convierte en sus aminocidos
componentes, los cuales transmiten la luz en vez de reflejarla corno la casena coloidal.
El cambio que se observa en la placa de agar leche es la clarificacin del agar alrededor
de las colonias que producen caseinasa. Los cristaloides, producto del desdoblamiento
de las grandes molculas, se difunden y penetran a las clulas cercanas. De esta
manera los microorganismos pueden aprovechar alimentos que si no fuera por las
exoenzimas, no podran ingerir.
ESTUDIO DE LA HIDROLISIS DEL ALMIDON
El almidn es un polisacrido (polmero de glucosa), que est formado por una cadena
lineal (AMILOSA) y una cadena ramificada (AMILOPECTINA); se le emplea para la
diferenciacin bioqumica de algunas especies bacterianas, cuando stas la utilizan
como fuente de energa gracias a la accin enzimtica, es especfica de las alfa y beta
amilasas que son capaces de hidrolizar el almidn parcialmente:
alfa-amilasas
(C6H10O5)n -------------------> Dextrina (Degradacin Parcial)
-amilasas
(C6H12O6)n -------------------> Maltosa (Degradacin Total)
Siendo en esta forma como el almidn puede ingresar a la clula bacteriana. El ensayo
se hace en un medio lquido, semislido o slido (en agar corriente), al que se le adiciona
1% de almidn soluble (almidn natural tratado con HCl al 7.5% por 7 das a temperatura
ambiente).
Si la bacteria no hidroliza almidn, al agregarle el reactivo LUGOL (sol. de Iodo al 1% -
Ioduro de Potasio al 2%) habr reaccin AZUL INTENSO debido a que la fraccin
AMILOSA absorbe el Iodo y las molculas de Iodo se ajustan dentro de la hlice de
unidades de glucosa: NEGATIVO.
Cuando el cultivo toma color ROJO VINOSO, indica que la HIDROLISIS ha sido
PARCIAL, quedando la fraccin AMILOPECTINA presente, la que da un color ROJO
VIOLETA con el Yodo. Cuando el cultivo permanece INCOLORO con el reactivo, nos
indica que hubo CONSUMO TOTAL del almidn, lo cual indica HIDROLISIS TOTAL:
POSITIVO.
MATERIALES.-
1. Cultivos de Bacillus subtilis y Eschericha coli

2. Placas con agar almidn y agar leche
3. Solucin de lugol diluido
PROCEDIMIENTO.-
Sembrar una sola estra de Escherichia coli en un extremo y Bacillus subtilis en el otro
, tanto sobre la placa con agar almidn como en la de agar leche.
Incubar las placas a 37C por 48 horas.
Al terminar la incubacin bae la superficie de la placa de agar almidn con la solucin
diluida de lugol. Observe la reaccin del lugol con el almidn y la reaccin en las
reas cercanas a las zonas de crecimiento microbiano.
Observe las placas de agar leche y los cambios ocurridos alrededor del crecimiento
microbiano.
Examine ambas superficies de las placas y anote sus observaciones
RESULTADOS.-
E. coli (NEGATIVO): No metaboliza almidn el lugol vira al azul intenso. No se observa
halo alrededor de las colonias en agar leche.
B. subtilis (POSITIVO): Al agregar lugol presenta zonas claras y transparentes en
el contorno del desarrollo microbiano, hasta donde el almidn es atacado.
ENDOENZIMAS MICROBIANAS
PRODUCCION DEL ACIDO SULFHIDRICO (H2S)
El ACIDO SULFHIDRICO (H2S), es un catabolito que resulta de la hidrlisis de la

protena a partir de los aminocidos azufrados (CISTINA y METIONINA) por accin
enzimtica de algunas bacterias.
Ciertos microorganismos en condiciones anaerbicas reducen la CISTINA a dos
molculas de CISTEINA por accin de una reductasa; para luego en anaerobiosis oxidar
estas molculas con liberacin de los siguientes productos: H2S, NH3, cido actico y
c. frmico (Ver esquema).
COOH COOH

CHNH3 CHNH2 COOH
H2
CH2 - S - S - CH2 2 CHNH2
cistina reductasa
CH2SH
Cistena
COOH
I Cistena
CHNH2 + 2H2O H2S + NH3 + CH3COOH + HCOOH
I
CH2SH
Para el reconocimiento en la prctica de este producto se utilizan 2 mtodos:
a) Mtodo del Papel Filtro: En Caldo Triptosa o Caldo Peptonado se cultivan

bacterias productoras de H2S por 24 a 48 hrs., colocndose luego una tira de papel filtro
impreganada con SUBACETATO DE PLOMO en solucin acuosa saturada. Si la
bacteria forma H2S el extremo distal del papel se tornar de color negro, si es negativo
el papel permanecer blanco.
MATERIAL.-
1.- 2 tubos con caldo triptosa o caldo peptonado.

2.- 2 tiras de papel filtro secas, embebidas en solucin de subacetato de plomo.
3.- 2 cultivos en caldo de E. coli y Salmonella typhi (puede emplearse tambin
Proteus vulgaris).
4.- Gradilla, asa de siembra, lpiz graso, mechero de Bunsen.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Sembrar cada cepa en caldo triptosa o caldo peptonado.

2.- Colocar en cada tubo la tira de papel filtro con la sal de plomo en igual forma que
para la prueba del Indol.
3.- Incubar a 37C durante 24 a 48 hrs.
4.- Retirar ambos cultivos de la incubadora.
RESULTADOS.-
Observar el ennegrecimiento del extremo proximal del papel filtro en el cultivo de

Salmonella typhi o Proteus vulgaris (H2S POSITIVO) y en el de E. coli el extremo
proximal del papel filtro inalterado (H2S NEGATIVO).
b) Mtodo de SIM (Medio Semislido): Es un medio semislido que lleva

incorporado sales metlicas; despus de 24 a 48 hrs. de incubacin el medio se teir
de color negro por la elevada produccin de H 2S. Este producto se evidencia por el
ennegrecimiento del medio en presencia de ciertas sales de metales pesados: plomo,
hierro, bismuto y otros, formndose sulfuros.
MATERIAL.-
1.- 2 tubos con medio semislido.

2.- 2 cultivos en caldo de E. coli, Salmonella typhi o Proteus vulgaris.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Sembrar por puntura la cepa de E. coli, Salmonella typhi o Proteus vulgaris.
2.- Incubar a 37C durante 24 a 48 hrs.
3.- Retirar ambos cultivos de la incubadora.
RESULTADOS.-
Observar el cultivo de Salmonella typhi o Proteus vulgaris, de color negro. Abundante

en caso de ste ltimo y limitado al trazo de siembra en el caso del primero. Cualquiera
de las dos cepas forman H2S. En el cultivo de E. coli, observar desarrollo microbiano sin
formacin de H2S, es decir, sin ennegrecimiento.
UTILIZACION DEL CITRATO DE SIMMONS
Es un medio slido que se utiliza con fines diferenciales. El medio lleva Citrato de Sodio
como fuente de carbono, que algunas bacterias utilizan bajo la forma de cido ctrico.
Se manifiesta el desarrollo con el viraje del medio al AZUL por marcada alcalinidad. Se
utiliza como indicador Azul de Bromotimol; las sales amnicas del medio como nica
fuente de nitrgeno.
Es de gran importancia para diferenciar los gneros y diversas especies dentro de las
ENTEROBACTERIACEAS. Por ejm. Enterobacter aerogenes que toma el carbono del
citrato, desarrollando en el medio, mientras que E. coli no lo utiliza, por lo tanto no
desarrolla.
Para mayor ilustracin se indica la frmula del medio:

Sulfato de Magnesio 0.2 g
Fosfato Monoamnico 1 g
Fosfato Dipotsico 1 g
Citrato de Sodio 2 g
ClNa 5 g
Bacto Agar 15 g
Bacto Azul de Bromotimol 0.08 g
FUNDAMENTO: La enzima que cataliza la ruptura del citrato recibe varios nombres:
CITRATO LIASA, CITRASA, CITRATO DE ALDOLASA, CITRIDO MOLASA. Los
productos primarios de la ruptura son OXALACETATO y ACETATO que luego son
convertidos en PIRUVATO y CO2 por una OXALACETATO DESCARBOXILASA. Se
manifiesta la reaccin POSITIVA con un viraje del medio al AZUL por la marcada
alcalinidad debida al exceso de CO2 que se produce cuando el CITRATO se convierte
en OXALACETATO y que luego es descarboxilado a PIRUVATO y CO2. El exceso de
CO2 se puede combinar con sodio y con agua para formar CARBONATO DE SODIO
que es lo suficientemente alcalino para lograr el cambio del indicador.
MATERIAL.-
1.- 2 cultivos en caldo: E. coli y Enterobacter aerogenes.

2.- 2 tubos con AGAR CITRATO DE SIMMONS.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Sembrar por estra cada cepa en tubos con agar citrato de Simmons en plano
inclinado.
2.- Rotular datos.
3.- Incubar a 37C por 24-48 hrs.
4.- Retirar los cultivos de la estufa.
RESULTADO.-
MICROORGANISMO AGAR CITRATO DE UTILIZ. DEL CARBONO

SIMMONS
E. aerogenes Desarrollo, viraje del medio al Positivo
AZUL INTENSO
E. coli No desarrollo. No viraje del Negativo
medio.
Prctica N12
Fermentaciones microbianas
La respiracin puede ser aerobia o anaerobia, depende del tipo de organismo. La gran
parte de los seres vivos tienen respiracin aerobia, la cual ordinariamente oxida
completamente el producto inicial a bixido de carbono y agua. Las reacciones
respiratorias de los organismos son generalmente muy similares. Es bajo condiciones
anaerobias que se encuentran diferencias primordiales en el mecanismo mediante el
cual las enzimas procesan el producto inicial en los distintos organismos. En el primer
experimento de esta serie se demostrar la fermentacin del producto inicial en bixido
de carbono y alcohol por un microorganismo capaz de fermentar muchos azcares.
Esta reaccin es fundamental para la industria de la fermentacin, Todas las bebidas
alcohlicas en muchos pases se fabrican mediante la accin de tales microorganismos.
En otro experimento se demuestra como los azcares fermentables se convierten en
cido lctico como nico producto. Ambos procesos son muy similares. Muchos
organismos emplean como sustrato inicial, un azcar tpico, la glucosa (tambin llamada
dextrosa), la cual transforman enzimticamente en cido pirvico, y ste a su vez se
puede procesar de diversas maneras para producir los distintos productos de la
fermentacin. El cido es una "encrucijada" metablica en el proceso respiratorio,
debido a que casi todos los organismos convierten todos los azcares primero en este
cido. Sin embargo, a partir de esta encrucijada se pueden seguir gran diversidad de
caminos para llegar a los productos terminales. La reaccin general se puede
representar as:
I. FERMENTACIN CIDO MIXTA
Las bacterias al igual que otros organismos, utilizan los carbohidratos en su

metabolismo como fuente de energa. Los productos de oxidacin o fermentacin que
se llevan a cabo por accin enzimtica dependen de la naturaleza del azcar y en
particular de las especies microbianas.
Las bacterias por su amplia capacidad metablica utilizan muchas vas para desdoblar
estos sustratos ya sea aerbicamente (OXIDACION) o anaerbicamente
(FERMENTACION).
Los diversos tipos de fermentacin dan lugar a muchas clases de cidos orgnicos
(lctico, actico, frmico, propinico, butrico, etc.), alcoholes (etlico, isoamlico, D-
amlico, butlico, isoproplico), acetona y otros productos como CO 2 e H2, muchos de los
cuales son aprovechados para la identificacin genrica y/o especfica y adems tienen
importancia industrial.
Cada especie microbiana tiene la habilidad de atacar un carbohidrato en particular, ya
sea en aerobiosis como en anaerobiosis con formacin de acidez o acidez y gas. En
caso de bacterias aerbicas la oxidacin es generalmente total llegando hasta los
productos finales CO2 y H2O, por lo que la energa producida por el microorganismo es
mucho mayor que cuando se realiza en condiciones anaerbicas.
Por ejemplo, en GLUCOSA:
(1) C6H12O6 + 6O --------> 6O2 + 6H2O + 674 cal. (OX. TOTAL)
(2) C6H12O6 + 4O2 ------> 3(COOH)2 + 3H2O + 493 cal. (OX. PARCIAL)
(3) DESCOMPOSICION AEROBICA:

- C6H12O6 ---------> 2CH3-CHOH-COOH + 22cal.

ACIDO LACTICO
- C6H12O6 ---------> 2CH3-CH2OH + 2CO2 + 22 cal.

ALCOHOL ETILICO
- C6H12O6 ---------> 3CH3COOH + 15 cal.

AC. ACETICO
La bacteria E. coli ataca glucosa con produccin de acidez y gas; los cidos formados
son frmico, actico, lctico, succnico, adems alcohol etlico, CO2 y H2. Se sugiere que
la formacin de gas que se libera al medio es a partir principalmente del cido frmico
por accin de una enzima llamada HIDROGENOLIASA, por lo tanto las bacterias que
no posean esta enzima, no formaran gas a partir de glucosa, as por ejemplo, Shigella
sp.
Nosotros en la prctica vamos a demostrar la fermentacin de la glucosa con formacin
de acidez solamente por la cepa Staphylococcus aureus, y formacin de acidez y gas
por la cepa E. coli. El proceso oxidativo de la glucosa en anaerobiosis se demostrar
con una cepa de Pseudomonas sp., la misma que no metaboliza el disacrido lactosa
como fuente de energa. Los medios para esta prueba pueden ser lquidos o
semislidos, sobre la base de un sustrato al que se le agrega indicador (rojo de fenol
anhidro o azul de bromotimol) y el carbohidrato que se desea ensayar en cantidades del
1% respectivamente.
La fermentacin se evidencia por el viraje del medio y formacin de burbujas de aire en
la campana de DURHAM en el medio lquido, o viraje o rotura del sustrato en el medio
semislido. La oxidacin tambin se evidencia por el viraje del medio.
Las lecturas se pueden verificar despus de las 24 hrs. hasta los 7 das, mayor tiempo
de incubacin en casos de resultados dudosos.
MATERIAL.-
1.- Cultivos de E. coli, S. aureus, Pseudomonas aeruginosa.

2.- 6 tubos con glucosa en columna: 3 tubos con petrolato y 3 tubos sin petrolato.
3.- 2 tubos con lactosa en columna.
4.- Gradilla, asa de siembra, lpiz graso y mechero.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Sembrar por puntura en glucosa las 3 cepas por duplicado.

2.- Sembrar E. coli y Pseudomonas aeruginosa en los tubos de lactosa.
3.- Rotular datos: nmero de grupo, nombre de la cepa, fecha.
4.- Incubar a 37C por 48 hrs.
5.- Retirar los cultivos de la incubadora.
RESULTADOS.-
E. coli:
Glucosa con petrolato: FERMENTACION
(Acidez-Gas)
Glucosa sin petrolato: OXIDACION
(Acidez-Gas)
Lactosa: FERMENTACION
(Acidez-Gas)
Staphylococcus aureus:
Glucosa con petrolato: FERMENTACION
(Acidez-Rojo)
Glucosa sin petrolato: NO METABOLIZA
Pseudomonas aeruginosa:
Glucosa con petrolato: NO METABOLIZA
Glucosa sin petrolato: OXIDACION (*)
Lactosa: NO METABOLIZA
(*) Ligera coloracin rojiza en la superficie.

(Acidez-Gas)
PRODUCCIN DE ALCOHOL POR LAS LEVADURAS
En la fermentacin de las levaduras, el cido pirvico se convierte enzimticamente

en acetaldehdo (denominado intermediario metablico) el cual es reducido con
hidrgeno en alcohol, con liberacin de bixido de carbono, como se indica en la
ecuacin de la pg. anterior.
La reaccin de las bacterias que producen cido lctico es ms sencilla. Una vez
formado el cido pirvico, se reduce a cido lctico, el producto final, como se ve en la
ecuacin de abajo. En ambos ejemplos la glucosa proporciona los hidrgenos para las
reducciones.
FERMENTACIONES ESPONTNEAS:
Los microorganismos del mosto tienen dos orgenes, por una parte de la uva y por otra
de las bodegas y utensilios de vendimia, transporte, etc.
Cuando se hacen aislamientos de las uvas, antes de que lleguen a la bodega aparecen
2 gneros principales:
Kloeckera y Hanseniaespora que son entre el 50 y 75% de levaduras aisladas de la
superficie de las uvas. En mucha menor proporcin se aslan otros gneros como
Cndida, Pichia, Kluyveromyces y Hansenula.
El gnero considerado principal responsable de las fermentacin del vino es
Sacharomyces, o bien no se aisla de la uva o bien en muy poca cantidad (50 ufc). Pero
tanto en la bodega como en materiales para la elaboracin del vino, la especie
mayoritaria es S. cerevisiae y las dems aparecen menos, las proporciones se invierten.
Adems se sabe que las cepas de S. cerevisiae que colonizan bodegas son las que
aparecen luego en la fermentacin, hay entre 104106 bacterias/ml al inicio de la
fermentacin y llegan a 108109 bacterias/ml al final.
Pero hay un desarrollo secuencial de especies a lo largo de la fermentacin y las cepas

que la inician la suelen ser Kloeckera, Hanseniaespora y Candida, se llaman levaduras
apiculadas (por su forma) estas cepas se desarrollan durante los 34 primeros das de
las fermentacin y son las responsables de los 56 primeros grados de alcohol obtenido.
A medida que pasan das y sube la graduacin se mueren la mayora, se les denomina
tambin levaduras de bajo poder fermentativo lo que pasa es que resisten poco al
etanol. Entonces comienza a desarrollarse S.cerevisiae sern sus clulas las
responsables de consumir el resto de azcar y acabar la fermentacin, por lo que
conviene que sean muy tolerantes al etanol, para que acaben todos los azcares.
Cuando esto no es as, a continuacin pueden desarrollarse las levaduras perjudiciales
entre las que hay algunas cepas que pertenecen al gnero Cndida y Pichia que pueden
producir grandes cantidades de cido actico.
Hay otro tipo de levaduras artificiales que son las levaduras oxidativas como
Sporobolomyces, Hiptococcus, Rhodotorula, que oxidan el etanol a acetaldehdo dando
tambin vinos de baja calidad. Las levaduras apiculadas todas producen algo de cido
actico.
Otra razn por la cual no debe quedar azcar residual es porque en el mosto tambin
se pueden desarrollar muchos tipos de bacterias por un lado las bacterias acticas y por
otro las malolcticas, bacterias lcticas que pasan el cido mlico a lctico (esto no lo
hacen las de la leche), pero los gneros son los mismos :Leuconostoc, Pediococcus,
Lactobacillus.
Estas bacterias acticas si pueden ser perjudiciales al convertir:
etanol acetaldehdo cido actico
Si el n de levaduras presentes inicialmente en el mosto es suficientemente alto y las
levaduras de la fermentacin consumen todos los azcares para evitar que aparezcan
los microorganismos perjudiciales dan vino de gran calidad. Pero puede fallar por varias
razones, en aos muy lluviosos las uvas pierden carga microbiana y las fermentaciones
pueden no arrancar e incluso pudrirse el mosto antes de tiempo.
Otra cuestin es el uso de fungicidas en la via, que afecta tambin a las uvas y tambin
puede llegar a ocurrir que las especies perjudiciales sean ms resistentes a fungicidas
que las otras. Adems a veces las especies que aporta la bodega, utensilios, etc son
cepas no resistentes al metabisulfito ni al etanol y no ocurre la fermentacin.
Si ocurre algo de esto se obtienen vinos de baja calidad. As que los vinos de
fermentaciones espontneas pueden ser a veces muy buenos y otras veces muy malos,
para evitar esto se proponen otras fermentaciones.
FERMENTACIONES DIRIGIDAS:
Una vez que el mosto est sulfitado se aade una sola cepa de Sacharomyces
(denominada pie de cuba) que debe ser capaz de iniciar la fermentacin, desplazar por
competencia a las otras y acabar los azcares. En estos casos se aade mas
metabisulfito para eliminar mejor a las otras (nuestra cepa debe ser resistente a l),
adems esta cepa debe aadirse a ms de 10 6 clulas/ml y si se consigue que esta
cepa domine, los vinos obtenidos seran de calidad mas regular (pero siempre iguales).
El problema de estas fermentaciones es que tienden a estandarizar los vinos obtenidos.
De todas formas la tendencia actual es no usar cepas comerciales, sino aislar el mximo
n posible de levaduras dentro de cada comarca vincola. Estas levaduras se denominan
Levaduras ecotpicas.
LAS CARACTERSTICAS EN BASE A LAS CUALES SE SELECCIONAN ESTAS
LEVADURAS SON:
VELOCIDAD FERMENTATIVA, cuanto mayor sea antes coloniza y desplaza a la
microbiota autctona.
Una gran variabilidad entre cepas garantiza una colonizacin rpida
TOLERANCIA A METABISULFITO, importante para poder desarrollarse con las

cantidades de ese producto.
TOLERANCIA A ETANOL, deben ser tolerantes a su producto final.

CAPACIDAD PARA PRODUCIR TOXINA KILLER, es una toxina producida por algunas
cepas que matan a cepas sensibles de la misma sp, respecto a esto hay: las K+,
productoras, las K sensibles y las K neutras que no la producen pero la resisten. El
K+ es el ms interesante, la toxina la produce el genoma de un virus metido en un
genoma. Todas las cepas comerciales lo tienen porque aunque no sean productoras,
es un carcter fcil de transferir por la tcnica de fusin de protoplastos en la que se
elimina la paredcelular de dos clulas de S.c y luego en presencia de PEG y Ca++ se
fusionan. Hay una variante de esta tcnica que utiliza los mutantes Kar de S.cerevisiae
son mutantes deficientes en cariogamia, incapaces de fusionar sus ncleos, entonces
se emplean unas cepas que son K+ y llevan una mutacin en el gen Kar1 y si las
fusionamos con una levadura vnica, se fusionar membrana, citoplasma, pero no
ncleo, el ncleo de la cepa mutante Kar degenera y entonces el hbrido lleva ncleo de
nuestra capa seleccionada y en citoplasma los virus productores de toxina. Esta
caracterstica por si sola no garantiza la predominancia de la cepa en el medio, por
varias razones: no todas las otras levaduras sern sensibles a la toxina y a veces el pH
del
mostovino no es el ptimo para la toxina que vara entre 44,5 mientras que en mostos
o mostosvinos est a 33,5 normalmente.
CARCTER FLOCULANTE
Capacidad que tienen las de algunas cepas de S.c para formar agregados y
sedimentar espontneamente. Esto favorece la filtracin porque as las levaduras se
retiran y no colmatan los filtros usados luego. Esta caracterstica es debida a una prot
de superficie denomina floculina del tipo de las lectinas, que atraviesa la pared de la
levadura y se une a un receptor en la clula adyacente, este receptor es el manano
(residuos de manosa), como receptor competitivo de este manano puede funcionar la
glucosa, esto es importante porque las levaduras slo deben flocular una vez alcanzada
la fase estacionaria, sino podran irse al fondo sin acabar de fermentar todos los
azcares.
La glucosa puede ser receptor de la floculina, entonces no floculan hasta que se acaba.
En la mayora de vinos el proceso termina con la fermentacin alcohlica por
S.cerevisiae , pero en vinos muy cidos puede tener lugar una 2 fermentacin llamada
fermentacin malolctica por bacterias de gnero Lactobacillus, Pediococcus,
Leuconostoc las especies de estos gneros que hay en vino se diferencian de las de la
leche porque hacen:
Lmalato piruvato Llactato
Y esto produce una subida del pH y adems el cido producido es ms suave al paladar.
Pero esto slo interesa en vinos de pH 33,5 y la sufren vinos de uvas que tienen mucho
malato o no estn maduras. Pero se considera una alteracin del vino en aquellos de
pH superior a 4 (por tanto filtramos el vino antes de que pueda ocurrir esta fermentacin).
PRODUCCIN DE ENZIMAS, los 2 ms importantes son por un lado las pectinasas y

por otro glucosidasas. Las primeras degradan restos de paredes celulares, evitando la
posterior obturacin al filtrar los vinos.
Las pectinas son polmeros de cido galacturnico unidos entre s por enlaces _4
glucosdicos, estos polmeros suelen esterificarse con metilos y entonces se llama
pectina (sino se llaman pectonas o cido poligalacturnico), sobre ellos actan 3 tipos
de enzimas:
endopoligalacturonasas, cortan la cadena en cualquier pto, productos finales: trozos
menores de pectina
exopoligalacturonasas, actan slo en extremos liberando monmeros de cido
galacturnico
. pectinmetilesterasas que actan liberando los grupos metilo, estas enzimas se
aaden en mezcla al mosto, son producidas por Aspergillus, y se obtienen del
sobrenadante de su cultivo.
Estas enzimas pcticas comerciales tienen efecto negativo y es que por accin de las
pectinmetilesterasas aumenta mucho el contenido en metanol de los vinos. Entonces si
tenemos una cepa que produce estas enzimas ya no hace falta aadir las comerciales.
Potencialmente todas las cepas llevan un gen pgu1 que codifica endopoligalacturonasa
pero no en todas se expresa. En las que se expresa el enzima tendr prcticamente el
mismo efecto que los preparados comerciales, y tienen la ventaja de no liberar metanol.
Las otras enzimas de inters son las glucosidasas, que contribuyen a potenciar los
aromas del vino. Los aromas del vino dependen de tres componentes principales:
Alcoholes superiores: se forman mediante degradacin de aa.
steres: se forman por reaccin del etanol o alcoholes superiores con cidos
orgnicos.
Terpenos: principales responsable de aromas agrutados, pueden encontrarse en dos
formas: libres en el mosto (son los que olemos) o bien ligados a un azcar y en este
caso se denominan terpenilglucsidos, nosotros no los percibimos. Las glucosidasas
pueden hidrolizar el enlace terpenoazcar y as aumentar la cantidad de terpenos libres
y por tanto aumentar el aroma.
MENOR PRODUCCIN POSIBLE DE SH 2, se forma de aminocidos azufrados y da

mal olor al vino, cuanto menos produzca mejor.
Los 4 primeros aseguran el predominio en el mosto y las otras se refieren a la calidad

del producto. Una gran variabilidad entre cepas garantiza una colonizacin rpida.
VINOS ESPUMOSOS:
Se obtienen mediante una 2 fermentacin alcohlica inducida por la adicin de azcar
y levadura en la que se forma el CO2 que les da el gas.
El sustrato es vino tras la 1 f. (en general se usan una mezcla de vinos). Las principales
dificultades que se encontraran las levaduras ser la ya alta graduacin alcohlica del
vino y que la fermentacin se hace a baja T para no perder aroma.
El inculo se prepara acondicionndolo a estas temperaturas, esto lleva dos semanas,
la cepa usada es S. cerevisiae , pero una variedad denominada ellipsoideus y en una
primera parte el inculo se prepara en mosto diluido con agua y se suplementa con
extracto de levadura y sulfato diamnico para aumentar la fuente de N y se le van dando
distintos pases al medio, pero suplementado con vino cada vez de mayor graduacin
alcohlica y a medida que esta se sube se va bajando la T en cada paso (entre 3 y 4
pases).
As conseguimos un inculo capaz de fermentar a porcentaje de etanol 101112 y a
T por debajo de 16C y este inculo es el usado para elaborar estos vinos.
MATERIALES para FERMENTACION ALCOHLICA.-
1.- Un cultivo de Saccharomyces cerevisiae (levadura).

2.- Tubo con caldo de extracto de malta (1).
3.- 5 g de Pasas o 500 g de uva
4.- Agua destilada.
5.- Tubos limpios (2).
PROCEDIMIENTO.-
Inocule aspticamente un tubo con caldo de extracto de malta e incbelo. Luego ponga
4-5 pasas secas en un tubo limpio. Aada suficiente agua destilada para cubrir las
pasas, luego utilice una bagueta para machacar las pasas en el agua hasta que queden
en suspensin. Ponga el tubo en un bao de agua y djela hervir por 5 a 10 minutos,
agitando de vez en cuando y macerando las pasas con el agitador. Tpela y djela
enfriar a temperatura ambiente. Inocule esta suspensin con el cultivo de levaduras.
Repita, en un tercer tubo, la misma operacin pero sin hervir el extracto de pasas ni
inocular con levaduras. As, este tercer tubo es slo una suspensin no estril de pasas
maceradas. Incube todos los tubos. Despus de una semana de incubacin, destape
cada tubo y hulalo para detectar el olor caracterstico del alcohol etlico. Se podra
hacer un anlisis cualitativo para demostrar la presencia del alcohol etlico, pero de
ordinario el olor es suficiente. Ntese si se producen burbujas de gas en los tubos al
agitarlos. Escriba sus resultados.
Si emplea uvas, lvelas bien y machaquelas en un mortero. Coloquelas en un matraz
de 500 mL e inocul con 10 ml de un cultivo de saccharomyces cerevisiae. Incubar por
1 semana. Luego filtre el sobrenadante sobre un embudo esteril que tenga un filtro de
gasa-algodn-gasa. Degustar.
FERMENTACIN LCTICA POR LAS BACTERIAS
DERIVADOS LCTEOS, ELABORACIN DEL YOGUR:
El sustrato es leche entera, desnatada o concentrada (con un poco menos de agua, o

con suplemento de leche en polvo, as se concentra ms la casena), tambin se
aaden aromatizantes, edulcorantes, azcar, si lo va a llevar el yogur.
Las cepas que se inoculan a la leche pasteurizada son 2, Streptococus termophilus y
Lactobacillus bulgaricus (S.salivaris sbsp termophilus y L. del brueckii sbsp bulgaricus,
tambin denominados as, respectivamente).
Estas bacterias se aaden en igual cantidad, primero hidrolizan la lactosa en glucosa y
galactosa (con una galactosidasa).
La degradacin de glucosa forma el cido lctico responsable del descenso del pH y
entonces precipita la casena y forma gel que es el yogur (la galactosa permanece en la
leche).
Un 2030% de la lactosa es consumida inicialmente, para pasarla a cido lctico.

Durante la 1 parte de la fermentacin, ambas bacterias se desarrollan al mismo tiempo
mientras hay pptidos y aminocidos libres, cuando se acaban, los Streptococcus
mueren porque no producen proteasas, pero Lactobacillus si las produce y sigue
creciendo y por accin de sus proteasas vuelve a crecer Streptococus. Aunque el
producto final es cido lctico, tambin se producen metabolitos secundarios como
acetaldehdo (aroma tpico del yogur), esta es una de las capacidades en las que se
basan para la seleccin de cepas.
TCNICAS PARA LA ELABORACIN DEL YOGUR:
YOGUR FIRME: pasteurizacin, inoculacin de cepas a igual concentracin respecto a

la leche, se mezclan en la leche que se distribuye en recipientes individuales y se deja
fermentar 23 h a 42C. La fermentacin se detiene cuando la concentracin de cido
lctico es igual a 1% (se detiene bajando la temperatura, para yogur con aromas se les
hecha antes de la fermentacin), y se guardan a 23C suficiente para la fermentacin.
YOGUR BATIDO: igual pero en recipiente nico, y al final se bate la cuajada y se
envasa, en este caso se aade parte del azcar al principio y otra parte al batir, junto
con la fruta si es que lleva.
T ptima de Streptococcus es 40C, de Lactobacillus 45C, se suele hacer 1h a 42C y
otra a 45C (sin embargo se ha visto que juntas van mejor a T intermedias).
Una vez elaborado dura unos 24 das por debajo de 8C (se detiene la actividad de las
bacterias lcticas, pero no todas y sigue degradndose lactosa a cido lctico, y adems
tambin hay protelisis por proteasas de Lactobacillus, que degradan la cuajada y da
sabor amargo). Esta formacin de cido lctico y protelisis se evitara con una
pasteurizacin posterior al proceso (postres lcteos por ley no se pueden llamar yogur
si no tienen bacterias vivas), el yogur debe tener unas 10 9 bacterias/g vivas.
CARACTERSTICAS DE INTERS EN LAS CEPAS DE YOGUR:
Produccin de acetaldehdo.
Produccin de polisacridos extracelulares (glucanos), dan yogures ms cremosos.
.Resistentes a fagos que pueden producir graves prdidas. Se conocen 4 tipos de fagos
y las cepas comerciales son resistentes a ellos. Si aparece un fago nuevo, hay que
volver a aislar a la cepa resistente, esto es fcil, se siembra en placa (a partir del yogur
donde apareci el fago), y si hay alguna colonia, esa es resistente al fago. Esta
resistencia se debe al cambio de receptores externos de la bacteria.
ALTERACIONES: Slo por alguna espora que quede luego de pasteurizar o que llega
al yogur durante el envasado. Generalmente por otra razn no porque es un medio cido
que no lo resisten muchas bacterias.
YOGURES TERAPUTICOS:
Se comercializan con el nombre de Bioyogurt, se les atribuye ventajas o beneficios a la
salud del hombre, la tecnologa de fermentacin es igual que la tradicional y se
diferencia en los microorganismos que " en el producto. Adems, de Streptococus
termophilus y Lactobacillus bulgaricus aparecen otras dos cepas que son Lactobacillus
acidphilus y el Bifidobacterium longum (2 bacterias intestinales).
PROPIEDADES:
Reestablecen la biota normal.
Previenen contra infecciones.
Pueden ayudar a controlar los niveles de colesterol.
Se ha demostrado que pueden producir sustancias antitumorales.
Para que sirvan hay que asegurar que lleguen vivas al intestino y que se implanten y
proliferen.
Hay mucha variabilidad en cuanto a sensibilidad del pH, se seleccionan las que ms
aguantan.
Tambin las que resisten y viven en presencia de bilis, son las que llegan vivas al
intestino y se considera que si al menos llega 106 bacterias/ml vivas al intestino vale.
ALTERACIONES EN EL YOGUR:
Slo levaduras y hongos las producen, por sobrevivir a pH cido. Las contaminaciones
suelen ser antes del envase.
OTRAS LECHES FERMENTADAS:

Kefir Candida kefir
S. cerevisiae Forman agregados como coliflores
Bacterias lcticas
MATERIALES.-
1.- 100 ml de Cultivos de Lactobacillus casei y Streptococcus lactis ( yogurt

natural)
2.- Matraz con 900 ml de leche descremada, fresca, estril.
PROCEDIMIENTO.-
Inocule L. casei y Str. lactis en un MATRAZ con leche estril ( contenidos en el vasito
de yogurt natural). Incube a 35 C durante 3 horas. Luego examine para detectar
cualquier cambio. Cuando todos los matraces presenten la misma apariencia en cuanto
a la formacin de cuajos, haga una tincin Gram de cada probeta y note tambin su olor
caracterstico.
Despus de examinar sus preparaciones con el objetivo de inmersin. Qu
deducciones puede hacer con respecto a la presencia en la leche agria de los distintos
tipos de organismos? Dibuje lo que vea. El producto de esta fermentacin es el cido
lctico.
Una disminucin en el pH del tubo ha causado un cambio fsico en la protena de la
leche. La protena predominante en la leche es la casena, seguida por la lactalbmina.
Al disminuir el pH, estas protenas se vuelven insolubles, lo cual se manifiesta en la
formacin de cuajos. Es muy sencillo demostrar que la formacin de cuajos obedeci
exclusivamente al aumento de acidez. Consiga otro poco de leche ordinaria sin
esterilizar, adale algunas gotas de la solucin de cido clorhdrico y observe los
resultados. Note la similitud entre los contenidos de este tubo y de los tubos que
sufrieron accin microbiana. El cido lctico producido por las bacterias lcticas es
responsable por el agriamiento de la leche. Es precisamente por este proceso que se
obtienen alimentos como el jocoque y el yogurt.
CUESTIONARIO
1.- A qu llamamos fermentacin lctica?

2.- A qu se debe la generacin de etanol en el tubo con pasas inoculadas?
3.- Qu otras formas de deteccin de productos finales podemos emplear?
PRCTICA N13
METABOLISMO AUTOTRFICO
OBJETIVOS
Comprobar el crecimiento microbiano en un medio exento de C orgnico

Calcular la velocidad de oxidacin del in ferroso por Acidithiobacillus ferrooxidans, en
medio 9K.
INTRODUCCIN
La lixiviacin bacteriana es definida como un proceso de oxidacin
en el cual los sulfuros insolubles son oxidados a sulfatos
solubles por efecto de ciertas bacterias.
El ataque bacteriano de sulfuros minerales ha estado ocur-
riendo desde tiempos inmemoriales en su forma natural. Sin
embargo, el microorganismo Acidithiobacillus ferrooxidans,
responsable de este proceso fue aislado de agua de mina y
descrito por primera vez por Colmer y Hinkle en 1947. Desde
entonces se intensificaron los estudios tratando de encontrar
una aplicacin industrial a estos microorganismos.
En los ltimos aos la lixiviacin bacteriana ha alcanzado
singular importancia en la minera a nivel mundial, debido a la
factibilidad econmica del proceso, al que se suma la creciente
disponibilidad de minerales de baja ley que no pueden ser
tratados econmicamente por los procesos convencionales.
Acidithiobacillus ferrooxidans
Paralelamente, la bioextraccin de otros productos como
en estado natural. uranio, zinc, plomo, nquel, le confieren mayor inters al
proceso.
MATERIAL
Suspensin bacteriana (centrifugada a 5000 rpm/30 min).
Agua destilada pH=2.
H2SO4 1N, reactivos.
Erlenmeyers, estufa, shaker, pHmetro, microscopio.
Cmara de Neubauer.
Pipetas x 5 ml.
Bureta.
PROCEDIMIENTO
Titulacin del in ferroso

Tener un cultivo creciendo en medio 9K.
Colocar 0,5 ml de suspensin bacteriana a un Erlenmeyer con 9,5 ml de agua cida, dos
gotas del indicador orto fenantrolina y titular con una solucin 0,01N de nitrato de amonio
crico. Cuando va de color rosado a blanco azulado, indica que ya estn, titulados
entonces se debe anotar el volumen usado, y hacer los clculos respectivos.
Como blanco podemos usar 10 ml de agua cida con dos gotas de ortofenantrolina.
Oxidacin del in ferroso

Medio 9K
Porcentaje de
Tiempo: das Fe total g/l Fe++ g/l Fe+++ g/l
oxidacin
0
1
2
3
4
5
Crecimiento del microorganismo
Colocar en cada Erlenmeyer 100 ml con medio nutriente 9K.
Inocular 5 ml de suspensin bacteriana al Erlenmeyer I y 5 ml de solucin de timol 5% al

Erlenmeyer II (blanco).
Marcar volumen inicial con el lpiz de cera.
Ubicar los cultivos en condiciones fsicas ptimas (agitacin, oscuridad) para que
proliferen.
Realizar posteriores anlisis qumicos de Fe++, pH, completando el volumen inicial con
H2O destilada pH=2.
Anotar variaciones macroscpicas del sistema: cambio de color, precipitados, turbiedad,

etc.
Se puede elaborar la curva de crecimiento y la curva de oxidacin del in ferroso.

Prctica N10
Aislamiento de microorganismos anaerobios
OBJETIVO.-
- Conocer los principios bsicos del estudio de microorganismos anaerbicos.
Las bacterias anaerbicas son organismos que desarrollan sus actividades vitales en
ausencia de oxgeno; esto es directamente txico, aunque no los mata, si son colocados
nuevamente en ambiente anaerbico el crecimiento se restablece. Obtienen su energa
y fuentes de C y N a partir de compuestos como: H 2S, CO2, NO3 y otros. Se ha
demostrado que otros microorganismos anaerbicos estrictos pueden soportar ciertas
tensiones de Oxgeno. La produccin de H2O2 resulta txica para las clulas porque no
producen catalasa.
El crecimiento de los anaerobios es dependiente de un bajo potencial de xido-
reduccin, lo que nos es posible en presencia de aire.
La mayor parte de los seres vivos, excepto las plantas (aunque en la obscuridad
incluso ellas requieren oxgeno), requieren de un constante abasto de oxgeno para
sobrevivir. Sin embargo, en el caso de los microorganismos esto no es siempre cierto.
Algunos microbios no slo no requieren oxgeno sino que no pueden sobrevivir en
presencia de este elemento. Tales organismos se conocen como anaerobios ("sin aire").
En general, desde el punto de vista de su relacin con el oxgeno, los organismos se
pueden dividir en tres categoras. Los microorganismos que requieren aire se
denominan aerobios; los que mueren en presencia de aire se llaman anaerobios
estrictos; y aquellos que pueden vivir con o sin aire se les conoce como facultativos.
A veces se utiliza una cuarta categora, los microaerfilos. Estos organismos de
ordinario prefieren una existencia anaerobia, aunque de manera restringida pueden
sobrevivir en presencia de aire. En experimentos subsiguientes se tratarn las
diferencias en el cultivo de organismos aerobios y anaerobios.
I. METODOS DE CULTIVO DE BACTERIAS ANAEROBICAS
Para el aislamiento y cultivo de microorganismos anaerbicos se han ideado diversos

mtodos, todos los cuales tienden a eliminar el O2 atmosfrico del medio de cultivo.
Estos mtodos pueden ser:
- METODOS FISICOS
- METODOS QUIMICOS
- METODOS BIOLOGICOS
a) METODOS FISICOS
Basados en la eliminacin del O2 atmosfrico por absorcin o separacin mecnica.

Entre estos tenemos:
-EBULLICION: Que se consigue haciendo hervir el medio de cultivo, contenido en tubos

taponados, por 20 minutos en bao mara y enfrindolo bruscamente para evitar que el
oxgeno redisuelto en el medio ambiente se incorpore nuevamente al medio de cultivo;
se adiciona luego de sembrado el medio, una capa de sustancias inertes y estriles
como: vaselina lquida, lanolina, parafina o vaspar (mezcla de parafina y vaselina en
proporciones iguales) y otros.
-ELIMINACION DEL OXIGENO ATMOSFERICO: En este mtodo los tubos y placas

inoculadas se colocan en un recipiente cerrado, del que se extrae el aire mediante una
bomba de vaco reemplazndolo luego por H2, N2, He o una mezcla de nitrgeno y CO2.
En este mtodo se obtienen mejores resultados colocando pirogalol alcalino en el
recipiente, el cual absorbe el O2 del medio favoreciendo el desarrollo de los microorga-
nismos anaerobios.
Entre los principales recipientes anaerbicos tenemos:
1. Frascos de Brewer.- Su aplicacin se basa en la presencia de un catalizador

(Paladio); el H2 y el O2 se combinan para formar agua, la atmsfera pierde su O2;
el catalizador se coloca en la tapa del frasco y se calienta con una corriente
elctrica. Los cultivos se colocan en el frasco junto con un indicador de anaero-
biosis; por ejm., el azul de metileno, el cual permanece azul en su estado oxidado
y se vuelve incoloro al ser reducido.
2. Frascos de McIntosh y Fildes.- Son recipientes metlicos con tapa hermtica,

la cual est provista de dos aberturas para suministrar y extraer gas. En su super-
ficie interior tiene una cpsula que contiene el catalizador formado por pastillas
de xido de aluminio cubierto de paladio. Los medios sembrados se colocan
dentro del recipiente, se extrae el aire interior y se hace pasar una corriente de
H2 durante 5 minutos; al pasar la corriente elctrica se produce la eliminacin del
O2 por combustin con el H2 formndose agua, se suministra luego una cantidad
de H2 para equilibrar la presin interna a 30 mm Hg.
3. Caja de Spray y el Tubo de Brewer.- Son otros dispositivos fsicos para lograr
anaerobiosis.
b) METODOS QUIMICOS
Existen sustancias qumicas con propiedades reductoras que fijan el O 2 atmosfrico

creando condiciones anaerbicas al disminuir la tensin de oxgeno. Entre estos
productos tenemos: Glucosa 2%, Formiato de Sodio al 0.5%, Tioglicolato sdico y Sulfito
de Sodio al 0.3%; los cuales adicionados a los medios de cultivo lquidos permiten el
desarrollo de microorganismos anaerbicos en condiciones anaerbicas.
-El empleo de agar anaerbico que contenga Tioglicolato sdico como agente reductor,
en placas de Brewer, permite el aislamiento y cultivo superficial de bacterias anaer-
bicas. La superficie interna de la cubierta de Brewer forma un cierre hermtico con el
agar impidiendo el ingreso de ms O2 atmosfrico.
-El empleo de agar WILSON-BLAIR, que contiene Sulfito de Sodio y Alumbre de Hierro
como agentes reductores, en tubos o en placas permite el cultivo y enumeracin de
microorganismos anaerbicos sulfito-reductores.
-El empleo de tejidos vivos o muertos, tales como rin, hgado, tejidos de corazn,
cerebro de buey, fragmentos de fibra muscular; en medios de cultivo lquidos contri-
buyen a reducir la tensin de oxgeno del medio, favoreciendo el cultivo de anaerobios
en condiciones anaerbicas.
MATERIAL.-
1. Tubos con agar nutricio en plano inclinado, con tapones de algodn (2).
2. Tubos con agar nutricio en columna (2).
3. Tubos con caldo de tioglicolato (2).
4. Acido piroglico (en polvo).
5. Solucin de hidrxido de sodio (4%).
6. Goteros.
7. Tapones de hule (6).
8. Cultivos de Clostridium sporogenes y Bacillus subtilis
PROCEDIMIENTO.-
Inocule los dos tubos con caldo de tioglicolato, uno con Clostridium sporogenes y
el otro con Bacillus subtilis. Procure no agitar los tubos una vez inoculados. Con la
aguja de inocular, inocule un tubo con agar vertical con C. sporogenes y otro con B.
subtilis. Inserte la aguja profundamente en el centro del agar, y extrigala sin agrandar
ms el orificio. Etiquete cada tubo con el nombre del organismo que contiene y ponga
los tubos en la incubadora a 37C. Siembre un tubo con agar nutricio estril con C.
sporogenes y otro con B. subtilis (en este experimento debe usarse algodn para tapar
los tubos inclinados). Con el mango de la aguja de inocular introduzca el tapn de
algodn hasta que ste casi toque el agar en la probeta. Por encima del tapn de
algodn sumergido aada cido piroglico seco formando una capa de media pulgada
arriba del algodn. Deje suficiente espacio para ajustar un tapn de jebe o corcho en la
boca del tubo encima de la capa de cido. Aada el cido piroglico de cada tubo, el
contenido de dos goteros llenos de hidrxido de sodio, tape los tubos inmediatamente
con tapones de jebe o inviertalos. Etiquete los tubos y pngalos dentro de una lata vaca
para mantenerlos verticales en posicin invertida y mtalos as en el incubador a 37C
por 24 a 48 horas. La mezcla de cido piroglico e hidrxido de sodio es un absorbente
de oxgeno muy eficaz. Por lo tanto, el cultivo que se efecte en cualquiera de los tubos
ser en ausencia de oxgeno. Dibuje en su cuaderno los patrones de crecimiento
obtenidos en las seis tubos y exponga sus conclusiones
c) METODOS BIOLOGICOS
Estos mtodos se basan en el empleo de microoganismos aerbicos que absorben

el O2 atmosfrico creando condiciones anaerbicas. Se puede lograr este efecto
incubando juntos o separadamente los microorganismos. Un mtodo clsico de la
siembra por puncin en agar de un microorganismo anaerobio y sembrando luego un
microorganismo aerobio como Bacillus subtilis o en todo caso otro tal como Klebsiella
pneumoniae en la superficie del medio; cualquiera de estos ltimos crearn condiciones
favorables para le desarrollo del microorganismo anaerobio cultivado. El mismo efecto
puede lograrse cultivando juntos (el m.o. anaerobio con el m.o. aerobio) en la superficie
de una placa de agar dividida en 2 partes iguales; en una de ellas se siembra por estras
el m.o. aerbico y en la otra parte el anaerbico, se sellan cuidadosamente los bordes
de la tapa; el m.o. aerobio facultativo toma el O2 ambiental y elimina CO2, al disminuir la
tensin de O2 se favorece el desarrollo del m.o. anaerbico.
MATERIAL.-
1.- Cultivo en Caldo Carne Glucosada de 24-48 hrs. de incubacin de Clostridium

perfringens y otro con C. tetani.
2.- 2 placas con Agar Wilson & Blair.
3.- 2 tubos con Agar anaerbico Wilson & Blair.
4.- 2 tubos con Caldo Tioglicolato y Caldo Carne Glucosada.
5.- Un frasco anaerbico.
6.- Sol. de cido piroglico o Pirogalol.
7.- Sol. de parafina o vaselina lquida.
8.- Asas de siembra, plumones para rotular vidrio, mechero.
9.- Muestras de heces, agua de regado, leche o tierra abonada o frtil.
10.- Sol. salina tamponada.
11.- Latas grandes de caf o leche en polvo.
12.- Guantes quirrgicos descartables.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Preparar diluciones de la muestra problema, en solucin salina tamponada y

calentarlas en bao mara a 80C durante 10 minutos.
2.- Tomar un inculo de C. perfringens en Caldo Carne Glucosada, con pipeta
pasteur. En condiciones estrictamente aspticas, siguiendo las pautas del aisla-
miento y siembra de anaerobios, levantar la tapa de la placa que contiene al
agar. Depositar el inculo sobre la superficie del medio y luego con el asa de
siembra describa estras, procurando agotar el inculo en los primeros trazos.
Utilice toda la superficie del medio de aislamiento.
3.- Retirar el asa de siembra y dejar caer suavemente la tapa de la placa de agar.
Rotular datos sobre el dorso de la placa Petri sembrada, sealando: nmero de
grupo, tipo de microorganismo y fecha.
4.- Para la enumeracin de microorganismos anaerbicos sulfito reductores de la
muestra problema, las ltimas diluciones someterlas al calor para eliminar la flora
no esporgena; sembrarlas tomando alcuotas de 0.1 ml en Agar Wilson & Blair
en placas y en tubos con el mismo medio, previamente licuadas y enfriadas a
55C. En las placas practicar el mtodo de aislamiento por difusin.
5.- Para la siembra en medios lquidos: Caldo Tioglicolato y Caldo Carne Glucosada,
se deben extraer los tapones de algodn con el dedo meique y el margen
cubital de la mano derecha, cerca del mechero; depositar el inculo previamente
cargado y retirar el asa aspticamente; flamear la boca del tubo antes y despus
de sembrar.
6.- Rotular datos sobre el dorso de las placas Petri sembradas y tubos sembrados,
consignar el nmero de grupo, tipo de muestra y fecha.
7.- Colocar las placas en posicin invertida dentro del recipiente o frasco
anaerbico, la cual contiene la solucin alcalina de Pirogalol; cerrar
hermticamente el frasco e incubar a 37C por 48 hrs.
Para microorganismos que requieren de ciertas concentraciones de CO2, es
recomendable encender una vela dentro del frasco anaerbico a fin de consumir
el O2 y producir CO2.
8.- Los tubos con Caldo Tioglicolato y Caldo Carne Glucosado, sembrados y
rotulados se incuban libremente en anaerobiosis a 37C por 48 hrs. Luego del
tiempo de incubacin, retirar los medios e interpretar los resultados.
METODO BIOLOGICO:
1.- A las placas sembradas con la cepa patrn o la muestra problema, se les coloca
en la tapa del Petri una capa de Agar Nutricio y sobre esta capa sembrar rpida
y profusamente con hisopo la cepa de Klebsiella pneumoniae o Serratia sp.
2.- Sellar las placas sembradas con la manga de un guante quirrgico usado e
incubar a 37 C.
3.- Observar y anotar los resultados.
Cuestionario
1.- Por qu debe calentarse la dilucin de la muestra antes de sembrarse en el medio?
2.- Cul es la diferencia que existe entre una bacteria anaerobia, una microaerfila y
una anaerobia facultativa?
3.- Qu finalidad tiene el empleo de sustancias reductoras para el aislamiento?
Anote sus resultados.

Prctica N15
Accin de agentes fsicos sobre los microorganismos
Es bien conocido que las actividades vitales de los organismos estn condicionadas
por su ambiente. Modificando fundamentalmente estos factores, el organismo bien se
adapta a las nuevas condiciones o muere; dependiendo esto de la magnitud y tipo de
cambio operado. En este aspecto, los microorganismos difieren de las clulas de plantas
superiores y animales.
El conocimiento de varios factores fsicos que controlan la supervivencia y multiplicacin
de los microorganismos, hace que la actividad bacteriana pueda ser incrementada,
disminuida o destruida completamente.
Las alteraciones en el tiempo de divisin celular indican que uno de los factores o ms
han cambiado. El tipo de muerte bacteriana por agentes fsicos est relacionado al
nmero de bacterias sobrevivientes, lo que significa que el proceso de desinfeccin no
es repentino sino gradual, en el que el nmero de microorganismos muertos por unidad
de tiempo es mayor al principio y mucho menor cuando la accin contina.
A.- EFECTO DE LA TEMPERATURA
Las bacterias son capaces de sobrevivir amplios lmites de temperatura, pero el rango
en el que ellos pueden crecer y ejercer sus actividades est entre los 0-90 C.
* RANGO DE MUERTE TERMICA: Es la temperatura en la que muere un

organismo al ser expuesta 10 minutos bajo condiciones controladas.
* CONDICIONES QUE VARIAN EL RANGO DE MUERTE TERMICA:
- Contenido de agua del medio: La muerte de la bacteria por accin del calor es
por coagulacin de las protenas del protoplasma. Cuanto mayor es el porcentaje de
agua en el medio, menor ser la temperatura requerida para matar la bacteria.
- Contenido de agua de los organismos: A menor cantidad de agua, los
microorganismos se secan y se produce mayor resistencia a la temperatura.
- Concentracin de hidrogeniones: Los organismos mueren fcilmente en
condiciones cidas o alcalinas, requirindose temperaturas menores que en medios
neutros.
- Composicin del medio: Los medios que contienen alta concentracin de
protenas incrementan la temperatura requerida para destruir bacterias, ya que las
protenas forman una pelcula alrededor de los microorganismos protegindolos de
influencias desfavorables.
- Edad de las clulas: Las clulas viejas son ms resistentes que las clulas
jvenes a las condiciones adversas.
MATERIAL.-
1.- Cultivo en caldo de E. coli.

2.- Una pipeta graduada de 1 ml.
3.- 8 tubos estriles.
4.- 8 placas estriles.
5.- 1 frasco con 100 ml. de agar fundido.
6.- Bao mara.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Distribuir el cultivo de E. coli en los 8 tubos en cantidades de 2 ml. cada uno
(ENUMERAR TUBOS).
2.- Llevar el primer tubo a bao mara por 10 minutos a 45 C.
3.- Transcurrido este tiempo, enfriarlo bruscamente en agua fra.
4.- Una vez enfriado, tomar 1 ml y vaciar en una placa Petri estril.
5.- Vertir en la placa el agar fundido, mezclar bien y dejar solidificar.
6.- Rotular datos.
7.- Incubar a 37 C durante 24-48 hrs.
Proceder en igual forma con los 7 tubos restantes, pero elevando la temperatura del
bao mara (10 ) cada vez que se coloca un nuevo tubo; por lo tanto, para el tubo 8 la
temperatura del bao mara ser de 115 C.
8.- Hacer las lecturas y determinar la ZONA TERMICA LETAL.
RESULTADO.-
Observar que la luz directa ha actuado como bactericida, impidiendo el desarrollo de los
grmenes en la parte no cubierta con el papel negro.
ESTERILIZACION
Es el procedimiento por el cual se destruyen los microorganismos y sus formas

resistentes, mediante el uso de agentes fsicos y qumicos.
La esterilizacin de microorganismos por muchos agentes exhibe una cintica de primer
orden, en el cual el nmero de supervivientes decrece en funcin lineal del tiempo de la
exposicin.
Cuando se grafica la proporcin de grmenes supervivientes a un agente letal en funcin
al tiempo de exposicin, se obtiene la Curva de Supervivencia que generalmente es
exponencial. Por ejemplo, la curva de supervivencia a la accin de desinfectantes, a la
accin de la radiacin uV.
En caso de curvas no exponenciales, en que hipotticamente cada suceso de muerte
ocurre al azar se obtiene una curva de supervivencia de concavidad superior que se
atribuye a la susceptibilidad de cada microorganismo en particular. La forma de la curva
de supervivencia estara nicamente determinada por la distribucin de
susceptibilidades individuales de cada microorganismo, cada una de las cuales se
supone es inversamente proporcional al tiempo en el que un microorganismo sobrevive
a la accin de un agente letal. La distribucin de los tiempos de supervivencia suele ser
logartmicamente normal.
En consecuencia, del proceso de ESTERILIZACION depende el xito del estudio de un
microorganismo al estado de pureza, ya que el material requerido debe reunir
condiciones de asepsia que garantice con exactitud y validez un diagnstico e inves-
tigacin en particular.
METODOS DE ESTERILIZACION.-
ESTERILIZACION POR AGENTES FISICOS:
A. ESTERILIZACION POR MEDIO DEL CALOR
Sabemos que el calor se transmite de un cuerpo de mayor temperatura a otro de grado

calorfico menor. Para comprobar el fundamento de la accin del calor sobre los objetos
a esterilizar por medio de aparatos, debemos recordar que ste se propaga por 3
mtodos: CONDUCCION, CONVECCION y RADIACION.
- Por CONDUCCION: Cuando el calor se transmite a travs de la materia sin

movimiento aparente de la misma, estando en contacto el cuerpo ms caliente con el
ms fro. Ejm.: una barra de metal calentada por uno de sus extremos, llega a calentarse
totalmente por desplazamiento interno de sus molculas, sin movimiento aparente. En
este caso, el calor se propaga de molcula a molcula.
- Por CONVECCION: Cuando el calor se propaga a travs de la materia en

movimiento apreciable de la misma, como sucede en masas lquidas o corrientes areas
al ser sometidas al calentamiento. Ejm.: Si calentamos una vasija de agua, las capas en
contacto con la vasija se dilatan y al disminuir su densidad por el calentamiento suben
a la parte superior del lquido. As las capas del agua van experimentando un movi-
miento ascendente, comunicando calor a las partes altas; por lo tanto, hay conduccin
de calor por conveccin. En este caso, la propagacin de calor se efecta por masas
grandes del cuerpo. Con mayor razn los gases, por estar sus molculas en constante
movimiento, propagan el calor mediante este fenmeno. Como experiencia prctica,
agreguemos una sustancia coloreada a una vasija de agua hirviendo; se podrn apreciar
los movimientos ascendentes y descendentes de las partculas coloreadas por accin
de la conveccin.
- Por RADIACION: Cuando el calor se transmite sin necesidad de materia

intermedia y en forma de ondas. Ejm.: Un foco de luz, que por estar vaco, permite el
paso de la radiacin que va siempre en lnea recta y a la misma velocidad que lo hace
la luz.
1.- ESTERILIZACIN POR ACCIN DEL FLAMEADO:

El material se somete a la accin directa de la llama de un mechero, sin que se altere ni
sufra deterioro. Se esteriliza mediante este mtodo: asas de siembra, material de disec-
cin previo a un bao de alcohol, las bocas de tubos, matraces, frascos, etc., al hacer
una siembra o transplante (CALOR POR CONDUCCION).
2.- ESTERILIZACIN POR EL CALOR SECO:

Se hace actuar el aire caliente sobre el material a esterilizar, por ejemplo el vidrio seco
y protegido, conforme se ha indicado en la prctica anterior. Como el aire es un gas y
como tal, mal conductor del calor, se le hace actuar en caliente por un tiempo
prolongado. Ejm.:
160C.....................Por 90 a 120 minutos

170C.....................Por 60 minutos (1 hora)
180C.....................Por 30 a 45 minutos
El calor se inicia por CONDUCCION y se propaga por CONVECCION. Los aparatos

ms usados son el HORNO PASTEUR y ESTUFAS DE AIRE CALIENTE. Se conocen
varios modelos modernos elctricos con funcionamiento automtico.
HORNO PASTEUR
Es cilndrico, de metal, de triple pared, la intermedia ms corta que las otras dos,
quedando formadas dos cajas paralelas (concntricas) que se comunican por la parte
superior. Las paredes son metlicas y revestidas de planchas de asbesto al igual que la
puerta. Por los tubos o al fondo, entre las paredes media y externa se halla un colector
de mechero mltiple o juego de resistencia (fuente calrica). En la parte superior se
adapta un tiro de salida, regulable por medio de una mariposa o una chimenea para la
salida y renovacin del aire (escape de los productos de combustin) mediante las
corrientes de conveccin que circulan a travs del espacio intermural y hacia el interior
del horno. Otro orificio en la parte superior que llega tambin al interior lleva adaptado
un termmetro. El espacio interno, dividido por rejillas metlicas a distintas alturas, para
situar el material a esterilizar. La disposicin especial de las paredes obliga al aire
caliente (que penetra fro por la base del aparato) a hacer un doble recorrido, de abajo
hacia arriba y viceversa, renovndose constantemente.
3.- ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO:

Actan coagulando las protenas del protoplasma microbiano en tiempo menor a la
esterilizacin por aire caliente. El calor se propaga por CONVECCION. Puede ser por:
- EBULLICION
Cuando el material es sometido a la accin directa del agua hirviendo, a 100C de
temperatura. Esta puede elevarse por adicin de sustancias qumicas (por ejm., Car-
bonato de Calcio, etc.). Por este mtodo se pueden esterilizar: jeringas, guantes de jebe,
sondas, ropa, etc., por 40 a 60 minutos. El aparato ms prctico es un hervidor metlico
elctrico con fuente de gas.
- VAPOR FLUENTE
Cuando se hace actuar sobre el material un chorro continuo de vapor de agua por 30 a
60 minutos. El vapor debe calentar a 100C los objetos, temperatura que se consigue
cuando el vapor no contiene aire y es correcta la circulacin del vapor en aparatos que
se emplean para este fin.
- VAPOR DISCONTINUO O TINDALIZACION

Cuando acta el calor en forma fraccionada por 3 das sucesivos a 100C durante 30 a
40 minutos. En el primer da se destruirn las formas vegetativas, en el segundo, en un
intervalo de 24 horas, se eliminarn las formas activas germinadas por las esporas y en
el tercer da, las formas esporuladas. Este mtodo es prctico para esterilizar sustancias
orgnicas que sufren descomposicin a altas temperaturas. Los aparatos de Arnold y
de Koch son muy recomendados.
- VAPOR DE AGUA SATURADA A PRESION

Es uno de los mtodos ms seguros y efectivos. Nos permite una esterilizacin completa
de la mayora de los mtodos de cultivo y soluciones que no contienen sustancias de
fcil desnaturalizacin. El vapor de agua debe actuar a 10 15 libras de presin (1 a
1.5 atm de presin) durante 15 a 20 minutos. Se emplean AUTOCLAVES con este
objeto.
AUTOCLAVE:
Se basa en la ebullicin del agua a una presin superior a la normal y al subir la presin
atmosfrica, aumenta la temperatura. En consecuencia, si la presin de vapor en el
recipiente cerrado aumenta, la temperatura tambin sube y as el vapor penetra por
smosis a la clula, coagulando su citoplasma. Se destruyen las formas vegetativas y
esporuladas en una sola operacin. El modelo de nuestro laboratorio consta de una
caldera de cobre batido estaado interiormente, protegida por una camisa metlica
tambin de cobre, quedando formada de paredes dobles. En su base est instalada la
fuente calrica (gas). A una distancia del fondo del recipiente, est la placa cribosa para
apoyo del material y para la salida del vapor; en la parte superior se halla la tapa que es
pesada (de bronce fundido) en cuyo borde interno est adaptado una correa de caucho
para el cierre hermtico del aparato. Los tornillos o bullones en el margen superior
refuerzan el cierre, evitndose el escape del vapor. Posee adems, un manmetro (que
marca las libras de presin), una vlvula de seguridad (para escape del vapor cuando
la presin exceda a la contencin del aparato), un termmetro y una llave o espita (para
la salida del aire y vapor al empezar a hervir el agua).
Importancia de la descarga de aire

* La mezcla de aire con vapor resulta en una temperatura ms baja que la
deseada.
* El aire impide la penetracin del vapor en los intersticios de materiales porosos,
ropas quirrgicas, etc.
* El aire es ms denso que el vapor, tienda a formar una capa ms fra en la parte
ms baja del autoclave y previene el adecuado calentamiento.
PRESION Y TEMPERATURA
LIBRAS DE PRESION ATMOSFERAS TEMPERATURAS

C
_______________________________________________________
0 0 100
5 0.5 108
10 1.0 116
15 1.5 121
20 2.0 217
25 2.5 231
30 3.0 234
B. ESTERILIZACION EN FRIO
1.- ESTERILIZACIN EN FRO POR FILTRACIN:

Mediante este mtodo se esterilizan los medios de cultivo lquidos o sustancias
orgnicas que sufren alteraciones de sus propiedades fsicas y qumicas por accin del
calor. Permite eliminar las partculas slidas de los lquidos.
Este mtodo se emplea para esterilizar suero sanguneo, lquido asctico, soluciones de
albmina, medios carbohidratados, solucin de antibiticos y otros.
El equipo completo consta de:

a) Bujas Filtrantes, que pueden ser de varias calidades y modelos:

Filtros de BERKEFELD (porcelana no vidriada)
Filtros de SEITZ (amianto asbesto)
Filtros de vidrio poroso o calcinado PIREX o GENA.
Filtros de acetato de celulosa
b) Kitasato, depsito del lquido esterilizado. En la boca lleva ajustado el

filtro.
c) Bomba de Vaco, que puede ser elctrica o funcionar al agua, conectada

mediante una manguera al borde lateral del Kitasato.
La filtracin depende del tamiz y grado de adsorcin (estructura y naturaleza del filtro),
del dimetro del poro y sus cargas elctricas, del pH del medio, la viscosidad (cuando
es menor pasa rpidamente) y la fuerza electromotriz que guarda relacin con la
capilaridad del filtro. Las bujas de CHAMBERLAND L1 y L2, separan partculas gruesas
y microorganismos grandes; L3 para la mayora de las filtraciones bacterianas; L5 para
partculas menores de 0.2 micras; L11 retiene algunos virus filtrables y L13 deja pasar
nicamente los bacterifagos. Las bujas BERKEFELD son de 3 porosidades: VIEL,
semejante a L3 de CHAMBERLAND y WONING, ms fina, semejante a L5 o L7 de
CHAMBERLAND. Los filtros de membrana son discos de papel de 50 mm de dimetro
y 0.1 de espesor, sus poros pueden variar de 0.1 a 0.005 . Ejm. MILLIPORE. Se
disponen en un soporte especial que termina en forma de embudo.
2.- ESTERILIZACIN POR CENTRIFUGACIN:

Mediante la fuerza centrfuga es posible conseguir esterilizacin de algunas sustancias
y productos a grandes revoluciones por minuto, por un tiempo prolongado. Juega un
papel importante la tensin superficial del lquido y la densidad de las partculas. Los
actuales modelos de centrfugas refrigeradas por sus rendimientos a altas velocidades
son magnficas para separar lquidos de slidos a la vez que esterilizan. Ejm. Modelos
de SORVAL o INTERNATIONAL (hasta 15,000 a 20,000 rpm).
3.- FLUJO LAMINAR

La atmsfera del laboratorio debe contener el menor nmero de microorganismos, ya
que los medios de cultivo son muy susceptibles de contaminarse. En los laboratorios,
los procesos de aireacin y climatizacin estn asegurados por la circulacin de aire
acondicionado, de la humedad relativa y temperatura convenientes segn las
estaciones, de esa manera se evitan las corrientes de aire por las aberturas intempesti-
vas de ventanas. El sistema de flujo laminar evita las turbulencias, regulando la
velocidad de circulacin de aire a 0.5 m/s. En el sistema horizontal, el aire estril es
impulsado desde el fondo hacia el manipulador, pero no hay garanta para el producto
manipulado.
PROCEDIMIENTO.-
A.- ACCION DEL CALOR
1.- ACCION DEL CALOR POR FLAMEADO

Calentar al rojo el alambre y flamear parte del vstago de metal, siguiendo la
demostracin del profesor. La tcnica de la esterilizacin del asa es importante para
garantizar la asepsia.
2.- ACCION DEL CALOR POR EBULLICION

Este mtodo est por dems demostrarlo. El alumno ha tenido alguna vez la experiencia
de esterilizar en agua el equipo de jeringas inyectables.
3.- ACCION DEL AIRE CALIENTE - MANEJO DEL HORNO PASTEUR

a) Acondicionar adecuadamente el material, evitando que toque las paredes,
asegurar el cierre hermtico de las puertas.
b) Encender el sistema de calefaccin.
c) Controlar la temperatura mediante el termmetro . Este debe llegar a la deseada
, por ejemplo, 180C. Contar desde ese momento el tiempo (90 minuotos).
d) Transcurrido ese tiempo, apagar la fuente elctrica y dejar enfriar.
e) Abrir la puerta y retirar el material.
NOTA:
a) Una buena esterilizacin se reconoce por el aspecto ligeramente quemado y
quebradizo del papel. Los tapones de algodn se tornan amarillentos.
b) Nunca se debe abrir la puerta del horno mientras est funcionando.
4.- ACCION DEL VAPOR A PRESION - MANEJO DEL AUTOCLAVE

a) Agregar agua a la caldera hasta 2 cm por debajo de la placa cribosa.
b) Introducir el material de preferencia en un cesto. Evitar que el material toque las
paredes.
c) Cerrar la tapa y ajustar los bulones en cruz a fin de permitir el cierre hermtico.
d) Encender la fuente calorfica.
e) Mantener la espita o llave lateral abierta hasta la salida de un chorro continuo de
vapor de agua: ETAPA DE PURGADO.
f) Controlar el manmetro hasta que la aguja haya alcanzado de 10 a 15 libras de
presin. El termmetro debe alcanzar 121C, desde este momento contar el tiempo de
esterilizacin (15 a 20 minutos).
g) Regular la fuente calorfica para mantener constante la presin por el tiempo
deseado; vencido ste, apagar los mecheros.
i) Esperar que la aguja del manmetro regrese a 0.
j) Abrir con cuidado la espita para que escape todo el vapor, aflojar los bulones
diametralmente y levantar la tapa con cuidado. retirar todo el material.
NOTA:
a. El purgado es importante porque permite desalojar el aire interno.
b. Tener cuidado en controlar el manmetro al inicio y durante la etapa de
esterilizacin; un descuido de control en la presin deseada puede ser la causa de
daos irreparables por explosin del aparato.
B.- ACCION DE LA PRESION OSMOTICA
Este factor viene a ser la presin desbalanceada que da lugar a los fenmenos de
difusin y smosis, en una solucin donde hay diferencia de concentraciones.
Si un organismo est inmerso en una solucin que tenga alta presin osmtica, el agua
saldr de la clula hasta que establezca un equilibrio entre el interior y exterior celular
lo que ocasionar que la membrana citoplasmtica y el protoplasma se contraigan hacia
el centro de la clula; es entonces que decimos que la clula se ha plasmolizado y el
proceso es llamado PLASMOLISIS.
Lo contrario ocurre cuando una clula est en un medio con baja presin osmtica, el
agua ingresar a la clula hasta establecer equilibrio con el exterior y si la diferencia de
presin es grande la membrana tender a explotar y se dir que la clula est
plasmoptizada y el fenmeno es llamado PLASMOPTISIS. Los cambios celulares
durante la plasmlisis y plasmoptisis pueden demostrarse fcilmente en clulas
animales y vegetales. Las bacterias son sensibles en menor grado a estos cambios
osmticos y es necesario que las presiones sean muy grandes para observar una accin
destructiva sobre la bacteria.
MATERIAL.-
1.- Cepa de E. coli.

2.- 4 placas con concentraciones crecientes de sacarosa o NaCl al 5%, 10%, 20%,
40%.
PROCEDIMIENTO.-
1.- En las placas con diferentes concentraciones de NaCl o sacarosa, sembrar la

cepa de E. coli.
2.- Rotular datos.
3.- Incubar a 37 C por 24-48 hrs.
4.- Comparar con crecimiento en placa con agar nutricio (concentracin normal de
NaCl) de E. coli.
C.- ACCION GERMICIDA DE LA LUZ ULTRAVIOLETA
Los rayos ultravioleta son componentes invisibles de la radiacin solar. Todos los
microorganismos: hongos, levaduras, bacterias, virus y esporas son sensibles al
tratamiento UV. Sin embargo, las esporas requieren mayor tiempo de exposicin para
tener el mismo porcentaje de reduccin que las clulas vegetativas.
El poder de penetracin de la luz depende de la cantidad de materia suspendida. La
experiencia demuestra que 1 minuto de exposicin a la luz UV provoca la muerte del
70% de bacterias G(-) y 60% de G(+) contenidas en cubos de hielo de 30 mm de grosor.
Los rayos UV son absorbidos por las protenas, el DNA, RNA y otros compuestos
orgnicos; siendo las bases pirimdicas las ms sensibles.
La UV altera el DNA causando dmeros de timina y citosina, lo que provoca mutaciones
en la clula irradiada y cuando la intensidad de irradiacin es mayor el efecto puede ser
letal.
MATERIAL.-
1.- Cultivo de E. coli en caldo.

2.- Cultivo de B. subtilis en caldo.
3.- Una placa de agar corriente.
4.- Una lmpara de radiacin ultravioleta.
5.- Un cartn circular de 12 cm. de dimetro, cortado en uno de los cuadrantes.
6.- Una pipeta Pasteur.
7.- Un lpiz de vidrio.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Con la pipeta capilar colocar de 10 a 12 gotas de uno de los cultivos en el centro
de la placa.
2.- Con la esptula de Drigalsky extender la siembra por toda la superficie del medio.
3.- Trazar con el lpiz graso cuatro cuadrantes perpendiculares sobre el dorso de la
placa, enumerndolos del 1 al 4.
4.- Colocar la placa sembrada a 32 cm de la lmpara de rayos uV.
5.- Cambiar la tapa por el crculo de cartn.
6.- Exponer el cuadrante libre (1) a la radiacin por 30 seg. Apagar la lmpara.
7.- Rotar el crculo de cartn dejando libre el cuadrante (2) y exponer a la luz uV por
60 seg. Apagar la lmpara.
8.- Rotar el crculo de cartn dejando libre el cuadrante (3) y exponer a la luz uV por
90 seg. Apagar la lmpara.
9.- El cuadrante (4) no se expone.
10.- Cubrir con su tapa el cultivo e incubar a 37 C por 24 hrs.
11.- Anotar los resultados.
RESULTADOS.-
Tabla I: DETERMINACION DE LA ZONA TERMICA LETAL
Tempe- NUMERO DE PLACAS

ratura
de los 1 2 3 4 5 6 7 8
cultivos
en caldo 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48 24 48
35 C
45 C
55 C
65 C
75 C
85 C
95 C
105 C
115 C
Tabla II: ACCION DE LA PRESION OSMOTICA
Desarrollo de E. coli en Placas

Concentracin de NaCl
Interpretaciones
5%
10%
20%
40%
Cuestionario
1.- Qu componentes bacterianos confieren resistencia trmica?
2.- Qu cuidados debemos practicar frente a la luz ultravioleta?
3.- Qu aplicaciones prcticas se basan en la accin de la presin osmtica?

Prctica N16
Accin de agentes qumicos sobre los
microorganismos
OBJETIVOS.-
- Inhibir el crecimiento microbiano por accin de las sustancias qumicas.
A.- EL EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE IONES HIDRGENO (pH) EN LOS

MICROORGANISMOS
Se consideran los efectos de distintas concentraciones de iones hidrgeno con respecto

a su capacidad para suprimir el crecimiento microbiano. En este experimento los
microorganismos se inoculan en un medio que es capaz de mantener el crecimiento
siempre y cuando el pH sea tolerable. La nica diferencia entre las distintas probetas de
medio inoculado radica en el pH de los caldos en cuestin. Se observar el crecimiento
y se extraern conclusiones. Para que los resultados sean vlidos, es preciso que las
observaciones de todas la probetas se realicen a un mismo tiempo.
MATERIALES.-
1.- Cultivos de E. coli y Saccharomyces cerevisiae.

2.- Tubos con caldo nutricio estril previamente ajustadas con HCI 1.0 N y NaOH
1.0 N a valores de pH de 3.0, 5.0, 7.0, 9,0 y 11.0 (1 de cada una).
3.- Tubos con caldo de extracto de malta estril ajustadas a los mismos
valores de pH.
PROCEDIMIENTO.-
Inocule cada una de los tubos de caldo de nutricio de distintos valores de pH con E. coli.
Repita el procedimiento pero ahora con las probetas de extracto de malta, inoclelas
todas con S. cerevisiae. Incube y anote sus observaciones, en trminos de la cantidad
de crecimiento, al primero, segundo y al quinto da. Emplee la siguiente escala: 4+ para
mximo crecimiento y 0 para nada de crecimiento; clasifique los crecimientos
intermedios como 3+, 2+ 1 +.
En varios experimentos subsiguientes ser menester juzgar la cantidad de crecimiento
microbiano en un medio lquido dado. Aunque este sistema de evaluar con la escala de
4+ a 0 es razonablemente exacto, es bastante fcil elaborar otro sistema ms
cuantitativo. La escala de McFarland es apropiada para este fin.
B.- ACCION DE LOS COLORANTES
La accin de los colorantes sobre las bacterias es ms bien bacteriosttica (detiene la

multiplicacin de las mismas, sin matarlas). En general, todos los colorantes derivados
del alquitrn de hulla (grupo TRIFENILMETANO) tienen este poder y esta propiedad se
ha empleado en el reconocimiento y diferenciacin de muchas especies por su accin
selectiva. Parece que hay alguna relacin entre la accin bacteriosttica y el
comportamiento de la bacteria frente a la coloracin Gram. Es por este motivo que
resultan ms susceptibles a la accin de los colorantes los microorganismos Gram(+).
Por otro lado, la actividad bacteriosttica de los colorantes cidos o bsicos se ve
incrementada con la acidez o la alcalinidad respectiva del medio.
MATERIAL.-
1.- Cultivo en caldo de E. coli, B. subtilis, St. aureus.

2.- 3 placas de agar y cristal violeta a concentraciones 10 -4, 10-5 y 10-6,
respectivamente.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Dividir cada una de las placas en 3 partes iguales.

2.- Sembrar en cada tercio de las placas, una cepa distinta: E. coli, B. subtilis y St.
aureus respectivamente.
3.- Rotular datos e incubar a 37 C por 24-48 hrs.
C.- ACCIN OLIGODINMICA DE LOS METALES PESADOS
Durante siglos se han venido fabricando utensilios de plata para servir la comida, tanto
recubiertos como de plata slida. Esta costumbre predata la teora microbiana de la
enfermedad. Ahora se sabe que esta costumbre denota inteligencia. El ion de plata es
uno de los iones metlicos de gran actividad inhibitoria obre el crecimiento bacteriano,
incluso en soluciones muy diluidas. Sorprendente como parece, la plata de un platn o
vaso libera en solucin, suficientes iones plata para ejercer esta actividad inhibitoria.
Lo mismo se aplica a otros iones metlicos, como el cobre, aunque la plata es el ms
activo. Puesto que en nuestros das ya no quedan muchas monedas de plata
emplearemos el cobre para demostrar este efecto.
MATERIALES.-
1 . Cultivos de E. coli y Staphylococcus aureus.

2. Agar nutricio en placas Petri.
3. Dos monedas bien limpias.
4. Placas Petri (2).
S. Solucin de alcohol 95% -HCI 1 N.
6. Agua destilada.
7. Tubos con agar nutricio (2).
8. Pinzas (1).
PROCEDIMIENTO.-
Prepare dos placas Petri con agar nutricio. Derrita el medio en dos tubos y enfrelos a
45C. Inocule uno de los tubos con E. coli y el otro con Staphylococcus aureus usando
un par de asas llenas de organismos por cada inculo. Rote cada tubo entre sus manos
para distribuir los organismos homogneamente. Mantenga los tubos a 45C mientras
procede con el resto del experimento. Lave bien la moneda, primero con agua y jabn,
luego bela en la solucin limpiadora de cido alcohol (use sus pinzas) y luego
enjuguelo bien en agua destilada. Manipule la moneda nicamente con pinzas, las que
debe haber flameado previamente. Deposite la moneda firmemente en el centro de la
placa con agar de tal forma que se adhiera a la superficie del agar. Luego tome el tubo
con agar derretido, enfriado e inoculado con E. coli, y virtalo sobre la moneda en el
centro de la placa de tal manera que se forme un segunda capa de agar sobre la primera.
Rotlela con el nombre del organismo y pngala a incubar en posicin invertida a 37C
por 24-48 horas. Repita el mismo procedimiento con el otro organismo en la segunda
placa Petri. Observe los resultados y haga un dibujo ilustrando la actividad del cobre en
el experimento.
D.- ACCION DE LAS SUSTANCIA ANTISEPTICAS

Sustancias germicidas que actan por efectos qumicos. El proceso en s puede ser de
poder bactericida, antisptico o bacteriosttico en algunos casos. Hay confusin con el
significado exacto de cada trmino. En realidad la destruccin de microorganismos
vegetativos y esporgenos depende enormemente del factor de solucin, composicin,
tiempo de exposicin y naturaleza del microorganismo. Un germicida muy diluido, por
ejemplo, puede inhibir slo el desarrollo de la bacteria en vez de destruirla (una especie
dada). Las sustancias indicadas por su poder destructivo son: fenol 1/100 para las
formas vegetativas, al 5% para matar esporas; plasyodine y solucin sulfocrmica.
MATERIALES.-
- Asas de siembra, pipetas, tubos de prueba, matraces y jeringas hipodrmicas.

- Mecheros de Bunsen, estuches de jeringas y cubetas aporcelanadas.
- Autoclave, horno Pasteur, estufa de aire caliente, centrfuga y equipo de filtracin.
- Estufas, incubadoras, bao mara y balanza elctrica de precisin y refrigeradora.
RESULTADOS.-
Tabla I: ACCION DE LOS IONES HIDROGENO
pH 3.0 pH 5.0 pH 7.0 pH 9.0 pH 11.0
Caldo nutricio
Extracto de malta
Tabla II: ACCION DE LOS COLORANTES
ESPECIES MICROBIANAS
COLORANTE DILUCION
E. coli B. subtilis St. aureus
CRISTAL 10-4
VIOLETA 10-5
10-6
Tabla III: ACCION OLIGODINAMICA DE LOS METALES
ACTIVIDAD DEL COBRE

E. coli
St. aureus
Prctica N17
Accin de los agentes antimicrobianos
El principio fundamental de la quimioterapia es la toxicidad selectiva. Los agentes

antibiticos (quimioterpicos y antibiticos) no actan directamente sobre el husped,
sino que se combinan qumicamente con determinados sistemas de los
microorganismos , enfocando as la accin sobre los microorganismos ms que sobre
el husped.
De acuerdo a su origen los antimicrobianos se denominan:
ANTIBIOTICO: Sustancia qumica que es producida por microorganismos vivos y que

tienen capacidad de inhibir el desarrollo de otros organismos vivientes que le son
sensibles.
QUIMIOTERAPICO: Es un compuesto qumico sinttico que acta en forma bactericida

o bacteriosttica sobre los microorganismos, inhibiendo una serie de funciones vitales.
ACCION DE LOS ANTIBIOTICOS:
- Inhibicin de sntesis de pared celular: por ej. Penicilina, Cefalosporina,

Bacitracina, Vancomicina, Ristocetina, Novobiocina, Cocloserina.
- Alteracin de permeabilidad de membrana celular: Anfotericina B, Colistina,
Nistatina, Polimixina.
- Inhibicin de sntesis proteica: Aminoglucsidos (Kanamicina, Tobramicina,
Amikacina, Estreptomicina), Tetraciclinas, Cloramfenicol, Macrlidos (Eritromicina,
Oleandomicina), Lincomicinas (Lincomicina, Clindamicina).
- Inhibicin de sntesis de cidos nucleicos: Acido Nalidxico, Novobiocina,
Pirimetamina, Sulfonamidas, Trimetropim, Rifampicina.
Qumicamente, los antibiticos se pueden clasificar en 3 grupos:

a) Derivados de aminocidos: Penicilinas, Cloramfenicol, Bacitracina, Polimixina,
Cicloserina.
b) Derivados del acetato: Tetraciclinas, Griseofulvina, Eritromicina y los polenos
conjugados.
c) Derivados de azcares (aminoglucsidos): Kanamicina, Estreptomicina,
Neomicina.
Relacin de algunos Antibiticos:

* PENICILINAS: grupo de compuestos semejantes con actividades y propiedades
ligeramente diferentes. Estructura: estn formadas por el ncleo de un anillo
TIAZOLIDINA unida a un anillo BETA-LACTAMICO, al cual se adhiere a su vez una
cadena lateral que determina algunas de las propiedades de las penicilinas.
Origen: se obtiene a partir de cultivos de Penicillium notatum, otras 22 especies del
mismo gnero y 7 de Aspergillus. Existen penicilinas naturales y sintticas, siendo las
ltimas ms eficaces
* ESTREPTOMICINA Y DIHIDROESTREPTOMICINA: se extraen de Acti-

nomicetales y Streptomyces.
* CLORAMFENICOL: se obtuvo inicialmente de Streptomyces venezuelae, en la

actualidad es el nico antibitico que se obtiene en gran escala por sntesis. Es de
amplio espectro.
* TETRACICLINAS: se conocen 3 miembros principales de esta familia de

antibiticos -Clorotetraciclina (Aureomicina), Oxitetraciclina (Terramicina) y Tetraciclina
(Acromicina)-. Origen: se obtienen de un Streptomyces. Tambin se prepara
sintticamente por reduccin cataltica de la Clorotetraciclina. Es de amplio espectro.
* ERITROMICINA: se obtiene a partir de un cultivo de Streptomyces erythraeus.
* BACITRACINA: se obtiene a partir de un cultivo de Bacillus polimyxa.
APLICACION DE LOS AGENTES QUIMIOTERAPICOS:

a) Para el tratamiento de enfermedades infecciosas.
b) Para la conservacin de alimentos.
c) Como complementos alimenticios de algunos animales.
RELACION DE ALGUNOS QUIMIOTERAPICOS:

* SULFONAMIDAS: compuestos procedentes de la ANILINA. Tienen accin sobre
microorganismos Gram(+). Las verdaderas sulfonamidas son aquellas que se parecen
estrechamente en su estructura molecular al Acido p-Aminobenzlico (PABA). Su accin
se debe al bloqueo de uno o ms sistemas enzimticos esenciales.
Acido p-aminobenzolico (PABA): metabolito esencial en muchas clulas vivas que

inhiben la accin de las sulfonamidas. Esta inhibicin es contrarrestada no slo por el
PABA, sino tambin por varios antagonistas secundarios, entre los que se encuentran
el cido flico (cido pteroilglutmico), metionina, serina, tiominas, purinas y otros. Se
ha localizado el punto de accin de las sulfonamidas en la conversin enzimtica del
PABA a cido flico (APG).
Derivados de las Sulfonamidas: Sulfadiazina, Sulfamerazina, Sulfadimetoxina,

Sulfametoxipiridazina.
Sulfonamida
PABA APG
APG coenzima
Aminocido
Timina
Vitamina B12
coenzima
metionina Purinas
serina
treonina
leucina
histidina
lisina
* ACIDO p-AMINOSALICILICO (PAS): es una de las ms eficaces drogas

antituberculosas. Se administra con antibiticos como la Isoniazida o la Estreptomicina.
Uno de los derivados ms eficaces es el Fenil-p-aminosaliclico.
* SULFONADIAMINODIFENIL (DDS): es una droga que se emplea para el

tratamiento de la lepra y no en la tuberculosis por su gran toxicidad.
RESISTENCIA A LOS ANTIMICROBIANOS
Existen muchos mecanismos que conducen a un microorganismos a ser resistente a los

antimicrobianos, ya sea porque producen enzimas tendientes a inactivar el antibitico o
cambiar su permeabilidad a ste por mutacin a nivel de protenas de membrana
(protena S-10 a nivel de biosntesis proteica). Estos mecanismos pueden ser de origen
gentico o no; en este caso la naturaleza puede ser cromosmica mediante mutaciones
(frecuencia 10-12) o extracromosmica mediante los elementos llamados PLASMIDOS,
que codifican los genes de resistencia a uno y/o ms antibiticos. Algunas veces parte
del plsmido R puede integrarse al cromosoma llevando algunos marcadores R,
haciendo difcil su reconocimiento gentico como tal an por anlisis moleculares. Estos
genes codifican las enzimas necesarias para inactivar, codificar o destruir a los
antimicrobianos, mediante adenilacin, acetilacin y fosforilacin, dependiendo de la
complejidad estructural del antibitico; as por ejemplo, los plsmidos codifican la
enzima acetiltransferasa que destruye el cloramfenicol, haciendo al microorganismos
resistente a dicho antibitico. El peligro de la resistencia extracromosmica de los
microorganismos inicialmente susceptibles, mediante los procesos de conjugacin,
transduccin y transformacin hacindolos resistentes.
El fenmeno se manifiesta principalmente en ambientes nosocomiales, dando origen al
surgimiento de cepas epidmicas que aparte de ser patgenas de etiologa conocida,
pueden adquirir este carcter los patgenos oportunistas que pueden ser causa de
brotes septicmicos.
DETERMINACION DE LA SENSIBILIDAD DE LOS MICROORGANISMOS A LOS

ANTIBIOTICOS Y QUIMIOTERAPICOS
I. METODO DE LOS DISCOS DE ANTIBIOTICOS (M. KIRBY-BAUER)
MATERIAL.-
1.- Cultivos de 18 hrs. de cepas de St. aureus y E. coli en caldo nutricio.

2.- Una placa de agar MUELLER-HINTON.
3.- Discos de antibiticos de diversas concentraciones, de acuerdo a la cepa que se
va a analizar.
4.- 2 pipetas graduadas de 1 ml.
5.- Esptula de Drigalsky o torunda estril.
6.- Asa de siembra, lpiz graso, mechero.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Depositar en las placas de Mueller Hinton 0.2 ml de los cultivos bacterianos de
18 hrs. de incubacin y extender el inculo por diseminacin con la esptula de
Drigalsky.
2.- Colocar aspticamente mediante una pinza, los discos de antibiticos y

quimioterpicos, sobre la superficie de la placa, procurando ubicarlas en forma
equidistante.
3.- Rotular datos; registrar la clave de los discos de antibiticos.
4.- Incubar los cultivos a 37C por 24 hrs.
RESULTADOS.-
El dimetro de las zonas de inhibicin producidas por los discos de antibiticos se miden
con una regla milimetrada que se coloca por debajo de la placa Petri. El lmite del rea
de inhibicin estar dada por la inhibicin completa del desarrollo, apreciable por el ojo.
En el caso de las sulfas y sus derivados se hace una excepcin, porque se puede
producir un desarrollo discreto de aspecto granular fino dentro del rea de inhibicin; en
estos casos, el lmite de la inhibicin estar dado por las zonas de crecimiento
abundante. En la realizacin del antibiograma, se debe tener especial cuidado en
emplear una cepa pura y no una mezcla de microorganismos
INTERPRETACION DEL ANTIBIOGRAMA: Los dimetros de inhibicin del crecimiento
(en cm) sern llevados a una tabla standard de sensibilidad para traducir la lectura en
trminos de SENSIBLES, MEDIANAMENTE SENSIBLES o RESISTENTES (Confrontar
sus resultados con el cuadro adjunto).
NOTA: No debe darse el resultado en trminos de mm de inhibicin ni de cruces.
II. METODO DE DILUCION DE ANTIBIOTICOS EN TUBOS: DETERMINACION

DE LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA (CMI)
MATERIAL.-
1.- Cultivo de 18 hrs. de incubacin: St. aureus y E. coli en caldo triptosa.

2.- Soluciones estandar de antibiticos en concentraciones decrecientes de
estreptomicina y Penicilina G.
3.- 6 tubos de 9 ml cada uno de BHI o Caldo Triptosa, a los que se adiciona
antibiticos para obtener las siguientes concentraciones. (tabla 1)
4.- 2 pipetas graduadas de 1 ml.
Tabla I
TUBO PENICILINA G (U.I./ml) ESTREPTOMICINA (g/ml)
T-1 1 000 000 400
T-2 500 000 200
T-3 250 000 100
T-4 125 000 50
T-5 62 500 25
T-6 Tubo control sin antibiticos Idem.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Sembrar una alcuota (0.1 ml) del cultivo de 18 hrs.

2.- Rotular e incubar a 37C por 24 hrs.
3.- Interpretar los resultados.
RESULTADOS E INTERPRETACIONES.-
La CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA (CMI) de un antibitico para un

microorganismos estar dado por la mxima dilucin del antibitico que acta inhibiendo
el crecimiento microbiano.
Para saber si las concentraciones del antibitico son bacteriostticas o bactericidas,
sembrar 2-3 asadas de los tubos con inhibicin de crecimiento a tubos con caldo nutricio
o Mueller Hinton. Incubar y anotar resultados.
DISCOS DE SENSIBILIDAD PROPUESTOS PARA USAR EN LOS ANTIBIOGRA-

MAS DE RUTINA EN LABORATORIOS CLINICOS
1. GRAM POSITIVOS 2. GRAM NEGATIVOS 3. ORINA-CULTIVOS

A. Cefalotina A. Ampicilina A. Ampicilina
B. Cloramfenicol B. Cefalotina B. Cefalotina
C. Eritromicina C. Cloramfenicol C. Cloramfenicol
D. Kanamicina D. Colistn D. Colistn
E. Lincomicina E. Kanamicina E. Doxiclina
F. Meticilina F. Neomicina F. Kanamicina
G. Neomicina G. Nitrofurantona (orina G. Ac. Nalidxico
solamente)
H. Penicilina G H. Sulfas H. Nitrofurantona
I. Estreptomicina I. Estreptomicina I. Penicilina G
J. Tetraciclina J. Tetraciclina J. Estreptomicina
K. Opcional: K. Opcional: K. Sulfametoxazol
Vancomicina Penicilina G L. Tetraciclina
Gentamicina Doxiclina
Doxiclina L. Opcional:
L. IDEM K Ac. Nalidxico
Gentamicina
Polimixina B
NOTA: Las concentraciones de los discos se especifican en la tabla de intepretacin de los halos o zonas
de inhibicin, publicadas por KIRBY, BAUER y col. que se reproduce ms adelante. El empleo de 12 discos
de concentracin alta en una placa Petri requiere de una colocacin cuidadosa de los mismos para evitar
superposiciones de los diversos halos de inhibicin.
Cuestionario
1.- Son los antibiticos eficaces contra las infecciones virales?
2.- Existe alguna relacin entre el dimetro del halo y la composicin qumica del
antibitico?
3.- Mencione los niveles de accin de los antibiticos empleados en prctica.
4.- Qu significa un antibitico de amplio espectro?

TEST DE SENSIBILIDAD DE LOS MICROORGANISMOS A LOS ANTIBIOTICOS:

METODO DEL DISCO DIFUSION
DIAMETROS STANDARD DE LAS ZONAS DE INHIBICION (mm) PARA LA

INTERPRETACION DE LA SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS
ANTIBIOTICO O GRAM CONCENTRACION (A) (B) (C)

QUIMIOTERAPICO DEL DISCO (g)
Penicilina (+) 10 6-20 21-28 29- +
Ampicilina (+)(-) 10 6-20 21-28 29- +
Bacitracina (+) 10 6-8 9-12 13- +
Cefaleridina 30 6-11 12-15 16- +
Cefalotina (-) 30 6-14 15-17 18- +
Cloramfenicol (+)(-) 30 6-12 13-17 18- +
Colistina (-) 10 6-8 9-10 11- +
Eritromicina (+) 15 6-14 15-18 19- +
Gentamicina(1) (+)(-) 10 - - 18- +
Kanamicina (+)(-) 30 6-13 14-17 18- +
Meticilina (+) 5 6-9 10-13 14- +
Ac. Nalidxico(2) (+)(-) 30 6-13 14-17 18- +
Neomicina (+)(-) 30 6-12 13-16 17- +
Nitrofurantona(2) (+)(-) 3,000 6-8 9-12 13- +
Penicilina G (a) (-) 10 6-20 21-28 29- +
Penicilina G (b) 10 6-11 12-28 29- +
Cloxacilina (ox) (+) 10 6-10 11-13 14- +
Dicloxacilina (dx) (+) 10 6-11 12-21 22- +
Polimixina B (+) 30 6-11 10-11 12- +
Estreptomicina(2) (+) 10 6-11 12-14 15- +
Sulfonamidas(3) (+)(-) 3,000 6-12 13-16 17- +
Tetraciclinas (+)(-) 30 6-14 15-18 19- +
Vancomicina 30 6-9 10-11 12- +
NOTA: (A),(B),(C) = Dimetro del halo de inhibicin (mm).

(A) = Resistente, (B) = Intermedio, (C) = Sensible
Penicilina G: (a) Contra Staphylococcus

(b) Contra otros microorganismos
(1) = Normas provisionales

(2) = Empleados slo para las infecciones de la vas urinarias
(3) = Vlidos para cualquiera de las sulfonamidas de 250-300 g.
Prctica N 18
Condiciones para el cultivo de hongos
_____________________________________________________________________
Los hongos viven a expensas de la materia orgnica. La mayora son saprofitos,

algunos pueden actuar como alergenos y ocasionar sensibilizacin. Estos hongos
pueden producir infecciones secundarias en pacientes con inmunodeficiencias,
infecciones crnicas o diabetes. Desarrollan con gran facilidad en los medios de cultivo.
Para su crecimiento necesitan de una fuente proteica, carbohidratos y condiciones de
humedad adems de pH cido.
Las caractersticas morfolgicas ms representativas de los mucorales son su

rpido crecimiento y su micelio carente de septos, aunque stos pueden estar presentes
en hifas frtiles y en el micelio vegetativo de cultivos viejos. Estos hongos generalmente
slo desarrollan esporas asexuales (esporangiosporas) a partir de hifas frtiles
(esporangiforos), ramificadas o no, en el interior de una especie de vesculas
(esporangios ), consistentes en un ensanchamiento apical del esporangiforo. Otras
estructuras con valor diagnstico son la columela (prolongacin estril, a menudo
hinchada, del esporangiforo dentro del esporangio),la apfisis (ligero hinchamiento en
la parte apical del esporangiforo, por debajo del esporangio), los rizoides (estructura
semejante a una raz) y los estolones (hifas areas, no ramificadas, que conectan los
rizoides). El estudio de dichas estructuras es til para diferenciar los gneros ms
frecuentes en clnica, tales como Absidia, Rhizopus y Saksenaea.
La identificacin de gnero en los mucorales puede llevarse a cabo a partir de

los cultivos primarios de las muestras clnicas sobre Agar Sabouraud Dextrosa ( ASD).
Sin embargo, para la identificacin de la especie se requiere el uso de medios de
cultivo ms especficos tales como agar glucosado de patata (PDA) o agar extracto de
malta (MEA), incubando en la oscuridad a 25 y a 35 C, ya que hay especies que son
termfilas.
Materiales:
Cultivo de Penicillium, Aspergillus, Fusarium y Rhizopus en agar Sabouraud
Microcultivos en lmina de cada una de los hongos en estudio.
Cultivo de Rhodotorula en medio Sabouraud.
Procedimiento:
Estudiar las caractersticas macroscpicas de las colonias (aspecto, color,

consistencia, pigmento difundido etc ).
Observar en los microcultivos la caracterstica de los micelios, conidias y

conidiforos.
Resultados:
: colonias pulverulentas de color azul verdoso. Hifas tabicadas con

conidiforos ramificados en su extremo distal con la apariencia de pincel y conidias
dispuestas en cadena.
: colonias filamentosas de color blanco, amarillo, verde, marrn o
negro.Hifas tabicadas con ensanchamiento en su extremo distal que da origen
a esterigmas de donde nacen las conidias en cadena.
: colonias algodonosas de color rosado. Hifas tabicadas que dan origen a
conidiforos y macroconidias multiseptadas fusiformes , curvadas.
: colonias algodonosas blanco grisceas con puntos negros

(esporangios) Hifas no septadas agrupadas como races, a partir de las cuales se
proyectan filamentos largos (esporangiforo) formando en su extremo una estructura
redonda oscura que contiene gran cantidad de esporas.
: colonias cremosas de color rosado. Al microscopio se observan clulas

ovoides o redondas.
Esporangiosporas
Esporangios con columela
Micelio
cenocti
Zigosporas Esporangiforo
Penicillium sp Aspergillus sp
Alternaria sp. Cladosporium sp.

PRCTICA N19: AISLAMIENTO DE CIDOS NUCLEICOS

MICROBIANOS
OBJETIVOS
Familiarizar al alumno con la metodologa de obtencin de los cidos nuclicos.

Caracterizar los cidos nuclicos obtenidos de acuerdo a algunas propiedades
fisicoqumicas.
INTRODUCCIN
Un primer paso para cualquier estudio que involucre el uso de una molcula de ADN o
ARN es su extraccin y purificacin a partir de una clula manteniendo intacta su estructura
y evitando su contaminacin con otro tipo de molculas orgnicas de la clula.
En el presente trabajo prctico vamos a ensayar una metodologa para cumplir con tal
fin, tanto para el caso del ADN como RNA.
Aislamiento de ADN bacteriano

Clulas bacterianas se lavan con solucin salina y luego se lisan con lisozima y SDS.
Las protenas se eliminan con pronasa agregando cloroformo combinado con alcohol
isoamlico al 4%. Se separa la fase acuosa (que contiene los cidos nucleicos) por
centrifugacin a 10 000 rpm durante 10 minutos. A partir de la fase acuosa se obtiene por
precipitacin con etanol 96% fro los cidos nucleicos. Estos se recogen por enroscamiento
en una varilla para luego disolverlos en solucin salina. El ARN presente se digiere con
RNasa pancretica. Seguidamente se agita con igual volumen de cloroformo combinado
con alcohol isoamlico al 4%; se separa la fase acuosa por centrifugacin a 10 000 rpm
durante 10 minutos y se separa el ADN por precipitacin con etanol al 96% en fro.
MATERIAL
Centrfuga
Espectrofotmetro UV
Extracto de levadura
Peptona de carne
Cloruro de sodio
Glucosa
Lisozima
Sulfato Dodecil de Sodio (SDS)
Pronasa
Cloroformo
Alcohol isoamlico
Etanol absoluto
Ribonucleasa pancretica
Solucin Salina Citratada (SSC)
Cepa: Bacillus subtilis PB-19
PROCEDIMIENTO
Da 1:
1. Cultivar la cepa en 200 ml de caldo Luria con glucosa al 0.5% a 37C durante 15-18
hrs.
Da 2:
1. Centrifugar el cultivo a 4 500 rpm durante 10 min (a 4C), eliminar el sobrenadante y

resuspender las clulas en solucin salina citrada (SSC). Repetir este paso dos veces.
2. Resuspender las clulas en 5 ml de SSC, lo cual representa 1/20 del volumen original.
3. Lisar las clulas con 0.124 ml de lisozima. Este volumen debe alcanzar una
concentracin final de 1 mg/ml.
4. Incubar durante 30 min. a 37C.
5. Agregar 1.2 ml de Sodio Dodecil Sulfato. Este volumen debe alcanzar una
concentracin final de 1 mg/ml. Incubar durante 10 min. a temperatura ambiente.
6. Eliminar protenas agregando 0.1 ml de pronasa diluida en SSC (que alcance una
concentracin final 1 mg/ml). Incubar durante 2 horas a 37C.
7. Agregar cloroformo y alcohol isoamlico al 4% en proporcin 1:1. Agitar durante 20 min.
8. Separar la fase acuosa que contiene los cidos nucleicos, mediante centrifugacin a 4
500 rpm durante 10 min (T = 4C).
9. Precipitar la fase acuosa agregando 4 volmenes de etanol 95% fro.
10. Recoger los cidos nucleicos por enroscamiento en varilla de vidrio.
11. Disolver los cidos nucleicos extrados en 5 ml de SCC.
12. Digerir el ARN presente con ribonucleasa pancretica, a una concentracin de 50 mg/-
ml.
13. Incubar durante una hora a 37C.
14. Agitar con una solucin 1:1 de cloroformo y alcohol isoamlico al 4%.
15. Separar la fase acuosa por centrifugacin (4 500 rpm por 10 minutos a 4C).
16. Agregar 4 volmenes de etanol absoluto fro a la fase acuosa (sobrenadante) y dejar
precipitando.
Da 3:
1. Redisolver el ADN en SSC

2. Purificar el ADN mediante precipitaciones sucesivas con etanol 95% en fro y
redisoluciones en SSC, tal como se indica en el paso 16 del da 2.
Para el aislamiento de plsmidos
1. Se cogen 1,5 mL (2 x 750 l) de un cultivo estacionario de una bacteria portadora de un

plsmido con un gen de resistencia a un antibitico. Este cultivo se creci durante toda la
noche a 37C en medio con antibitico.
2. Se dispensan en un tubo eppendorf (previamente marcado) y se centrifuga a

temperatura ambiente, durante 3 min a 12.000 g.
3. Se retira el sobrenadante (2 x 750 l) con mucho cuidado (punta azul dentro de punta
amarilla) y se descarta.
4. Se da un pulso de centrfuga, se retira cuidadosamente el sobrenadante que an quede

(punta amarilla dentro de punta blanca) y se tira. Nos quedamos con el precipitado de las
bacterias.
Lisis alcalina
5. Se resuspende (agitando vigorosamente) el sedimento de bacterias en 100 l de una

solucin isotnica (GTE: Glucosa, Tris y EDTA) a 4C. Se deja a temperatura ambiente
durante 5 min.
6. Se aaden al mismo tubo, 200 l de la solucin de lisis (NaOH, SDS) que est a
temperatura ambiente y recin preparada. Se agita suavemente con la mano por inversin
del tubo (unas 10 veces). Se incuba 5 min a 4C.
Neutralizacin
7. Se aaden al mismo tubo, 150 l de la solucin de neutralizacin (acetato potsico 3M,

pH 4,8). Se agita con la mano por inversin del tubo (unas 10 veces). Se incuba 5 min a
4C.
Extraccin de los plsmidos
1. Los agregados macromoleculares se precipitan por centrifugacin (15 min a

12.000 g y 4C), formndose un sedimento blanco de aspecto lechoso. El tubo
se traslada con cuidado a la mesa de trabajo.
2. Se retira (2 x 200 l) con cuidado el sobrenadante con el DNA plasmdico y se

dispensa en un tubo limpio (previamente marcado).
3. Se aade 1 ml de etanol absoluto (4C) al tubo en el que hemos puesto la

solucin con el DNA plasmdico. Se mezcla con la mano por inversin del tubo
(unas 10 veces). Se incuba 15 min a 4C.
4. Se precipitan los plsmidos por centrifugacin (15 min a 12.000 g y 4C), se

retira (2 x 750 l) cuidadosamente el sobrenadante (punta azul dentro de
punta amarilla) y se tira.
5. Se aaden al mismo tubo, 900 l de etanol al 70% (4C). Se mezcla

suavemente con la mano por inversin del tubo (unas 10 veces).
6. Se vuelven a precipitar los plsmidos por centrifugacin (10 min a 12.000 g y

4C), se retira cuidadosamente el sobrenadante (punta azul dentro de punta
amarilla) y se tira.
7. Se da un pulso de centrfuga, se retira cuidadosamente el sobrenadante que

an quede (punta amarilla dentro de punta blanca) y se tira. Nos quedamos
con el precipitado de los plsmidos.
8. Se disuelve el precipitado de los plsmidos (aspirando y soltando el lquido

varias veces con ayuda de la micropipeta) en 50 l de tampn TE (pH 8,0),
con ribonucleasa A.
9. Se incuba a temperatura ambiente 5 min. Mantener la muestra a 4C
Determinacin de cidos nucleicos por absorcin de luz ultravioleta

Todos los cidos nucleicos tienen una fuerte banda de absorcin en la regin de luz
ultravioleta con un mximo a 260 nm y un mnimo aproximadamente a 230 nm. Su pico
de absorcin es usualmente designado en trminos de su valor Ep definido como la
densidad ptica en 1 cm de profundidad de una solucin que contiene un tomo gramo de
fsforo de cido nucleico por litro.
Es conveniente, sin embargo tener presente que la conversin de los valores de
densidad ptica a cantidades de cidos nucleicos est sujeta a error que puede derivarse
de la variacin en la composicin de bases, en el efecto hipercrmico y la contaminacin
con productos de la degradacin proteica.
Un esquema simplificado de la extraccin de ADN bacteriano total

PRCTICA N20: TRANSFORMACIN BACTERIANA

OBJETIVOS
Comprobar la naturaleza transformante del ADN.

Ensayar una tcnica de recombinacin gentica.
Proporcionar al estudiante la base para una posterior aplicacin de la tecnologa
del DNA recombinante.
INTRODUCCIN
La transformacin es un proceso de transferencia gentica poco especializado y

posiblemente el ms primitivo en el proceso evolutivo. Este mecanismo involucra la
permeabilidad a material gentico libre por parte de la clula receptora, quien debe estar
bajo un estado especial que se denomina estado de competencia.
La transformacin puede darse con y sin recombinacin, dependiendo del tipo de ADN
exgeno. Eventos mediados por el gen RecA, acoplados con la migracin de la hebra de
replicacin y reparacin de las zonas mal apareadas; constituyen los mecanismos de
recombinacin cuando el ADN exgeno es cromosomal. En cambio cuando ste es de
naturaleza plasmdica el mecanismo puede o no involucrar una recombinacin.
MATERIAL
Cepa : E.coli BL 21
Centrfuga refrigerada, medios de cultivo, agitador.
PROCEDIMIENTO
A.- EXTRACCIN DE ADN PLASMIDICO:

Se utilizar el ADN aislado en la prctica anterior.
B.- OBTENCIN DE CLULAS COMPETENTES:

1. Sembrar por agotamiento 1 colonia de la cepa deseada en una placa con agar Luria
sin antibitico.Hacer una siembra en placa con antibitico para asegurarnos que la cepa
no contiene ningn plsmido.
2. Pasar una colonia a 2 mL de medio LB e incubar a 37C con agitacin toda la noche.
3. Tomar 1 mL del cultivo e inocular 50 mL de medio LB sin antibitico en un erlenmeyer
de 250 mL e incubar a 37C con agitacin hasta D.O600: 0.35 a 0.45 ( aprox.en 2 h)
4. Incubar en hielo por 10 min
5. Centrifugar a 4000 rpm y 4C DURANTE 10 MIN. Descartar El sobrenadante.
6. Agregar 20 mL de CaCl2 0.1M y homogenizar. Incubar 15 min en hielo.
7. Centrifugar a 3000 rpm y 4C DURANTE 10 MIN. Descartar el sobrenadante.
8. Agregar 1 mL de Buffer de transformacin , 15% glicerol frio y homogenizar
9. Alicuotar en fracciones de 50 L en tubos eppendorf en hielo seco mas alcohol.
Notas:
Es importantsimo mantener la cadena de frio

Todos los materiales tienen que ser esteriles y deben ser pre-enfriados antes de
utilizar
TRANSFORMACION CON PLASMIDOS CIRCULARES
1. Sacar los eppendorf con clulas competentes de la congeladora y ponerlos en

abundante hielo. Dejar 10 min que descongelen.
2. Tomar 2 L de la solucin de plsmido y mezclar con golpes, suavemente.
3. Dejar en hielo por 30 min.
4. Incubar a 42C por 45 segundos. Dejar en hielo por 2 min.
5. Agregar 1 mL de caldo LB e incubar a 37 C en agitacin por 1 hora.
6. Sembrar 50 L en placas con agar LB mas Kanamicina ( 40 g/mL) mas X-gal (40
g/mL), con una esptula de Drigalsky estril.
7. Incubar al menos 18 horas a 37C.
Es recomendable agregar un control posistivo, es decir hacer una transformacin

con 50ng de plsmido y si es posible un control negativo ( sin plasmido) para
verifivcar la presencia de contaminantes
RESULTADOS:
Calcular la eficiencia de transformacin de acuerdo a:
Et = N de colonias transformantes
Cantidad de DNA plasmdico
Prctica N21
Virologa: Sistemas de propagacin viral.
Efecto citoptico.
OBJETIVOS.-
Emplear diferentes sistemas biolgicos para el cultivo de virus.

Reconocer la actividad viral mediante la transformacin de lneas celulares.
Los VIRUS son los agentes infecciosos ms pequeos (20 a 300 nm de dimetro)
que contienen una molcula de cido nucleico (RNA o DNA) como genoma. Son
parsitos intracelulares obligados y no pueden replicarse en un medio libre de clulas.
Algunos virus son bastante exigentes y no han podido ser cultivados bajo condiciones
de laboratorio, pero la gran mayora puede crecer en cultivo de clulas, huevos
embrionados o animales de laboratorio.
Un cultivo celular se consigue a partir de un tejido disociado en una suspensin de
clulas o pequeos racimos por agitacin mecnica seguido por un tratamiento con
enzimas proteolticas. Luego las clulas son lavadas y contadas, diluidas en el medio y
colocadas sobre la superficie de tubos de vidrio o placas plsticas.
El uso de huevos embrionados de gallina presenta, frente a ciertos agentes virales, una
susceptibilidad mayor que los animales de laboratorio ms comunes, de all que se los
utilice para el aislamiento de algunos virus. Sin embargo, para que los huevos
embrionados proporcionen las condiciones ptimas de multiplicacin, es necesario tener
en cuenta ciertas condiciones; por ejemplo, la edad del embrin, la temperatura de
incubacin, el tiempo de incubacin y la va de inoculacin, segn el virus a inocular.
El huevo embrionado, debe reunir las siguientes condiciones:

Que la cscara del huevo no tenga rajaduras, ni zonas frgiles.
El tiempo del embrin debe ser de 711 das.
Que contenga un embrin vivo, con un desarrollo normal.
Que el embrin no est pegado sobre las paredes (que se vea movilidad)
Que el saco de aire se encuentre sobre uno de los extremos.
Los huevos que no cumplen con estos requisitos deben ser descartados; el resto debe
mantenerse a 37 C en atmsfera hmeda (40 70 %) hasta el momento de su
inoculacin. La temperatura ptima para el desarrollo del virus de Influenza es de 34 C
en atmsfera hmeda.
Los embriones de pollo se utilizan tambin para obtener grandes cantidades de virus;
pudindose inocular en sus diferentes estructuras dependiendo del propsito del
estudio. Por ejemplo, la MEMBRANA CORIALANTOIDEA se selecciona casi siempre
como sitio de inoculacin para TITULACION DE VIRUS; para investigar la
MORFOLOGIA VIRAL o para la IDENTIFICACION DE VIRUS. Cuando se requiere de
grandes cantidades de virus para la PRODUCCION DE VACUNAS o para ESTUDIOS
QUIMICOS se utiliza el SACO ALANTOIDEO. Las inoculaciones en el SACO VITELINO
y el SACO AMNIOTICO sirven para AISLAR DIFERENTES AGENTES VIRALES.
EFECTO CITOPATICO
El crecimiento de muchos virus en un cultivo celular puede seguir por procedimientos

indicativos del incremento de macromolculas virales y viriones.
Muchos virus matan la clula donde se multiplican de modo que las monocapas
infectadas desarrollan evidencias del dao celular, estos cambios son conocidos como
EFECTO CITOPATICO (CPE) y los virus responsables se llaman VIRUS
CITOPATOGENICOS. Un observador entrenado puede distinguir varios tipos de CPE
en cultivos vivos, pero es necesario fijar y colocar la monocapa para ver detalles como:
cuerpos de inclusin y sincitios, que tienen gran valor diagnstico.
MATERIALES.-
1.- 1 embrin de pollo de 10-12 dias de edad.

2.- 1 ovoscopio.
3.- 1 tubo con cultivo de clulas.
4.- 1 tubo con cultivo de clulas mas virus.
PROCEDIMIENTO.-
I. EN EMBRIONES DE POLLO
1.- Utilizar el ovoscopio para observar el huevo embrionado localizando la cmara

de aire y el ojo del embrin.
2.- Desinfectar el huevo y hacer una perforacin encima de la cmara de aire.
3.- Inocular un colorante (Fucsina) en la membrana corialantoidea y otro (azul de
metileno) a la cavidad amnitica.
4.- Identificar las diferentes estructuras del embrin de pollo.
tica Va alantoidea
II. EN LINEA CELULAR
Monocapa con Efecto citoptico: sincicio
Observar al microscopio de luz (10X) la morfologa de una LINEA CELULAR sin inocular
y en otro tubo el EFECTO CITOPATICO en la LINEA CELULAR inoculada.
Observar y anotar los resultados.
Cuestionario
1.- Cules son los efectos citopticos observados en prctica?
2.- Diferencie entre linea celular primaria y secundaria

Prctica N22
Formacin de placas de lisis
Objetivos:
Conocer la importancia del estudio de los bacterifagos.

Reconocer los diferentes tipos que las placas de lisis pueden presentar.
La capacidad de los bacterifagos de parasitar bacterias tiene importancia en forma

particular debido a que estos virus respetan, hasta lo conocido hoy, las fronteras de la
especie y en el peor de los casos, el gnero. Esta especificidad ha sido aprovechada
por aos para el estudio de los hospederos particulares de cada bacterifago,
permitiendo importantes avances en la gentica y la ecologa de muchos microorga-
nismos, especialmente E. coli, Bacillus subtilis y Vibrio cholerae, entre otros.
Quizs la propiedad ms notoria que podemos atribuir a los bacterifagos es la
capacidad que estos tienen para lisar las bacterias, existiendo, claro est, excepciones.
Esta lisis representa en s la ltima fase de la multiplicacin de los fagos y trae como
consecuencia la liberacin de una nueva progenie de bacterifagos que son capaces de
infectar bacterias vecinas.
El fenmeno ltico se convierte, por lo tanto, en una herramienta muy til para poner
en evidencia la presencia de este tipo de virus en una muestra y de acuerdo a sus
caractersticas, poder determinar si un microorganismo est siendo afectado por un solo
tipo de bacterifago o por ms de uno.
Los mtodos ms usuales para conseguir lisis bacteriana por bacterifagos, son en
general, dos: aquellos que se llevan a cabo en medio lquido, evidenciados por la
disminucin de la turbiedad de los cultivos, y los que se realizan en medio slido,
observndose la formacin de zonas claras o placas de lisis en los puntos infectados.
Estas placas de lisis, conocidas tambin con el nombre de "calvas", segn su nmero,
forma y dimensiones, van a permitir cuantificar y calificar los bacterifagos presentes en
una muestra. Al mismo tiempo, es posible a partir de estas placas aislar y concentrar a
los bacterifagos presentes.
En la presente prctica, se observarn placas de lisis obtenidas mediante la tcnica
conocida como bicapa de agar, formadas a partir de una muestra de agua de regado
frente a un cultivo de E. coli.
MATERIAL.-
- Placas Petri con un cultivo de E.coli, conteniendo placas de lisis.
PROCEDIMIENTO.-
1.- Observar los cultivos en busca de zonas claras y circulares.

2.- Describir la forma y dimensiones de la placas de lisis formadas en el cultivo.
3.- Contar las placas de lisis y calcular el nmero de bacterifagos presentes en la
muestra.
4.- Anotar sus observaciones.
RESULTADOS.-
Las placas de lisis se muestran como zonas claras, de forma circular, acusando diversos
dimetros en algunos casos. Segn su forma y disposicin, la lisis puede ser
denominada: LISIS TOTAL, LISIS CONFLUENTE, LISIS SEMICONFLUENTE.
Micrografa electrnica del bacterifago T 4
Placas de lisis
Cuestionario
1.- Esquematice las observaciones respecto a la actividad de bacterifagos.

2.- De qu factores depende el tipo de lisis ?
3.- Los bacterifagos pueden ser usados en Biotecnologa?
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.-
ACKERMANN, H. et al. 1984. Classification of Vibrio bacteriophages.

Intervirology 22:61-71.
BROCK, T. 1991. Microbiologa. 2da. ed. Prentice Hall Hispanoamericana.

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COHA, J. et al. 1990. Manual de Prcticas de Laboratorio de Microbiologa

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CRUICKSHANK, R. 1975. Medical Microbiology. 12a. ed. Vol II. Longman

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GUTIERREZ,S. y Merino, F. 2009. Manual de Prcticas de Microbiologa

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Prctica N1

Bioseguridad en el laboratorio de Microbiologa

Conocer las normas fundamentales para prevenir accidentes y enfermedades en

RIESGOS DEL LABORATORIO

El riesgo biolgico se clasifica en grupos de acuerdo al tipo de microorganismos que se

Escaso riesgo individual y comunitario. Microorganismos con pocas probabilidades de

TIPO DE LABORATORIO: Bsico. Laboratorio de Enseanzas en Universidades.

Microorganismos: Bacillus subtilis

Riesgo individual moderado y comunitario moderado.Agente patgeno que puede

TIPO DE LABORATORIO: Bsico. Cmaras de seguridad biolgica, dispositivos de

Microorganismos: Salmonella typhi

GRUPO DE RIESGO III

Riesgo individual elevado y riesgo comunitario escaso.

TIPO DE LABORATORIO: Contencin. Laboratorios de diagnstico especializado.

Elevado riesgo individual y comunitario.

TIPO DE LABORATORIO Contencin mxima Requiere Cabina seguridad Clase II.

Microorganismos : Virus Hanta

Material de bioseguridad recomendado

Dispositivos manuales de pipeteo, para no utilizar la boca.

Decontaminacin y eliminacin de desechos

La decontaminacin y la eliminacin de desechos son operaciones de laboratorio

Si no se dispone de este elemento, se puede recurrir a los siguientes mtodos:

Ebullicin en agua que contenga bicarbonato.

Empleo de una olla a presin al nivel mximo de presin de trabajo.

Hay que establecer un sistema de identificacin y separacin de material contaminado:

Desechos no contaminados que pueden eliminarse con la basura.

Objetos aguzados y cortantes.

Material contaminado para tratamiento en autoclave y reutilizacin.

Material contaminado para eliminacin.

La inhalacin excesiva de vapores de solvente puede tener efectos txicos como

Seguridad qumica, elctrica, radiolgica y proteccin contra incendios

Observe el laboratorio donde efectuar las prcticas de Microbiologa y determine el tipo

Uso de lquidos inflamables

Derrame de un cultivo bacteriano sobre la

Eliminacin de desechos, contaminados

Pincharse con aguja de extraccin de sangre

Esquema de cabinas de Seguridad Biolgica de Tipo II

- Familiarizar al alumno con el material de vidrio y de otra naturaleza de uso

Aparte del instrumental y variado equipo que se requiere en todo laboratorio de

1.- TUBOS DE PRUEBA:

Condiciones.- Que sean de paredes gruesas, bien equilibrados, de preferencia

Medidas.- de 16 x 150 mm y 15 x 125 mm para cultivos microbianos puros y para

De vidrio: Pueden ser de varias medidas, desde 10

2.- CAPSULAS O PLACAS DE PETRI:

4.- PIPETAS PASTEUR: Confeccionadas de varillas de vidrio de 4mm de dimetro

5.- MATRACES y BALONES: Recipientes volumtricos de gran utilidad para la

6.- ESPATULAS DRIGALSKY: Se confeccionan a partir de varillas de vidrio

8.- VARILLAS DE VIDRIO MACIZO: fragmentos de 30 a 60 cm, que sirven para la

9.- BEAKER o VASOS DE PRECIPITACION: Recipientes cilndricos de amplia

10.- FRASCOS VIALES PARA HEMOCULTIVOS, VACUNAS, CULTIVOS DE

II. MATERIAL DE OTRA NATURALEZA

La lista tambin es enorme; mencionaremos los que ms se utilizan:

1.- MANGOS DE KOHLE: Vstagos de metal con su cubierta de ebonita aislante

2.- ESPATULAS DE METAL CON MANGOS DE MADERA: De preferencia de

3.- MECHEROS DE BUNSEN: Imprescindibles en Microbiologa. Son de metal con

4.- CANASTILLAS O CESTOS DE METAL: Las mejores son de aluminio.

5.- SOPORTES UNIVERSALES: Con tenazas y aros de metal, para asegurar

6.- RECIPIENTES DE POLIETILENO o DE METAL: Cilndricos con bases

PREPARACION PARA SU ESTERILIZACION - LIMPIEZA

1.- Los recipientes con cultivos descartados o contaminados, se deben

* Elegir la mesa de trabajo, de preferencia cercana al equipo de esterilizacin.

* Colocar sobre la mesa y en forma ordenada todo el equipo a prepararse: matraces,

III. EQUIPO DE LABORATORIO