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Interaccin entre lfito'cromosy criptocromos en el control del crecimiento
phyA
phyB
ay] cry2
Universidad de Buenos Aires
1. INTRODUCCIN
1.2.2.1 Criptocromos 27
l .2.2.2 Fototropina 28
1.4 OBJETIVOS 32
2. MATERIALES Y MTODOS
RESULTADOS
DISCUSIN 70
luz y la temperatura.
4.4 Mecanismos moleculares de las interacciones 80
4.5 Signicado ecolgico de las interacciones 81
4.6 Conclusiones 84
5. BIBLIOGRAFA 86
RESUMEN
La luz provee a las plantas la energa necesaria para la fotosntesis e informacin sobre el ambiente.
Las seales lumnicas son percibidas por fotorreceptores especcos. En Arabidopsix thaliana se identicaron
y clonaron tres grupos de fotorreceptores: los tocromos que son fotorreceptores de de luz roja (R) y roja
lejana (RL), que son codicados por cinco genes (PH YA,PH YB,PH YC,PH YD,PH YE); los criptocromos
que son fotorreceptores de luz azul, codicados por dos genes (CR YI y CRl2) y las fototropinas. Los
tocromos y criptocromos tienen funciones independientes y coordinadas que regulan el desarrollo de las
plantas durante todo el ciclo de vida.
El objetivo de esta tesis es estudiar la interaccin entre tocromos (especcamente phyA y phyB ) y
criptocromos (cryl y cry2) en distintas respuestas durante el desarrollo de Arabidopsis thalana. Para cumplir
este objetivo hemos obtenido los dobles, triples y cudruple mutantes a partir de los simples mutantes de
phyA, phyB, cry] y cry2 para analizar el efecto de un fotorreceptor en ausencia/presencia de los dems
fotorreceptores.
El uso de los simples, dobles, triples, y cuadruple mutantes permiti revelar nuevas interacciones
entre los fotorreceptores e identicar funciones no conocidas de los mismos. En plntulas etioladas expuestas
a luz R, el phyA mostr un efecto dual. Cuando el phyA fue activado con bajos ujos de luz R produjo por un
lado la inhibicin del alargamiento del hipocotlo, y por otro lado, redujo la inhibicin del alargamiento del
hipocotlo mediado por el phyB, es decir que el phyA interactu antogonsticamente con el phyB. En nuestras
condiciones, el phyA retras la transicin del estado vegetativo al reproductivo, slo en determinados
contextos genticos: cry], cry2 y CIy cry2, poniendo en evidencia un nuevo rol del phyA en el control de la
oracin. El phyB y el cryl fueron redundantes en la represin del alargamiento del entrenudo, y la ausencia
de ambos permiti demostrar que el alargamiento del tallo no est obligadamente acoplado al desarrollo
reproductivo. La redundancia entre phyB y cryl, sin embargo, fue condicional a la temperatura. En la
inhibicin del alargamiento del hipocotlo, el phyB y el cryl interactuaron sinergsticamente. La interaccin
del phyB y el cryl en sta respuesta fue condicional al ambiente lumnico. En la mayora de las respuestas el
cry2 fue redundante con el cryl. La interaccin del cry2 con phyA y phyB en las distintas respuestas durante
el desarrollo puede dividirse en dos patrones, en el primero la actividad del cry2 requiri la presencia de phyA
y phyB (efecto sinrgico), y en el segundo requiri la ausencia de phyA y phyB (efecto redundante). El
anlisis del comportamiento del cudruple mutante phyA phyB cry] cry2 mostr que la deficiencia en la
percepcin de luz durante el desarrollo no est restringida slo a la des-etiolacin sino que contina incluso
hasta al estado adulto. Basados en los datos de esta tesis y de la literatura presentamos un modelo de los
patrones de interaccin para dos procesos: des-etiolacin y floracin.
Las interacciones observadas en condiciones de radiacin natural entre los fotorreceptores reejan
aquellas observadas en condiciones controladas. La compleja red de interacciones entre tocromos y
criptocromos en condiciones de radiacin natural gener homeostasis en la des-etiolacin contra los cambios
en irradiancia y fotoperodo que no forman parte de la seales relacionadas con la posicin del vstago por
debajo o por encima de la supercie del suelo.
El phyA, phyB, cryl y cry2, se acoplan con diferentes jerarquas durante el desarrollo de
Arabidopsis. La dependencia o redundancia entre las vas es afectada por las condiciones ambientales, el
estado ontognico y el contexto gentico. La redundancia entre los fotorreceptores en el control de los
procesos del desarrollo genera estabilidad del fenotipo que evita caer en patrones aberrantes, mientras que las
jerarquas entre los fotorreceptores permite un patrn especco de crecimiento y desarrollo bajo seales
lumnicas particulares.
Light provides plants not only the energy necessary for photosynthesis but also information about
the environment. Light signals are perceived by specic photoreceptors. In Arabidopsis thalana three
groups of photoreceptors have been identied and cloned: phytochromes,that are red - far-red light
photoreceptors encoded by ve genes (PH YA, PH YB,PH YC,PHYDand PH YE);cryptochromes, that are
blue light photoreceptors encoded by two genes (CR YI and CRYZ);and phototropin. Phytochromes and
cryptochromes have independent and coordinated functions that control plant development throughout all
the life cycle.
The aim of this thesis is to study the interactions between phytochromes (specically phyA and
phyB) and cryptochromes (cryl and cry2) in the control of Arabidopsis thalana development. For this
propose we have obtained all the double, triple and quadruple mutant combinations of the phyA, phyB, cry]
and cry2 mutants to analyze the effect of one photoreceptor in the presence/ absence of other(s).
The use of single, double, triple and quadruple mutants revealed novel interactions among
photoreceptors and identied unknown photoreceptor functions. ln etiolated seedlings exposed to
continuous red light, phyA showed a dual effect. On one hand phyA inhibited hypocotyl growth, and on
the other, it reduced hypocotyl growth inhibition mediated by phyB. Thus, phyA interacted antagonistically
with phyB. Also under white light photoperiods, phyA delayed the transition from the vegetative to the
reproductive stage only in specic genetic backgrounds: cry], cry2 and cryl cry2, evidencing a novel roll
of phyA in the control of flowering. phyB and cryl were redundant on intemode growth repression, and the
absence of both photoreceptors demonstrated that stem growth is not inevitably linked to the reproductive
developmental program. In hypocotyl growth inhibition responses, phyB and cryl interacted
synergistically, and this interaction was light conditional. In most of the responses studied here, cry2 was
redundant with cry]. The interaction of cry2 with phyA and phyB in different developmental responses
followed two patterns, one in which cry2 activity required the presence of phyA and phyB (synergistic
effect), and the other in which cry2 required the absence of phyA and phyB (redundant effects). The
behavior of the phyA phyB cry] 0322quadruple mutant indicates that deciencies in light perception are not
restricted to de-etiolation , and continue during the adult stage. Based on our results and complementary
literature we propose a genetic model of photoreceptor interactions for two processes: de-etiolation and
owering.
The interactions observed under natural radiation were compatible with those observed under
laboratory conditions. The complex network of interaction between phytochromes and cryptochromes
under natural radiation generated de-etiolation homeostasis against the changes in irradiance and
photoperiod not associated to the position of the shoot above or below soil level.
phyA, phyB, cryl and cry2 are coupled to Arabidopxis development with different hierarchies.
Dependency or redundancy between pathways is affected by environmental conditions, ontogeny, and
genetic context. Redundancy among photoreceptors in the control of developmental processes generates
stability of phenotype that prevents aberrant patterns, while different hierarchies among photoreceptors
allow a specic partem of growth and development under specic light conditions.
Las plantas son organismos ssiles, es decir que no pueden trasladarse cuando las
condiciones son desfavorables y sta caracterstica refleja el modo en que responden a los
cambios ambientales. As, cambios en la siologa de las plantas proveen de respuestas a
corto plazo frente a alteraciones en el ambiente; y la integracin de respuestas siolgicas
moldea el desarrollo que permiten el ajuste a largo plazo a las variables ambientales. El
desarrollo de la morfologa dependiente de la luz por parte de las plantas es llamado
fotomorfognesis, y es controlado por la accin combinada de los sistemas de
fotorreceptores.
Introduccin 10
Figura l.l. Patrones de crecimiento l'otomorl'ognicoen
plntulas de Arabidaps'is' cultivadas en distintas
condiciones lumnicas. Las plntulas que crecen cn
oscuridad (O) sc caracterizan por poseer el hipocotilo
largo y los cotiledones cerrados. La exposicin a la luz
continua roja (R), roja lejana (RL) o azul cambia el patrn
de crecimiento dc la plntula, que se caracteriza por la
inhibicin del alargamiento del hipocotilo y la apertura
O R Azul RL dc los cotiledones.
Introduccin ll
Alto R/RL Bajo R/RL
Germnacin
Modulacin de la s
.. . .v- 3
compet1t1v1dad
con
plantas vecinas
,4
Floracin %
Figura 1.2. Procesos del desarrollo afectados por la relacin R/RL percibida por el fitocromo.
La disminucin de la relacin R/RL, como consecuencia de la presencia de plantas vecinas,
producen la inhibicin de la germinacin en las semillas, el alargamiento del tallo y aumento
de la dominacia apical, y la induccin de la iniciacin de la floracin en plantas adultas.
Estos mecanismos favoreceran la germinacin en lugares libres de canopeos densos que
representaran futuros competidores, la posibilidad de llegar a estratos ms altos de la
vegetacin donde el recurso luz est disponible y la reproduccin an en condiciones
desfavorables.
Introduccin 12
relacin R/RL de la luz propagada horizontalmente afectando principalmente el ambiente
luminoso de los tallos (Ballar et aL, 1987; Ballar et aL, 1990). As, la radiacin RL
reejada por las hojas vecinas funcionara como una seal temprana de competencia
durante el desarrollo de un canopeo (Ballar et aL, 1987; Ballar et aL, 1990). Cuando el
canopeo se hace ms denso el sombreado mutuo entre plantas se hace ms importante y
disminuye drsticamente la intensidad de luz R y azul y en menor medida la de RL,
causando la cada de la relacin R/RL de la luz propagada verticalmente que afecta el
ambiente luminoso de las hojas (Ballar et aL, 1987; Casal y Smith, 1989).
Los procesos del desarrollo en los cuales las seales lumnicas son ecolgicamente
relevantes incluyen la germinacin, la des-etiolacin, la modulacin de la competitividad
con plantas vecinas, y la iniciacin de la oracin.
1.1.2.1 Germinacin
El tiempo y el lugar donde una semilla comenzar a desarrollarse son crticos para la
supervivencia de la plntula. As, las semillas tienen la capacidad de sensar el ambiente
lumnico que las rodea y evaluar las condiciones ms favorables para su posterior
establecimiento. Varias especies producen semillas que, dependiendo de las condiciones
ambientales, requieren ser expuestas a la luz para la induccin de la germinacin (Casal y
Snchez, 1998). Este proceso puede ser desencadenado an por breves transiciones de la
oscuridad a la luz experimentadas por las semillas bajo tierra expuestas a frecuentes
remociones en el suelo (Scopel et aL, 1991).
La germinacin de semillas de varias especies est afectada fuertemente por la
calidad de luz. Bajas relaciones R/RL inhiben la germinacin, evitando condiciones de luz
desfavorables para el futuro crecimiento de la plntula, mientras que
altas relaciones R/RL promueven la germinacin, permitiendo as detectar claros de
vegetacin donde las condiciones son ms favorables (Fig. 1.2).
Introduccin 13
1.1.2.2 Etiolacin y Des-etiolacin
Introduccin 14
redistribucin de los fotoasimilados, producindose una mayor acumulacin de materia
seca en el mismo (Kasperbauer et aL, 1971, Holmes, 1977; Casal y Snchez, 1992,
Mazzella, 1995) incluyendo hidratos de carbono (Casal, et aL, 1995; Mazzella, 1995). En
algunas monocotiledneas, las bajas relaciones R/RL reducen el macollaje (Casal et aL,
1995).
Muchas plantas son sensibles a los cambios en las estaciones climticas, y producen
las estructuras reproductivas en un determinado momento del ao cuando los das son
largos o cortos, segn la especie. El fotoperodo es el factor ambiental ms importante que
afecta el tiempo de floracin. De esta manera, las plantas pueden sincronizar la oracin a
la estacin climtica ms conveniente y favorecer adems la fecundacin cruzada. La
calidad de luz tambin puede afectar el proceso de iniciacin oral. En algunas especies,
las plantas cultivadas bajo luz con una baja relacin R/RL orecen ms temprano que
aquellas cultivadas con una alta relacin R/RL (Halliday et aL, 1994) (Fig. 1.2).
Introduccin 15
1.2.1 Fitocromos
La regin ms efectiva del espectro para muchas respuestas es la luz R de 660 nm, y
este efecto del R puede ser cancelado por la irradiacin subsecuente de luz RL de 730 nm.
En la dcada del SOse caracteriz al tocromo como el pigmento involucrado en el
fotocontrol de la germinacin de semillas de lechuga (Borthwick et aL, 1952). La luz R
induca la germinacin de las semillas que poda ser inhibida por un pulso subsecuente de
luz RL. Si las semillas eran expuestas a ciclos secuenciales de R y RL, la respuesta nal
estaba determinada (dentro de cierto lmite de tiempo) por el ltimo tratamiento de luz
recibido, independientemente de los tratamientos previos. La conclusin fue que la
respuesta estaba mediada por un nico regulador, llamado tocromo, que se activara con
R y se inactivara con exposiciones a RL.
.9o,
Absorbancia
C
R (660 nm)
Pr < Pfr_. > > Respuesta
/ V
Siniesrs
RL(730
nm) \
Destruccin
(Pfr lbil)
Reversin cn oscuridad
Introduccin 17
diferencias estructurales del cromforo (ismero 15E y lSZ, respectivamente). Los
cambios producidos en la conguracin del cromforo, producen cambios
conformoconales en la apoproteina que a su vez, interacciona con componente(s) de la
clula (Fig. 1.3B). El tocromo es sintetizado en la forma Pr, es decir que en plntulas
etioladas el 100 % del tocromo se encuentra en esta forma. La luz R convierte la forma Pr
Introduccin 18
mutados han indicado que las secuencias necesarias para una actividad normal residen a
ambos extremos del polipptdo. En el dominio amino terminal se encuentran los sitios
necesarios para la unin al cromforo y para mantener la especicidad fotosensorial
(Wagner et aL, 1996) (Fig. 1.4). En el dominio carboxi terminal se encuentran los sitios
necesarios para la dmerizacin y la actividad regulatoria del tocromo (Quail et aL, 1995)
(Fig. l .4). ste ltimo dominio contiene dos regiones con homologa a los dominios PAS
(Lagarias, 1995) (por BER ARNT SIM, dominios encontrados originalmente en un gran
nmero de protenas reguladoras en moscas y mamferos; Huang et al, 1993). Se ha
encontrado que estos dominios son importantes en la interaccin protena-protena (Taylor
y Zhulin, 1999). La importancia de los dominios PAS en la estructura de los tocromos
queda maniesta en el hecho de que mutantes de tocromo afectados en estos dominios
tienen defectos en sus propiedades espectrales y en la capacidad de interactuar con
componentes ro abajo de la cadena de transduccin (Elich y Chory, 1997). En el extremo
carboxi terminal tambin se encuentran los dominios de homologa a Histidina kinasa, que
se describen ms adelante.
'
NHa
I 673
ll
(74 PASA
Regin de alla
PAS!)
1
200
ICOOH
frecuencia de
mutaciones
- + Zonas
involucradas
en&
la dmerizacin
Figura 1.4. Estructura del tocromo. En el dominio amino terminal se encuentra la especicidad
l'otosensiorial con el sitio de unin al cromforo, mientras que el dominio carboxi terminal se
encuentran los elementos necesarios para la actividad regulatoria. La regin negra representa el
'puente entre ambos dominios. En el extremo carboxi terminal se encuentran los dominios con
homologa a histidina kinasas (HKRD), y los dominios PAS.
Introduccin 19
1.2.1.2 Los tocromos son una familia de fotorreceptores
' Algunas palabras se mantienen en el idioma original por no encontrar en espaol una traduccin exacta de
las mismas.
Introduccin 20
Fitocromo A
Introduccin 21
respuestas llamadas HIR (del ingls High [rradance Response). Son respuestas que
requieren intensidades de luz RL altas y por un tiempo prolongado y en las que no se
cumple la ley de la reciprocidad. La ley de la reciprocidad establece que a igual cantidad de
fotones la respuesta es la misma. Es decir, que en tratamientos con irradiaciones continuas,
o irradiaciones con menor tiempo de exposicin pero a mayor ujo (de manera tal que la
cantidad de fotones sea la misma), se obtiene el mismo grado de respuesta. En las
respuestas HIR, la exposicin a luz RL continua (RLc) es ms eciente que pulsos horarios
de RL (RLp) en la que se mantiene el ujo total. En otras palabras, en las respuesta del tipo
HIR, el grado de respuesta no depende slo de la cantidad de fotones recibidos sino tambin
de la forma en la que los fotones son distribuidos en el tiempo. La evidencia contundente
que el phyA media las respuestas al VLFR y HIR se sustenta en el hecho de que mutantes
de phyA fallan en ambos tipos de respuesta (Botto et al, 1996; Shinomura et al, 1996; Casal
et al, 1994, Nagatani et al, 1993). Hoy existen evidencias genticas (Yanovsky et aI., 1997;
2000) y moleculares (Cerdn et al., 2000) que muestran que el VLFR y el HIR seran parte
de dos casacadas de sealizacion diferentes.
Introduccin 22
Consistentemente con su funcin, el transporte de phyA hacia el ncleo se produce
con Rp o RLp (traslocacin mediada por una respuesta del tipo VLFR ) o con exposiciones
a luz RLc (traslocacin mediada por una respuesta del tipo HIR) (Kim et al., 2000).
Fitocromo B
Introduccin 23
Botto et aL, 995; Reed et (11.,1993). Adems, el phyB es el principal fotorreceptor de las
disminuciones en la relacin R/RL y pulsos de RL al final del da, asociadas al cambio en el
ambiente luminoso como consecuencia de la presencia de plantas vecinas (Whitelam y
Smith, 199]; Ballar et aL, 1991; Robson et aL, 1993). El mutante phyB orece ms
tempranamente que el WT tanto en das cortos como en dias largos, revelando un rol
inhibidor del phyB sobre la iniciacion oral (Goto et aL, 1991; Reed et aL, 1993).
Consistentemente con su funcin, se ha demostrado que el phyB migra al ncleo
luego de ser expuesto a la luz R y puede ser inhibido por luz RL (traslocacin mediada por
una respuesta del tipo LFR) (Kircher et aL, 1999).
Fitocromos C/D/E
Introduccin 24
Cuatro diferentes aproximaciones han sido utilizadas para identicar componentes
de la cadena de transduccin del tocromo: siolgica, farmacolgica, gentica y
molecular. Las aproximaciones siolgicas y farmacolgicas han permitido identicar la
participacin del tocromo en cambios en el potencial de membrana (Raculsen et al., 1983)
y la participacin de protenas G heterotrimricas, cGMP y calcio (Neuhaus et al., 1993)
como componentes tempranos de la sealizacin, respectivamente. Las aproximaciones
genticas, a travs de la bsqueda de mutantes; y moleculares, a travs de la identicacin
de los factores que interactan directamente con el tocromo, son las que han provisto la
mayor informacin para comenzar a entender los caminos de transduccin de seales. La
identicacin de plantas mutantes afectadas en componentes de la cadena de trasduccin
ha permitido determinar un gran nmero de genes que actan tempranamente ro abajo del
phyA (causando deciencias en la respuesta a la luz RL) como eljhyl (Whitelam, et al.,
1993),n 2 (Soo Soh et al., l998)far1 (Hudson et al., 1999) y spa] (Hoecker et al., 1998),
del phyB (causando deciencias en la respuesta a la luz R) como pef2, pef3 (Ahmad y
Cashmere, 1996) y red] (Wagner et al., 1997) as como tambin genes involucrados en
ambas cadenas de sealizacin como el pef] (Ahmad y Cashmere, 1996) y psi2 (Genoud et
al., 1998). Las mutantes con fenotipo des-etiolado cuando crecen en oscuridad son
pleiotrpicas estando afectadas en varios aspectos del desarrollo de la planta y son
considerados genes que actan tardamente como componentes de sealizacin. Este es el
caso de los mutantes cop (Deng et al., 1991) y det (Chory et al., 1989).
Las aproximaciones moleculares han demostrado la asociacin del phyB y el
phyA con el factor de transcripcin PIF3 (del ingls phytochrome interactive factor 3) (Ni,
1998; Ni et al., 1999). La asociacin del PIF3 al phyB se induce luego de exposiciones a
la luz R y este efecto puede revertirse con luz RL (Ni et al., 1999). En adicin al PIF3, otras
dos protenas han sido identicadas como protenas capaces de interactuar con el tocromo:
la PKSl (del ingls phytochrome (inasesubstrate 1) (Fankhauser et al., 1999) y la
NDPKSZ (del ingls nucleoside dsphosphate kinase 2) (Choi et al.,l999). La PKSl, se ha
encontrado nicamente en el citoplasma, e interacta con el extremo carboxi terminal del
phyA y del phyB. La fosforilacin de la PKSl est estimulada por la luz, sugiriendo la
participacin del tocromo como kinasa. La NDPK2, se encuentra tanto en el citoplasma
Introduccin 25
como en el ncleo, e interacta con el extremo carboxi terminal del phyA (Choi et aL,
1999), y su actividad enzimtica est estimulada cuando interacta con la forma Pfr del
phyA. Las mutantes de m1ka fallan en el R y RL sugiriendo la interaccin tanto con el
phyA como el phyB.
En resumen, la accin del tocromo podra resultar en dos mecanismos separados,
uno que operara en la expresin de genes y otro ms rpido operara para modular el
balance inico citoplasmtico.
Los receptores de luz azul se caracterizan por absorber en la regin UV-A- azul del
espectro. Entre las respuestas que modulan se encuentran: la inhibicin del crecimiento del
hipocotilo, la regulacin del tiempo de oracin, los ritmos circadianos, la apertura de
estomas, y la curvatura fototrpica del hipocotilo. Una clase de pigmentos, parecidos a las
fotoliasas tipo I de bacterias, se denominaron criptocromos (Cashmore et aL, 1999).
Luego, el nombre fototropina fue inventado para el receptor de luz azul que media las
respuestas fototrpicas (Briggs y Huala, 1999). Desde el descubrimiento de los
criptocromos en plantas, este tipo de pigmentos similares a fotoliasas ha sido encontrado en
animales. En humanos (hCRYI y hCR Y2)y en ratn (mCryI y mCry2) (Hsu et aL, 1996,
Todo et aL, 1997) se han encontrado dos criptocromos y Drosophila posee un criptocromo
((ICRY)(Emery et aL, 1998). A diferencia de los criptocromos de plantas, los criptocromos
animales se asemejan ms a la 6-4 fotoliasa, adems hay poca similitud de las secuencias
entre los dominios carboxi terminales en los diferentes organismos (Emery et al., 1998),
sugiriendo que contrariamente a los fitocromos, los criptocromos derivaron de ms de una
lnea evolutiva. Sin embargo, tanto en plantas como en animales los criptocromos estn
involucrados en la regulacin de los ritmos circadianos.
Introduccin 26
1.2.2.1 Criptocromos
Crptocromo 1
Criptocromo 2
El segundo criptocromo, el cry2, fue aislado por homologa al cryl (Lin et aL,
1998). A diferencia del cryl que es expresado constitutivamente, la concentracin de la
protena de cry2 disminuye rpidamente cuando las plntulas son expuestas la luz azul (Lin
et aL, 1998). El cry2 tambin tiene localizacin nuclear (Guo et aL, 1999; Kleiner et aL,
Introduccin 27
1999). El mutante de cryZ de Arabdopsis es allico a un mutante llamado jha previamente
identificada como mutante de floracin tarda (Koomneef et aL, 1991; Guo et aL, 1998).
Experimentos realizados con mutantes cry2 o plantas transgnicas que sobreexpresan el
CRYZ han indicado que este fotorreceptor tiene un rol fundamental en la promocin de la
transicin del estado vegetativo al reproductivo (Lin et aL, 1998). El cry2 tambin estara
involucrado en la des-etiolacin en respuesta a muy bajos ujos de luz azul (Lin et aL,
1998).
1.2.2.2 Fototropina
Introduccin 28
(Ballare, 1991). Sin embargo hasta el momento no se ha identicado ningn fotorreceptor
de UV-B.
Los primeros trabajos realizados para estudiar la interaccin entre los pigmentos
mostraron que tratamientos de luz azul aumentaban la respuesta a un pulso subsecuente de
R (Meijer y Engelsma, 1965), para la acumulacin de antocianas en Sorghum (Drumm y
Mohr, 1978, Oelmler y Mohr, 1985), y la actividad de la gliceraldeho-3-fosfato
deshidrogenasa (Oelmller y Mohr, 1984). Mohr y colaboradores propusieron un modelo
de coaccin entre los fotorreceptores. Este modelo consideraba al tocromo (en su forma
Pfr) como efector que opera directamente en la expresin de los genes, mientras que la luz
azul absorbida por parte de los criptocromos modulara la respuesta del Pfr (Mohr, 1994).
El estudio de las interacciones entre tocromos y criptocromos no es trivial, y puede
conducir a interpretaciones errneas si no se toman en consideracin algunos aspectos
propios de la fotobiologa de los receptores. Si bien los tocromos absorben principalmente
en la regin del espectro correspondiente al R y RL, tambin absorben en el rango de los
450 nm (luz azul) (Fig. 1.3A). La luz azul establece aproximadamente un 45 % de la forma
Pfr. Es decir que irradiaciones con luz azul podran estar produciendo una respuesta va
tocromo y no va fotorreceptor de luz azul.
La interaccin entre dos productos gnicos puede clasicarse como sinrgica o
antagnica. La interaccin es sinrgica cuando la actividad de un produto gnico aumenta
con la actividad de otro producto gnico, y se dice que es antagnica cuando la actividad de
un producto gnico se reduce con la actividad de otro producto gnico.
Experimentos realizados utilizando plantas mutantes simples de phyA, phyB o cry]
en combinacin con tcnicas fotobiolgicas clsicas han puesto en evidencia algunas
interacciones entre estos fotorreceptores durante el proceso de des-etiolacin. Uno de los
Introduccin 29
RLp y Rp RL R Azul
phyA phyA phyB cryl cry2
m S
S E. A 2K
> CE
Des-etiolacin ?
RL R Azul
phyA phyB cryl cry2
Iniciacin oral
Figura l. 5. Modelos esquemticos que representan el estado del conocimiento de las interacciones entre
tocromos y criptocromos antes de comenzar la presente tesis para dos procesos, A) des-etiolacin,
B) iniciacin oraL > Interacciones positivas . Interacciones negativas
Introduccin 30
fotorreceptores que media la des-etiolacin bajo luz R es el phyB. Sin embargo, un simple
pulso de luz R por da que fototransforrna al phyB en Pfr no es suciente para producir la
des-etiolacin (Casal y Boccalandro, 1995). Si el pulso de R es precedido por 3 h de luz RL
se produce la inhibicin del crecimiento del hipocotilo, y la apertura de los cotiledones
(Casal y Boccalandro, 1995). Este efecto se pierde en el mutante de phyB, como era de
esperarse ya que es el fotorreceptor que percibe el pulso de R, y el mutante de phyA
muestra la misma respuesta al pulso de R con o sin un pretratamiento de RL, indicando la
participacin del phyA en la percepcin de RL. Estos resultados muestran que el phyA y el
phyB son sinrgicos ya que la activacin del phyA (en su forma HIR) aumenta la actividad
del phyB a los pulsos de R (Casal, 1995) (Fig. 1.5A). En este mismo sentido, la exposicin
a tratamientos de luz azul, percibidos por el cryl , es capaz de establecer la respuesta a
pulsos de R percibidos por el phyB (Casal y Boccalandro, 1995). Esta combinacin de
exposicin a la luz azul seguido de luz R no es efectiva ni en el mutante de phyB ni en el
mutante de cry]. Nuevamente, la accin del cryl aumenta la actividad del phyB, es decir
que estos fotorreceptores actan sinergisticamente (Fig. 1.5A). Interacciones sinrgicas
entre phyB y cryl tambin se han encontrado en otros procesos distintos al de la des
etiolacin como en los cambios en turgencia de los protoplastos aislados de hipocotilos de
Arabidopsis (Wang y Moritoshi, 1997) en respuesta a la luz azul.
Recientemente se ha aislado el mutante de cryZ (Guo et al., 1998) y experimentos
realizados con dobles mutantes phyB cryZ revelaron que el cry2 actuara
antagonisticamente con el phyB (Mockler et al., 1999) durante la iniciacin oral (Fig.
1.58). Sin embargo, las interacciones del cry2 con otros fotorreceptores en sta y otras
respuestas son an desconocidas.
Las interacciones entre fotorreceptores han sido evidentes en condiciones
controladas que involucran ujos de luz constantes o exposiciones a longitudes de onda
restringidas. Sin embargo, la ocurrencia de interacciones en condiciones de radiacin
natural, donde la irradiancia vara a lo largo del da y existen fotoperodos, no ha sido hasta
el momento analizada.
Introduccin 31
involucrados en la regulacin de un determinado proceso del desarrollo forman parte de una
extensa red en la cual los caminos de transduccin entre ellos estn interconectados.
Algunas de las interacciones entre fotorreceptores descriptas sugieren que las cadenas de
transduccin de los mismos podran involucrar una amplia red de conexiones, sin embargo,
para el sistema de fotorreceptores el panorama es an incompleto.
1.4 OBJETIVOS
Para ello la aproximacin elegida involucra obtener y caracterizar todos los dobles,
triples y cudruple combinaciones de mutantes a partir de los simples mutantes de phyA,
phyB, cry] y cryZ de Arabidopsis thaliana. Este material sera valioso como herramienta
gentica para estudiar el efecto de un fotorreceptor en ausencia / presencia de otro/s
fotorreceptor/es. Adems, al momento de escribir esta tesis este material no se encuentra (al
menos en forma completa) disponible en ningn otro laboratorio.
Los patrones de interaccin se presentan en tres secciones. En la primera se estudia
el rol del phyA en la inhibicin del alargamiento del hipocotilo bajo luz Rc y la existencia
de interacciones con el phyB (principal fotorreceptor de luz R). En esta parte de la tesis no
se utilizaron las combinaciones de mutantes con cry] y cryZ ya que estos fotorreceptores no
son activos en luz R.
En la segunda parte se presentan las interacciones entre phyA, phyB, cryl y cry2 en
plantas cultivadas en condiciones controladas utilizando luz blanca que activa a los cuatro
fotorreceptores. Se analiz el comportamiento de los mutantes simples y mltiples en
diferentes procesos del desarrollo: des-etiolacin, crecimiento vegetativo, transicin del
estado vegetativo al estado reproductivo y fenotipo adulto. Durante el estudio del
comportamiento de estos mutantes en la etapa vegetativa, encontramos que el doble
mutante phyB cry] presentaba entrenudos alargados. Caracterizamos ms ampliamente sta
respuesta en diferentes temperaturas y su correlacin con la transicin del estado
Introduccin 32
vegetativo al reproductivo. En la tercera seccin se presentan las interacciones entre
tocromos y criptocromos durante la des-etiolacin en condiciones de radiacin natural.
Las plantas fueron expuestas a distintos rangos de irradiancia y diferentes fotoperodos.
2 MATERIALES Y MTODOS
Los dobles mutantes phyA-201 cry1-1 y phyB-5 cry] -1 fueron obtenidos a partir de
cruzamientos de las lneas parentales y posterior seleccin de las plantas con fenotipo
alargado en la generacin F2 crecidas bajo luz RL ms azul o luz R ms azul,
respectivamente. En la siguiente generacin se confirm el genotipo exponiendo las
plantas a los tratamientos de luz correspondientes y se seleccionaron las lneas
homocigotas. El triple mutante phyA-201 phyB-5 cry1-1 fue obtenido por cruzamientos del
doble mutante phyA- 201 phyB-5 con el simple mutante cry] -1. Las plntulas con fenotipo
elongado luego de crecer en luz blanca fueron seleccionadas de la F2. En la F3 se realizaron
las pruebas de confirmacin como se describi para los dobles mutantes. Todos los
mutantes que llevaban el alelo cry2 cry] -1 c022,phyA-201 cry2, phyB-5 cry2, phyA-201
phyB-5 cryZ,phyA-201 cryI-I cryZ,phyB-5 cry1-1 cryZ yphyA-201 phyB-5 cryI-I cryZ
fueron obtenidos con el cruzamiento del triple mutante phyA-201 phyB-5 ay] -1 con el
simple mutante cryZ. Las semillas que llevaban la mutacin cryZ fueron identicadas en la
generacin F2 identicando los alelos con pruebas de PCR. Aquellas plantas que
presentaban hipocotilos alargados y cotiledones cerrados cuando eran crecidas bajo luz RL,
Materiales y Mtodos 34
R o azul fueron seleccionados en las sucesivas generaciones para identicar las mutaciones
phyA, 21in y cry] , respectivamente. Todos los mutantes utilizados en esta tesis pertenecen
al ecotipo Landsberg erecta.
En algunos experimentos de la seccin 3.1, se utilizaron semillas de tabaco WT
(Nicotiana tabacum L. cv. xanthi) y de la lnea isognica 9A4, transformada con el gen de
PH YAde Avena fusionado al promotor constitutivo del virus del mosaico (CaMV_3SS)
(Keller et aL, 1989).
El genotipo de los dobles, triples y cudruple mutantes fue confirmado por PCR.
Las mutaciones phyA-201, phyB-5 y cry] -1 fueron identicadas como se describe en Neff y
Chory, 1998. La mutacin cryZ crea un marcador dCAPS. Los productos de PCR obtenidos
amplicados con los primers 5GACTATAGTTTGGTTTAGAAAGAGACCTAA 3y
5GATTGAGATAAGTGAGCAAGTGATTGTTTCATGCA 3fueron resueltos en un gel
de agarosa al 2.5 % luego de la digestin con la endonucleasa de restriccin Nsi l.
Materiales y Mtodos 35
alargamiento de los entrenudos, y a macetas de 7 cm de alto x 4 cm de dimetro para los
experimentos de la seccin 3.2, en el que se estudiaron las plantas hasta su fenotipo adulto.
Los experimentos en las cmaras fueron realizados a temperatura constante de 20
C o 25 C. Se realizaron experimentos a distintas temperaturas: 6 C o 20 C constantes
o alternancia 20 C /30 C (15h / 9h) para analizar el control del alargamiento de los
entrenudos.
En los experimentos con plntulas de tabaco, las cajas fueron expuestas 24 h a luz
blanca e ncubadas 4 das en oscuridad a 25 C antes de los tratamientos.
Materiales y Mtodos 36
Para estudiar el alargamiento de los entrenudos basales (seccin 3.2.1) las plantas
fueron expuestas a luz blanca continua provista por lmparas uorescentes (40 umol rn'2 s '
I) en cada rgimen de temperatura.
En los experimentos realizados bajo radiacin natural, las cajas conteniendo las
plntulas fueron transferidas a un invemculo. Se usaron dichas cajas envueltas en
aluminio como controles de oscuridad para cada experimento. En algunos experimentos, las
cajas conteniendo las semillas fueron puestas en cajas sin tapa de color negro cubiertas con
ltros neutros para obtener las distintas irradiancias (del 100% al 5%). Los valores de las
temperaturas dentro de las cajas fueron aproximadamentre de 23 C para los controles de
oscuridad y 26 C para las cajas expuestas a 100 % de luz solar al medioda. Teniendo en
cuenta que altas temperaturas producen la elongacin de los entrenudos (Grey et aL, 1998)
estas pequeas diferencias podran en todo caso resultar en la subestimacin de los efectos
de la luz. En otros experimentos, las semillas fueron expuestas a fotoperodos normales de
luz solar (l 1 h) o a fotoperodos ms cortos (5 h), entre las 10: OOy 15:00 hora local.
Des-etiolacin: La longitud del hipocotilo fue medido con regla con un error de 0.5
mm. Las 10 plntulas ms largas fueron utilizadas para calcular el promedio del largo del
hipocotilo en cada caja (una repeticin). Este valor fue relativizado a la longitud de los
controles en oscuridad y usado para los anlisis estadsticos. En los experimentos que
involucraron diferentes irradiancias naturales, las longitudes de los hipocotilos relativos a
los controles de oscuridad fueron ajustados por cuadrados mnimos al logaritmo de la
irradiancia. El ngulo entre los cotiledones fue medido con un transportador.
Desarrollo vegetativo: Los entrenudos por arriba del hipocotilo fueron medidos con
una regla con un error de 0.5 mm. El nmero visible de hojas (mayores que 2 mm) fue
medido cada da (aproximadamente) para analizar la tasa de aparicin de hojas.
Transicion del estado vegetativo al estado reproductivo: El nmero nal de hojas en
el vstago principal (hojas en la roseta ms hojas en el tallo) fue utilizado como una
mediada de escala biolgica del tiempo a floracin (Koomneef et aL, 1991). Como algunos
mutantes de fotorreceptores usados en este estudio no muestran un fenotipo normal de
Materiales y Mtodos 37
roseta, el nmero de hojas en la roseta no fue usado como indicacin del tiempo de
floracin. El tiempo de aparicin de primer pimpollo visible fue medido a ojo desnudo y
utilizado como una escala cronolgica del tiempo a oracin. Para investigar el tiempo de
transicin entre el estado vegetativo y reproductivo en el pice (seccin 3.2.1), tres plantas
de cada genotipo fueron cosechadas cada 2 o 3 das. La diseccin de los pices fue
observada a la lupa. Los pices vegetativos eran sutilmente convexos y estaban
parcialmente cubiertos por primordios foliares (Hempel et aL, 1997; Smyth et aL, 1990). La
presencia de yemas orales a los costados del meristema apical fue tomada como indicio de
una transicin completa del estadio vegetativo al reproductivo (Smyth et aL, 1990).
El nmero de repeticiones est indicado en la leyenda de las guras y tablas.
3. RESULTADOS
En esta primera parte de la tesis investigamos con mayor detalle el rol del phyA bajo
Rc y las interacciones con el phyB, comparando la respuesta a diferentes ujos de luz R en
el WT, los mutantes simples de phyA, y phyB y el doble mutante phyA phyB de
Arabidopsis thaliana, as como tambin en plntulas salvajes y sobreexpresantes de phyA
en Ncotiana tabacum.
Resultados 39
0.8
Figura 3.1. Efectos de diferentes ujos
0.6.
de Rc en el largo del hipocotilo de
plntulas de Arabdopsis thalana: WT,
simples mutantes phyA y phyB y el
doble mutante phyA phyB. Los crculos
blancos indican el largo del hipocotilo
en plntulas expuestas a pulsos
0.4 . PhyA
NM
l
/
y= 0.52 0,14;
y=0.70- 0.04x
horarios de 3 min de R (Rp) (la
posicin de las absisas corresponde al
W
ujo de Rc y al mismo ujo total de
0.8
o
Rp). Los datos representan la media i
0.6
error estndar (E.E) de 18 repeticiones.
0.4 - phyB
relativo
hipocotilo
del
Largo
los
controles
de
oscuridad
a
Resultados 40
Figura 3.2. Efecto de distintos ujos de Rc
i en el largo del hipocotilo de plntulas de
0.8- ___|
* tabaco WT o sobreexpresantes de phyA de
\ avena. Los
= 2.7 %) se efectos de alos
muestran la RLp (fotoequilibrio
derecha de cada
grfico. Los datos representan la media i EE
de 9 repeticiones.
1.0.
0.8 i
0.6
I
0.4
sobreexpresante de
Largo
relativo
hipocotilo
del
los
controles
de
oscuridad
a
phyA
n
l l l l
-a -6 -4 -2 o : T
Log del ujo de Rc (umol. m'z. s") RLp
Genotipo Noruorazn Rc Rp
Arabidopss
WT O.62i0.02 O.66i0.04
l
+ 0.54i0.03 0.52i0.04
phyA - 05910.02 05910.05
0.52:0.03 O.50i0.05
Nicoriana
WT 04510.02 03410.02
+
l 0.34i0.02 0.30t0.01
sobreexpresante phyA - 0.3li0.01 0.28i0.02
+ 0.28i0.01 02510.01
Resultados 41
Efectos comparativos de Rc versus Rp
La luz RLc induce la respuesta del tipo HIR, que se caracteriza por el requerimiento
de exposiciones largas y de altos ujos de luz, y la falla en cumplir la ley de la
reciprocidad. Para analizar si la respuesta al Rc era una respuesta del tipo HIR, los distintos
genotipos fueron expuestos a un pulso de luz R de 3 min por hora (Rp) o a luz Rc, de
manera tal que la cantidad de fotones recibidos por hora por las plntulas fuera el mismo.
La inhibicin del hipocotilo causada por Rp fue similar o an mayor que aquella causada
por Rc (Fig. 3.1 y Tabla 3.1). La clorola absorbe luz R y por lo tanto podra estar
reduciendo el efecto de tratamientos de Rc comparados con Rp. Para investigar este punto
Arabidopsis Nicotiana
A C
'C
8 10-
'U
"; / 'C0.6-:2:
E y
'U 'D
g 0_6_ % g 0.4
a 0.4. % a
9 % 9 02
E 02 / E
8 '
on
%
g
00-
A
g 1.o- g |=IRLc+Rc 5
._= __,:_ .5 0.6.
g oa- g ERLNRD
'
0'6_ 0.4- I
8 8
E 0.4- IE
o 0.2- 0
g F.
E nn
S E nn
S 0.2-
phyA-201 sobreexpresante
de phyA
Figura 3.1. Efectos de RLp (3 min por hora: 12 umol m'2 s" ) comparados con RLc (0.6 pmol rn'2
s") con el mismo ujo total (A y C) y RLp + Rp (3 min por hora RL= 12 pmol m'2 s"; R= 13 pmol
m'2 s") comparado con RLc+Rc (RL: 0.6 pmol m'2 s"; R= 0.65 umol m2s") (B y D). Los datos
representan las medias i EE de al menos 8 (A, C) o 21 (B, D) repeticiones.
Resultados 42
plntulas de Arabidopss y tabaco fueron cultivadas en un medio con Noruorazn
(produce la destruccin de la clorola). El efecto inhibitorio del R fue ligeramente mayor
en plntulas cultivadas con Noruorazn, sin embargo, el Rc no fue ms eciente que Rp
(Tabla 3.1).
En contraste, cuando se compararon tratamientos de RLc versus RLp, el RLc fue
ms eficiente en la inhibicin del crecimiento del hipocotilo tanto en Arabidospis como en
tabaco (Fig. 3. 3A y C) (HIR). Es decir, que no se cumpli la ley de reciprocidad que
predice igual respuesta a la misma cantidad de fotones recibidos, independientemente de si
el tratamiento fue realizado con luz continua o pulsos. La adicin de R a los tratamientos de
RL anul la habilidad del RLc de producir una mayor inhibicin del crecimiento del
hipocotilo que con RLp (Fig. 3.3B y D). En otras palabras redujo la respuesta HIR del RLc.
Se investig con mayor detalle la respuesta a 3 min por hora de Rp. Las plntulas
WT mostraron una respuesta bifsica al ujo, con un punto de inexin en
lO'2pmol m'2 s'l (Fig. 3.4). Los RLp causaron un grado de inhibicin que coincidi con el
final de la primera fase de la respuesta a Rp (Fig. 3.4). Tanto la primera fase como la
respuesta a RLp estuvo ausente en el mutante de phyA y presente en el mutante de phyB. La
segunda fase fue ms pronunciada en el mutante de phyA comparada con el WT, y ausente
en el mutante de phyB (Fig.3.4). El doble mutante no present respuesta a los Rp (Fig. 3.4)
Resultados 43
/
y= 0,02 - 0.0|!
Figura 3.4. Efecto de diferentes ujos de Rp en el largo del
hipocotilo de plntulas de Arabdopss thaliana del WT,
i
0.6'. y: 0.72/-;.(l
phyA, phyB y phyA phyB. Los efectos de RLp
(fotoequilibrio= 2.7 %) se muestran a la derecha de cada
grco. Los datos representan la media i EE de al menos l3
repeticiones.
l
05+ y =073.0.st
l
Largo
del
hipocotilo
relativo
los
controles
de
oscuridad
a
Resultados 44
3.2 DESARROLLO VEGETATIVO Y REPRODUCTIVO EN ARABIDOPSIS CON
O SIN PHYA, PHYB CRYl Y CRY2.
Para estudiar las interacciones entre phyA, phyB, cryl y cry2, analizamos el
comportamiento de todos sus simples, dobles, triples y cudruple mutantes en diferentes
respuestas durante el desarrollo de Arabidopss thalana.
Des-etiolacn
Cuando las plntulas WT son cultivadas bajo luz blanca presentan un desarrollo
fotomorfognico o des-etiolacin que incluye la inhibicin del crecimiento del hipocotilo
(80 % i 1.5 % de inhibicin comparado con los controles de oscuridad) (Fig. 3.5).
Comparado con el WT, la inhibicin del crecimiento del hipocotilo fue similar en el
mutante simple de phyA (P> 0.01; Whitelam et aL, 1993) y se redujo en los mutantes
simples de phyB y cry] (P< 0.05, (Ahmad y Cashmore, 1993; Koomneef et aL, 1980; Reed
er aL, 1993). El mutante de cry2 fue similar al WT (P>0.l) y esta observacin es
consistente con resultados previos que muestran un efecto del cry2 a muy bajos ujos de
luz azul (Lin et aL, 1998). Con el propsito de analizar el efecto del cry2 en el crecimiento
del hipocotilo con mayor detalle, comparamos los largos de los hipocotilos en aquellas
plntulas con o sin cry2 en los diferentes backgrounds genticos de phyA y/o phyB, y/o
cryl (Fig. 3.5). Si bien el mutante de cry2 no fue ms alto que el WT, el doble mutante cry]
cryZ fue significativamente ms alto que el simple mutante cry] (largo del hipocotilo (mm)
i E.E. WT = 1.0 i 0.1, cry2 = 0.9 i 0.1, P> 0.1; cry] = 1.7 i 0.1, cry] cry2 = 2.3 i 0.1, P <
0.0001) (Fig. 3.5). Este efecto del cry2 no fue detectable, sin embargo, en la ausencia de
phyA y/o phyB (P > 0.1, Fig. 3.5) (diferencia entre las longitudes de los hipocotilos del
phyA cry] cryZ yphyA cry], phyB cry] cry2 yphyB cry] y del phyA phyB cry] cry2 y
phyA phyB cry] ). En otras palabras, el cry2 fue redundante con el cryl en la inhibicin del
crecimiento del hipocotilo pero dependiente de phyA y phyB.
En luz blanca, el WT, todos los simples, dobles mutantes y triples mutantes phyA
phyB cry2, phyA cry] cry2 y phyB cry] cry2 presentaron cotiledones abiertos (ngulo entre
los cotiledones i E.E., 180 i 0) (Fig. 3.5). El triple mutante phyA phyB cry] present
Resultados 45
1 e.
P<005
. N
.o N N a:
Na
E S 88
b
t):
o
oo
4:: aa
N 33
%'F
qm
ob
3-7
un
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-
oo
33
3.?
qq.
e> 3-:
m <<a: a
{e
w.
Di
su:
e:
su;
<4
aa
{e
a:
<<
2 o ke. QE UU QQ. Ka. Q.- RR
Figura 3.5. Des-etiolacin en altos ujos de luz blanca. El WT, y los simples, dobles, triples y cudruple
mutantes de phyA, phyB cry] y cryZ, fueron cultivados en fotoperodos de luz blanca (16 h) u oscuridad
(O) por 7 das. No se observaron diferencias signicativas entre los genotipos en los controles de
oscuridad por esta razn se muestra el WT. La mutacin de cryZ slo present diferencias signicativas
en el largo del hipocotilo en el background PH YAPH YBcry] (el anlisis fue realizado con lO repeticiones
(100 semillas) por genotipo). Los recuadros internos muestran (de izquierda a derecha) los cotiledones del
WT, phyA phyB cry] y phyA phyB cry] cryZ.
20
p/iyll g 10
5- + p/iy/phyBcry]cry2
e G)
i
lO Fc
:3 5- j
o
5- e
hojas
de
total
Nmero
0 =w=vl l l l l Z 0 l
0 l 20 30 40 50 60 70
33
Tiempo (das) 8
b w A ZR
N N me:
.. 3
NN NN .sa
U U a QR UU OO QA
3::
o a
QR. &o
QA UU ss
QA o
QR. ss
QR- ss
QA
Figura 3. 6. A Tasa de produccin de hojas en el WT, y en los mutantes de phyB y phyA phyB cry] cry2.
B. Nmero de hojas totales luego de 22 das de crecimiento en fotoperodos (16 h) de luz blanca. Las
barras blancas representan el background CRY2,las barras rayadas representan el background cryZ.
Resultados 46
los cotiledones casi completamente abiertos (150 i 29), mientras que los cotiledones del
cudruple mutante phyA phyB cry] cry2 permanecieron casi completamente cerrados (6 i
2) (Fig. 3.5). As, en la ausencia de phyA, phyB y cryl (comparacin entre el cudruple
mutante phyA phyB cry] cryZ y el triple mutante phyA phyB cryl), el cry2 fue capaz de
mediar la apertura de los cotiledones (P < 0.05, Fig. 3.5). Es decir, que el cry2 fue
redundante con el phyA, phyB y cryl para la respuesta de apertura de los cotiledones.
Resultados 47
WT phyA phyB cry] cry2
phyA phyB WT
cry] cryZ
Figura 3.7. A. Desarrollo del cudruple mutante phyA phyB cry] cry2. El WT y el cudruple
mutante 3 semanas despus de la siembra. B. El cudruple mutante lO semanas despus de la
siembra. Para comparar la morfologa se muestra un WT de 4 semanas ya que luego de lO
semanas ya ha terminado su ciclo de vida y senesce completamente. C. Desarrollo defectuoso
de las pnmeras silicuas en el cudruple mutante. Para la comparacin se muestra un WT.
Resultados 48
<
10
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ap
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||dU-'!d
.Iatupd
upgopede
ap
odluagl
ap
Resultados 49
reproductiva en das largos (Guo et aL, 1998). Es interesante notar que, en nuestras
condiciones la mutacin de cry] tambin aument el nmero de hojas. El doble mutante
cry] cry2 mostr los efectos aditivos de ambas mutaciones por separado. La mutacin de
phyB redujo el nmero final de hojas (Mozley y Thomas, 1995), indicando una transicin
temprana entre la fase vegetativa y reproductiva expresadas como escala biolgica (Fig.
3.8A). La mutacin de phyB fue episttica al cryZ y al cry] . Todas las combinaciones de
mutantes que llevaban el alelo phyB, incluyendo al cudruple mutante, orecieron con 7 u 8
hojas (P> 0.1; Fig. 3.8A). Es decir que, que grandes diferencias en la tasa de produccin de
hojas no resultan necesariamente en diferencias en el nmero final de hojas.
La mutacin de phyA se sabe que retrasa la floracin en plantas de Arabidopsis
cultivadas en das cortos extendidos con luz incandescente de baja intensidad (ricas en RL)
crjr.
cryl
24
Resultados 50
El inesperado impacto de la mutacin de phyA fue cuantitativamente ms
importante en plantas cultivadas en dias cortos por 21 dias, transferidas a das largos por
5 das consecutivos, y devueltas a das cortos por el resto del ciclo. Comparados con los
controles que permanecieron en das cortos, la exposicin a 5 das de fotoperodos largos
redujo el nmero de hojas (es decir, aceler la oracin) en el WT y el mutante de phyA
(Fig. 3.9). Los efectos de 5 das de fotoperodos largos fueron menores o nulos en los
mutantes cry], cry2, y cry] cry2. Interesantemente, la mutacin de phyA produjo la
recuperacin parcial de la respuesta a fotoperodos largos en los backgrounds de cry], cry2
y cry] cry2 (Fig. 3.9).
El tiempo de aparicin del primer pimpollo visible sigue solo parcialmente el patrn
observado para el nmero final de hojas. Si bien ambas variables dependen de la transicin
entre la fase vegetativa y reproductiva, la escala cronolgica est afectada por los retrasos
generales del desarrollo.
La mutacin de cry2 retrasa el tiempo de aparicin del primer pimpollo visible (P<
0.000], Fig. 3.8B) pero no se observaron diferencias signicativas entre el WT y el mutante
cry] (P> 0.1, Fig. 3.88). No se detectaron pimpollos mas tempranamente en el mutante de
phyB comparado con el WT y esto podra reejar el balance entre la transicin a la fase
reproductiva en una escala biolgica temprana (menor nmero de hojas) (Fig. 3.8A) y el
desarrollo retrasado (como se muestra en la reduccin de la tasa de aparicin de hojas, Fig.
3.6).
La mutacin phyB fue episttica a la mutacin de cry2, y la mutacin de phyA fue
parcialmente episttica a la mutacin de cry2, como en el caso del nmero total de hojas.
En otras palabras, el retraso observado en el mutante de cryZ requiere la presencia de phyB
y en menor medida de phyA. Sin embargo, los efectos en el retraso de la oracin de la
mutacin de cryZ reaparecieron en el background de dobles mutantes y fueron muy fuertes
en el background del triple mutante phyAphyB cry] . Este patrn de dependencia y
redundancia entre el cry2 y phyA y phyB podra ser explicado por el hecho que el tiempo
de aparicin del primer pimpollo deriva del tiempo de transicin entre el estado vegetativo
Resultados 51
y reproductivo (donde la actividad del cry2 depende del phyA y phyB, Fig. 3.8A) y el
desarrollo en general (donde el cry2 es redundante con otros fotorrecepotres, como el
observado para la apertura de cotiledones).
El tiempo entre la aparicin del primer pimpollo visible y antesis fue analizado
como una medida de la tasa de desarrollo luego de la transicin al estado reproductivo. Este
perodo fue largo en los triples mutantes que llevaban el alelo phyB (phyAphyB cry], phyA
phyB cryZ, phyB cry] cryZ) y en el cudruple mutante phyA phyB cry] cry2 (P< 0.0001;
Fig. 3.10). Comparado con el WT, el mutante de cry2 mostr retraso en la oracin (Fig.
3.8A y B), pero no fue afectado en el tiempo entre la aparicin del primer pimpollo visible
y antesis (P> 0.1). Sin embargo los efectos de la mutacin de cry2 fueron evidentes cuando
se compararon los mutantes phyA phyB y phyA phyB cry2 (P< 0.0001, Fig. 3.10) as como
.n Jl
"3
8 2
5E Figura 3.10. Tiempo transcumdo entre la apancrn del
Q >\
|- . . . . .
40a
:3
.5 > g 1 primer pimollo v151bley antesrs. Las barras blancas
g 3 e, representan el background de CRY2,y las rayadas el
5 5 x i \
ga-
= S ss \ background de cryZ.
E 2= i \\
|- .: \ \
o. n
t-a
i
E E" E'E
. -'.
%
Lt
-' B B
Zbssssb "23232223
z
e.
K. a
F F .3 2 s
a
x
. R tu t. k Q. k R
'F 'S F P P S
. E . a.
tambin entre el phyB cry] y phyB cry] cryZ (P< 0.0001, Fig. 3.10), indicando redundancia
del cry2 con el phyA, phyB y cryl.
Resultados 52
El cudruple mutante est severamente afectado en el desarrollo
Los mutantes phyB cry] y phyA phyB cry] no producen rosetas normales
Plantas WT, y los mutantes simples, dobles y triples de phyA, phyB y cry], fueron
cultivados bajo radiacin natural en un invemculo. La longitud de los dos primeros
entrenudos basales fue de Omm en el WT y en los mutantes simples y dobles de phyA y
cry] . La mutacin phyB aument el largo a aproximadamente 0.5 mm, y la combinacin
simultnea de phyB y cry] los llev a aproximadamente 3 mm. Es decir, que la mayora de
los genotipos formaron una roseta normal mientras que los mutantes phyB cry] y phyA
phyB cry] produjeron plantas caulescentes (Fig. 3.11).
Resultados 54
Figura 3.11. Fenotipo del
simple mutante cry]
(arriba) y del triple
mutante phyA phyB cry]
(abajo) de Arabidospsis
cultivados bajo radiacin
natural (fotoperodo: 10 h)
Todos los genotipos fueron cultivados bajo luz blanca continua con tres regmenes
de temperatura diferentes: 6 C, 20 C, o alternancia entre 20 C (15 h) y 30 C (9 h). La
elongacin del primer y segundo entrenudo se observ en los mutantes phyB ay] y phyA
phyB cry] y en menor grado en los mutantes de phyB y phyA phyB cuando fueron
cultivados a 20 C y a 20/30 C (Tabla 3.2). Es decir, a estas temperaturas, el phyB y el
cryl fueron redundantes en el hbito de hacer rosetas ya que la diferencia entre el doble
mutante phyB cry] con el WT fue mucho mayor que las sumas de las diferencias entre el
WT con cada uno de los simples mutantes.
6 C 20 C 20-30 C
Resultados 55
A estas temperaturas, el primer entrenudo en ausencia de phyB y cryl ya estaba
elongado mientras que las plantas WT comenzaron la extensin en el quinto (20 C) o
cuarto (20/30 C) entrenudo (datos no mostrados). A bajas temperaturas (6 C) todos los
genotipos formaron rosetas normales (Fig. 3.12) ya que no se observ elongacin del
primer entrenudo basal para ningn caso (Tabla 3.12).
Si bien el hbito de hacer rosetas en los mutantes phyB cry] y phyA phyB cry] fue
totalmente dependiente de la temperatura, la elongacin de los hipocotilos en plntulas
jvenes de estos mutantes fue evidente tanto a bajas como altas temperaturas (Tabla 3.3).
Otra diferencia entre plntulas jvenes y plantas ms maduras fue que el hipocotilo del
doble mutante phyA phyB fue ms largo que en el simple mutante de phyB, y el del triple
mutante phyA phyB cry] fue ms largo que el del doble mutante phyB cry]. En otras
palabras, el efecto de la mutacin de phyA fue evidente en la elongacin del hipocotilo pero
no se observ un efecto sobre la elongacin de los entrenudos.
Resultados 56
A estas temperaturas, el primer entrenudo en ausencia de phyB y cryl ya estaba
elongado mientras que las plantas WT comenzaron la extensin en el quinto (20 C) o
cuarto (20/30 C) entrenudo (datos no mostrados). A bajas temperaturas (6 C) todos los
genotipos formaron rosetas normales (Fig. 3.12) ya que no se observ elongacin del
primer entrenudo basal para ningn caso (Tabla 3.12).
Si bien el hbito de hacer rosetas en los mutantes phyB cry] y phyA phyB cry] fue
totalmente dependiente de la temperatura, la elongacin de los hipocotilos en plntulas
jvenes de estos mutantes fue evidente tanto a bajas como altas temperaturas (Tabla 3.3).
Otra diferencia entre plntulas jvenes y plantas ms maduras fue que el hipocotilo del
doble mutante phyA phyB fue ms largo que en el simple mutante de phyB, y el del triple
mutante phyA phyB cry! fue ms largo que el del doble mutante phyB cry] . En otras
palabras, el efecto de la mutacin de phyA fue evidente en la elongacin del hipocotilo pero
no se observ un efecto sobre la elongacin de los entrenudos.
Resultados 56
Genotpo Longitud del hipocotilo (mm)
6 C 20 C 20-30 C
de 13 repeticiones.
Resultados 57
Genotipo Nmero total de hojas
6 C 20 C 20-30 C
Resultados 58
plntulas fueron transferidas a 25 C donde se observ un rpido incremento en la
elongacin del tallo de los mutantes phyB ay] (Fig 3.13).
La diseccin del pice indic que el alargamiento del tallo se produjo antes de la
transicin del pice del estado vegetativo al estado reproductivo (Fig. 3.13). En el WT, la
elongacin del tallo no se detect incluso luego de varios das de haberse producido la
transicin del pice al estado reproductivo (Fig. 3.13). Esto es consistente con la
observacin que la elongacin de la inorescencia y el alargamiento del tallo ocurren slo
luego de que se forman cuatro a siete yemas cubiertas por spalos en el pice (Smyth et aL,
1990).
Resultados 59
3.3 INTERACCIONES ENTRE PHYA, PHYB,CRY1 Y CRY2 EN CONDICIONES
DE RADIACIN NATURAL
Resultados 60
1 o . ' ' v
l -'\\q\\ 0.33:0.04 Figura 3.14. Longitud de los
1.):\ I ! hipocotilos relativa a la de los controles
o5.; N45: 0.01
\ki l en oscuraidad en el WT, y mutantes
o o WT " i l phyA PhyB
Luz solar
h\
pln'ls
('11 phyA
plin
rlj'l
('Iji'l
phyA
1)]:le
Resultados 61
(P< 0.05). Esta caracterstica no se observ en ninguno de los dos simples mutantes (Fig.
3.14A). La redundancia observada podra ser explicada por la interaccin antagnica
observada en condiciones controladas entre el phyA actuando en la forma VLFR sobre el
LFR del phyB (Fig. 3.1). El phyA activado en su forma VLFR produce por un lado la
inhibicin del alargamiento del hipocotilo, y por otro lado reprime la accin del phyB sobre
esta misma respuesta (Fig. 3.1). Por esta razn el fenotipo del simple mutante phyA no
presenta diferencias con respecto al WT. Sin embargo, en ausencia del phyB se pierde el
efecto negativo del phyA sobre el phyB (diferencia en los hipocotilos entre el phyB y el
phyA phyB). La respuesta del VLFR podra operar en plntulas expuestas a la luz solar ya
que se encontrara muy por arriba del mnimo requerimiento de luz necesario para inducir
este tipo de respuestas.
A bajas irradiancias la actividad del cry] es obvia en presencia del phyB y ausencia del
phyA
El comportamiento del doble mutante de phyA cry] no puede ser explicado por el
comportamiento de los simples mutantes. La pendiente del mutante cry] se redujo mientras
que la del doble mutante phyA cry] no se vio afectada comparada con la del WT (Fig.
3.14A). En otras palabras, en los ujos ms bajos, el mutante de phyA, y el mutante de cry]
mostraron la misma inhibicin del crecimiento del hipocotilo que el WT, mientras que la
doble mutante phyA cry] fue mayor (Fig. 3.14A). Esto indicara que la actividad el cryl
podra ser observada no slo a altas sino tambin a bajas irradiancias. Sin embargo, la
actividad del cryl a 5% de luz solar no fue evidente ni en la ausencia de phyB (diferencia
en la inhibicin de los hipocotilos entre el phyB c021 y el mutante phyB) ni en la presencia
de phyA (diferencia en la inhibicin de los hipocotilos entre el WT y el mutante cryl). El
requerimiento de phyB es consistente con observaciones realizadas bajo condiciones
controladas que mostraron que la actividad del cryl necesita phyB activo cuando las
condiciones de luz son sub-ptimas, es decir que el cryl y el phyB operan
sinergsticamente (Casal y Mazzella, 1998). El requerimiento de la mutacin de phyA
podra resultar del hecho que el phyA actuando en su forma HIR tambin puede operar
sinergsticamente con el phyB (Casal, 1995; Cerdn et al., 1999; Hennig et al., l999a). En
Resultados 62
otras palabras el phyA y el cryl podran ser redundantes en su interaccin sinergstica con
el phyB. An el S % de irradiancia contendra la suciente cantidad de RL para activar al
phyA va HIR (Casal, 2000).
La actividad del cryZ es evidente en ausencia del cry] y presencia de phyA y phyB
Bajo luz solar directa, el mutante de cry2 no mostr diferencias con el WT, pero el
doble mutante cry] cry2 fue ms alto que el simple mutante de cry! (Fig. 3.15A). El cry2
es capaz de inhibir el crecimiento del hpocotilo en ausencia del cryl indicando que ambos
fotorreceptores actan redundantemente. La respuesta del cry2 no mostr dependencia de la
irradiancia (Fig. 3.15B). El efecto de la mutacin de cryZ fue obvia en la ausencia de cryl
pero no en la ausencia simultnea de phyA y cryl, phyB y cryl o phyA, phyB y cryl (Fig.
3.15C). Es decir, que la inhibicin del hpocotilo mediada por el cry2 requiere la ausencia
de cryl y la presencia simultnea de phyA y phyB. Estos resultados fueron consistentes con
aquellos obtenidos en laboratorio con plntulas expuestas a fotoperodos largos de luz
blanca (Fig. 3.5). Este comportamiento se asemeja en algn punto a los efectos del cry2
sobre la induccin de la oracin, donde el cry2 y el cryl son tambin redundantes y el
cry2 requiere la presencia de phyB (Lin et aL, 1998). Sin embargo, hay una diferencia
importante, ya que el rol del cry2 en las respuestas de floracin es dominante sobre el de
cryl. En condiciones controladas, la inhibicin del crecimiento del hpocotilo mediada por
el cry2 ha sido documentada en plntulas cultivadas a muy bajos ujos de luz azul (Lin et
aL, 1998). La deficiencia a ujos altos ha sido explicada por la reduccin de los niveles de
la protena cry2 en luz azul (Lin et aL, 1998). Los efectos observados an bajo luz solar
directa podran eventualmente reejar la reacumulacin de cry2 durante la noche.
Resultados 63
Luz solar directa
Figura 3. 15. A. Plntulas del WT, y los
mutantes cry], 0322y cry] cry2 cultivados
bajo luz solar. (100%). O: controles de
oscuridad. B. Longitud del hpocotlo dc los
mutantes cry] y cry! (322cultivados bajo
distintos ujos de raiacin natural (escala
logaritmca. C. Efectos de la mutacin
cry2 en la longitud dcl hipocotlo cn
diferentes backgmzmds bajp luz solar
(100 00). Las barras vacas representan el
background de CR Y2,las barras rayadas
+ cry1
1.0s --D-cry1c1y2 representan el background de cry2.
oscuridad
.0 UI 1
hipocotilos
de
los
Largo
relativos
controles
los
dea
0.50
oscuridad
controles
de
0.25s
relalivo
hipocolilo
del
Largo
los
a
Cry1 cry2
cry1 phyA
cry1 phyA
cry2
cry1 phyB
cry1 phyB
cry2
cry1 phyB
phyA
cry1 phyB
cry2
phyA
cry1
Resultados 64
podra ser un candidato (Aukerman eta1., 1997). Sin embargo, el efecto residual en el
cudruple mutante fue observado bajo radiacin natural pero no bajo luz articial (Fig.
3.5). Esto sugerira que las longitudes de onda corta (proporcionalmente ms importantes
bajo luz solar que en las fuentes de laboratorio) podran ser percibidas por fotorreceptores
nuevos (por ejemplo UV-B).
Plntulas del WT, mutantes de phyA, phyB y cry] y todos los dobles y triples
mutantes fueron expuestas durante 6 das a diferentes fotoperodos (11 h o 5 h) (Fig. 3.16).
Las plntulas WT cultivadas bajo fotoperodos ms largos produjeron hipocotilos ms
cortos (Fig. 3.16). La respuesta al fotoperodo fue similar al WT en cualquiera de los
simples y dobles mutantes (Fig. 3.16). El triple mutante phyA phyB cry] fue el nico
mutante que fall en la inhibicin del crecimiento del hipocotilo en respuesta a
fotoperodos ms largos (Fig.3.16). As, el phyA, phyB y cryl fueron mutuamente
redundantes en la inhibicin del crecimiento del hipocotilo en respuesta al fotoperodo.
W yA
ph ph
yB cry1 :i
phyB
phyA phyA
cry1 phyB
cry1 _
phyA
phyB
.ry1
Resultados 65
doble mutante cry] cryZ fueron expuestos a fotoperodos de l l h o 5 h (Fig. 3.17). La
respuesta al fotoperodo fue normal en los simples mutantes cry] y cry2 pero se redujo
signicativamente (P< 0.05) en el doble mutante cry] cryZ (Fig. 3.17). Es decir, que el cryl
y el cry2 fueron redundantes en el control del crecimiento del hipocotilo en respuesta al
fotoperodo. La respuesta al fotoperodo mediada por el cry2 se pierde en el triple mutante
phyA phyB cry] (Fig. 3.16), apoyando la idea que el cry2 requiere la presencia de phyA y
phyB.
1 nn
g l: Fotoperodo(11h)
Ig Fotoperodo (5 h) Figura 3.17. Longitud del hipocotilo en el
( 0.75 WT y los mutantes cry], cryZ y cry! cryZ,
o
8 cultivados bajo distintos fotoperodos de
8 0.50
radiacin natural.
m 0.25- g
2
hipocotilo
relativo
Largo
del
a
r] \
_
g b cry2
c1y1
El efecto de la irradiancia
Resultados 66
cry], no fueron observados en el background de phyA PHYB cry], PHYAphyB cry! o
phyA phyB cry] (Fig. 3.15C). Por lo tanto el cry2 no interere en los clculos anteriores.
Comparado con el modelo aditivo (suma independiente de la actividad de cada
fotorreceptor), el modelo incluyendo interacciones reduce la pendiente de la relacin entre
inhibicin del crecimiento del hipocotilo e irradiancia en un 44 % (Fig. 3.18). Es decir, que
las interacciones entre phyA, phyB y cryl pueden proveer homeostasis contra cambios en
la irradiancia.
.L D3
Ja"
U" l 0.45:0.01 yx
UI O
l
0.251- 0.04
hipocotilo
(%)
N U1 l
crecimiento
del
Inhibicin
5 1o 32 160
Radiacin solar (%)
Figura 3.18. El impacto de las interacciones entre el phyA phyB y cryl en el alargamiento del
hipocotilo bajo diferentes irradiancias de luz natural. Los efectos individuales del phyA, phyB y
cryl y las interacciones entre ellos (lnea slida) fueron calculados como la diferencia en los largos
de los hipocotilos (relativos a los controles en oscuridad) entre el triple mutante phyA phyB cry] y
el WT para cada nivel de irradiancia. Los efectos de phyA, phyB y cryl en la ausencia de
interacciones (lnea punteada) fueron calculados como las diferencias en los largos de los
hipocotilos (relativos a los controles de oscuridad) entre los mutantes phyA phyB cry] y phyB cry],
mas la diferencia entre el phyA phyB uy] y phyA cry], ms la diferencia entre el phyA phyB cry] y
phyA phyB para cada nivel de irradiancia. Se muestran los valores de las pendientes :t EE.
El efecto delfotoperodo
Resultados 67
de phyA, phyB y cryl y sus interacciones. La suma de las respuestas al fotoperodo en los
mutantes phyB cry], phyA cry] y phyA phyB da una estimacin de la accin del phyA,
phyB y cryl sin interacciones (en estos backgrounds el cry2 no es efectivo). Las
interacciones entre phyA, phyB y cryl causaron un 70% de reduccin del efecto del
fotoperodo (Fig. 3.19). Es decir, que las interacciones entre phyA, phyB y cryl pueden
proveer homeostasis contra los cambios en la longitud de] fotoperodo.
_ 1nn
'80) CA
9os
830V
._,-,88
ECI-"ot 75
0.990
9.9630
o c o. 8 50- T
EDU
020.8
.85m8
2988):; 25
.429ch
2.E-
E
n
l;|
con interacciones sin interacciones
Figura 3.19. El impacto de las interacciones entre el phyA phyB y cryl en el alargamiento del
hipocotilo en respuesta a fotoperodos largos comparados con fotoperodos cortos. Los efectos
individuales del phyA, phyB y el cryl y las interacciones entre ellos fueron calculados como la
diferencia en los largos de los hipocotilos (relativos a los controles en oscuridad) entre el WT
cultivado en fotoperodos largos y fotoperodos cortos. Los efectos de phyA, phyB y cryl en la
ausencia de interacciones fueron calculados como la suma de la respuesta al fotoperodo de los
mutantes phyB uy], phyA cry] y phyA phyB .
El efecto del cry2 fue indetectable en presencia del phyA, phyB y cryl (WT
comparado con el mutante cry2) pero tambin fue indetectable en ausencia de phyA, phyB
y cryl (phyAphyB cry] comparado con phyA phyB cry! cry2). Es decir, que el balance de
las interacciones que involucran al cry2 es nulo. Si el anlisis se restringe a las
interacciones entre cryl y cry2, la redundancia entre estos fotorreceptores no afecta la
respuesta a la irradiancia (el cry] y el doble mutante cry] cry2 tienen la misma pendiente
Resultados 68
de respuesta, Fig. 3.15B) pero reduce el efecto de los fotoperodos (Fig. 3.17). De hecho, la
respuesta al fotoperodo del WT menos la respuesta del doble mutante cry] cryZ (efecto del
cryl y del cry2 ms interacciones) es menor que la respuesta del mutante cry] menos la
respuesta del cry] cryZ (efecto del cry2 solo) ms la respuesta del cryZ menos la respuesta
del cry] cryZ (efecto del cryl solo).
4. DISCUSIN
Las plantas obtienen informacin del ambiente que las rodea, mediante la
percepcin de los cambios en la cantidad, calidad y direccin de la luz, que se traducen en
modicaciones en el estado de los fotorreceptores, y as ajustan sus patrones de crecimiento
y desarrollo. Los fitoconnos (phyA y phyB), que perciben principalmente luz R y RL y los
crptocromos (cryl y cry2), que perciben la luz azul y UV-A, son los dos sistemas de
fotorreceptores fotomorfognicos hasta el momento identicados y clonados, y por lo tanto
los ms estudiados.
Para acomodar el metabolismo y el desarrollo a las condiciones ambientales las
plantas integran diferentes estmulos con seales internas. Hasta hace unos aos atrs, las
secuencias de los caminos bioqumicos iniciados luego de la percepcin eran representados
como cascadas independientes de sealizacin. La evidencia experimental comienza a
mostrar, sin embargo, que la interaccin entre los caminos de transduccin es significativa
en plantas. Por ejemplo, se ha observado interaccin entre los caminos de transduccin
iniciados por la percepcin de luz R y los derivados por el ataque de patgenos en el
control del sistema de defensa (Genoud et aL, 1998), entre los caminos iniciados por la luz
y la sacarosa en la des-etiolacin (Dijkwel et aL, 1997), entre las seales ontognicas, la luz
y la temperatura en el control de la oracin (Levy y Dean 1998), y entre sistemas de
fotorreceptores en el control de distintos aspectos del desarrollo (Casal, 2000). El anlisis
del comportamiento de los mutantes mltiples realizado en esta tesis ha permitido explorar
el circuito de sealizacin de los fotorreceptores y revelar funciones no conocidas de los
mismos. As mismo, los experimentos realizados en condiciones de radiacin natural
proveen un nuevo escenario en relacin al signicado ecolgico de las interacciones.
4.1 El phyA media las respuestas a muy bajos ujos de luz R continua.
Discusin 70
de accin de los fitocromos: el VLFR, el LFR y el HIR (Kronenberg y Kendrick, 1986;
Mancinelli, 1994). La primera parte de la respuesta al Rc puede considerarse una respuesta
del tipo VLFR ya que la mxima inhibicin alcanzada fue equivalente a la causada por
RLp (que establecen una muy baja proporcin de Pfr, aproximadamente 2.7 %) (Fig. 3.2 y
3.4). En Arabidopsis, esta primera fase de la respuesta (el VLFR) no fue afectada por la
mutacin de phyB pero fue eliminada en el mutante de phyA y doble mutante de phyA phyB
(Fig. 3.1 y 3.4). En tabaco, la sobreexpresin de phyA aument la respuesta en la regin del
VLFR (Fig. 3.2). Puede concluirse entonces que bajo luz R el phyA acta en el modo
VLFR. La segunda parte de la curva puede considerarse del modo LFR pues este tipo de
respuestas son R/RL reversibles y los tratamientos con Rc pueden ser substituidos por Rp
(efectos inductivos) (Fig. 3.1 y 3.4), adems este efecto puede ser revertido por RLp (Casal
et aL, 1995). La fase correspondiente al LFR es mediada por el phyB y no por el phyA.
Si bien ya se haba demostrado que un pulso de R era capaz de inducir respuestas
del tipo VLFR mediadas por el phyA (Botto et aL, 1996), lo novedoso de las observaciones
presentada aqu radica en demostrar que el R es incapaz hacer actuar al phyA en el modo
HIR, que es el modo de accin del phyA ms importante bajo luz RLc. La caracterstica
distintiva de las respuestas del tipo HIR es que no obedecen la ley de la reciprocidad (los
tratamientos con luz continua son ms efectivos que los pulsos a igual cantidad de fotones
en cada tratamiento) (Mancinelli, 1980). Los Rp fueron igual o incluso ms (no menos)
efectivos que la luz Rc (Fig. 3.1 y Tabla 3.1). Es decir, que usando la falla en la ley de
reciprocidad como criterio, no se observ una respuesta del tipo HIR bajo Rc, y esto es
consistente con observaciones previas realizadas en plntulas etioladas de Sinapz'salba
(Heim y Sch'fer, 1984; 1982; Schfer et aL, 1981). El hecho de que no exista falla en la
reciprocidad en Rc no fue debido a una reduccin en la eciencia del Rc por absorcin de
la clorola (Tabla 3.1). Bajo RLc existe falla de la ley de reciprocidad (Heim y Sch'fer,
1984) y este efecto est mediado por el phyA (Fig. 3.3A y C).
La adicin de Rc a un background de RLc redujo la respuesta HIR provocada por el
RLc (Fig. 3.3B). Bajo luz R se reducen fuertemente los niveles de phyA permitiendo
explicar la ausencia de una respuesta del tipo HIR bajo luz Rc. Sin embargo, por un lado,
en la ausencia de phyB, la inhibicin del crecimiento del hipocotilo mediada por el phyA
puede ser detectada a ujos relativamente altos de Rc (Fig. 3.1); y por el otro, las grandes
Discusin 71
cantidades de phyA en plntulas de tabaco son sucientes para incrementar la inhibicin
del crecimiento del hipocotilo pero no para causar una respuesta del tipo HIR bajo Rc
(Tabla 3.1). Estos resultados han contribuido al desarrollo de la idea que el phyA es capaz
de operar por dos vas de sealizacin diferentes, dando lugar a las respuestas del tipo
VLFR y HIR. Desde la publicacin de estas observaciones (Mazzella et aL, 1997) se han
obtenido evidencias genticas y moleculares a favor de esta idea. Por ejemplo, las
respuestas VLFR y HIR son separables pues la carecterizacin de dos ecotipos naturales de
Arabidopsis, Landsberg erecta y Columbia revel diferencias entre los mismos en las
respuestas VLFR, pero no en las HIR, identicndose dos loci que afectan diferencialmente
a estos modos de accin (Yanovsky et aL, 1997). Por otro lado, el efecto dominante
negativo de la sobreexpresin del phyB sobre el phyA (Short , 1999) afecta slo la va del
HIR (Casal et al.,2000). Adems, deleciones en el promotor de Lhcb 1*2 reducen
signicativamente la respuesta HIR comparada con el VLFR y LFR (Cerdn et aL, 2000).
Finalmente, recientemente han sido aislados mutantes del dominio PASZ del phyA que
retienen respuestas VLFR pero pierden las HIR (Yanovsky, Staneloni y Casal,
comunicacin personal).
Discusin 72
en los siguientes prrafos ste cambia segn el estado del desarrollo, el contexto gentico o
las condiciones ambientales. Sobre este punto tambin volver ms adelante.
4.2.1 Des-etiolacin
Discusin 73
lnteraccion del cry] con el phyAy phyB
Durante la des-etiolacin los efectos del cry2 fueron obvios en ausencia del cryl
indicando el alto grado de redundancia entre estos fotorreceptores (Fig. 3.5, 3.15 y 3.17).
La inhibicin del alargamiento de los hipocotilos mediada por el cry2 fue observada en
ausencia de cryl pero slo en presencia de phyA y phyB (Fig. 3.5, 3.15 y 3.17). Es decir,
que el phyA y el phyB sinergizan la accin del cry2. El patrn de interaccin del cry2 con
phyA y phyB en el control de la apertura de los cotiledones fue diferente, ya que la
actividad del cry2 sobre esta respuesta fue evidente slo en ausencia simultnea de phyA y
phyB, es decir, el phyA y phyB fueron redundantes con el cry2.
Discusin 75
El crecimiento del tallo y el desarrollo reproductivo puede ser desacoplado
Discusin 76
4.2.3 Iniciacin oral
Discusin 77
A Des-etiolacin
RL
R Azul
\\u\.../2
a 7 J
' Casal, 1995, 2 Casal y Boccalandro, 1995; Casal y Mazzella, 1998, 3 esta tesis Mazzella et aL, 1997
4 esta tesis Mazzella et aL, 2001 a y b.
(phyD, phyB?)
.
71k> 0
' Reed el al, 1993, 2 Devlin et al, 1999, 3 Devlin et al, 1998, 4 esta tesis Mazzella et al, 2001b,
5Johnson et al, 1994, Guo et al, 1998, 7Bagnall et al, 1996, 3 Bagnall et al, 1995
Figura l. Modelos genticos del patrn de interacciones entre tocromos y criptocromos durante A) la
des-etiolacin y B) la transicin del estado vegetativo al reproductivo. La explicacin se encuentra en
el texto. > Interacionespositivas . Interaccionesnegativas.
Las referencias bibliogrcas se indican al pie de cada modelo.
Discusin 78
Lint, 1960). La integracin de las seales mediadas por fotorreceptores que regulan el
proceso de floracin est representada en el modelo de la Fig. 4.1B. El cry2 (Guo et aL,
1998), phyA (Johnson et aL, 1994) y cryl (Bagnall et aL, 1996) mediaran el efecto
positivo, mientras que el phyB (Reed et aL, 1993), phyD (Devln et aL, 1999) y phyE
(Devln et aL, 1998) mediaran el efecto negativo. El hecho que el phyA pueda acelerar o
retrasar la floracin y que tanto el mutante de phyB como el sobreexpresante de phyB
(Bagnall et aL, 1995) aceleran la floracin, sugiere que los fotorreceptores podran operar
de manera integrada y ser reguladores positivos o negativos.
Discusin 79
temperatura en el control de diversas respuestas. En Arabdopsis, bajas temperaturas y
tratamientos de luz son necesarios para la induccin de la germinacin de semillas y la
expresin de los genes Fenlalanil Ammona-Lyase y Chalcona Sintetasa (Leyva et aL,
1995).
Durante la des-etiolacin, la interaccin sinrgica entre phyB y cryl fue
condicional al ambiente lumnico. En condiciones sub-ptimas de luz (5% de la luz solar
(Fig 3.14), o exposiciones cortas de R ms azul, Casal y Mazzella, 1998) el phyB y el cryl
interactan sinergsticamente, mientras que en condiciones de luz optimas (100% de luz
solar (Fig. 3.14) o exposiciones prolongadas de R ms azul, Casal y mazzella 1998) sus
efectos se vuelven totalmente independientes.
Trabajos publicados por ste y otros grupos proveyeron una fuerte evidencia
gentica de las interacciones entre los fotorreceptores (ver Fig. 4.1). Esto despert la
inquietud en varios grupos que dedicaron sus esfuerzos a investigar cules podran ser los
mecanismos moleculares de las interacciones.
Las interacciones entre dos cadenas de transduccin podra ser el resultado de la
interaccin a nivel del receptor mismo o en un paso intermediario de las cadenas. Se sabe
que el cryl y el cry2 pueden ser fosforilados por el phyA (Ahmad et al., 1998). Estudios de
interaccin en el sistema de dos hbridos conrman que existe una interaccin fsica entre
los extremos carboxi terminales del phyA y cryl. En las respuestas analizadas en esta tesis
(des-etiolacin, crecimiento vegetativo e iniciacin oral) no hay evidencias de interaccin
entre phyA y cryl , sin embargo se ha encontrado al menos para la prdida de turgencia de
protoplastos de Arabdopss (Wang y Moritoshi, 1997) y la regulacin del ritmo de
expresin de CAB (Devlin y Kay, 2000). En experimentos de co-inmuno-precipitacin en
plantas sobreexpresante de cry2 se observ que el phyB interacta directamente con el cry2
en partculas nucleares que se forman luego de la exposicin a la luz (Mas et aL, 2000).
Finalmente el efecto sinrgico entre el phyB y cryl podra ser parte del resultado de una
mayor traslocacin al ncleo del phyB en presencia del cryl (Gil et aL, 2000). En estos
Discusin 80
casos la interaccin entre tocromos y criptocromos parecera ser el resultado de la
interaccin sica entre las molculas de los mismos.
En un trabajo reciente se muestra que el cudruple mutante phyA phyB cry] cryZ no
muestra defectos en los ritmos circadianos (Yanovsky et aL, 2000c). Sin embargo el
cudruple mutante est severamente afectado en el crecimiento y desarrollo: los hipocotilos
son alargados asemejndose a aquellos de una planta en completa oscuridad (Fig. 3.5), los
cotiledones se abren 20 das ms tarde que el WT y slo parcialmente (Fig. 3.5), las plantas
no forman una roseta normal (Fig. 3.7A); la tasa de produccin de hojas es baja (Fig. 3.6A),
el nmero de ramicaciones es bajo y aparecen en las posiciones superiores (Fig. 3.7C); la
transicin entre el desarrollo vegetativo y reproductivo es temprana medida en una escala
biolgica (Fig. 3.8A) pero tarda en una escala cronolgica (Fig. 3.8B); la estabilidad del
vstago es pobre y como consecuencia las plantas crecen por sobre la supercie del suelo
(Fig. 3.7B); los primeros frutos nos se desarrollan (Fig. 3.7C) y el ciclo de vida es
signicativamente ms largo. Las plantas cultivadas en completa oscuridad en un medio
conteniendo azcares, son capaces de desarrollarse y orecer (Roldan et al., 1999), a pesar
de no haber actividad de los pigmentos fotosntticos o fotorreceptores. Esta tesis resalta la
contrubucin del phyA phyB, cryl y cry2.
Discusin 81
Damme la des-etiolado" la interaccon entrefotorreceptores genera homeostasis de la
informacin
Discusin 82
La redundancia yjerarquas entre genes concilia la estabilidad y la modulacin a Ia luz
durante el desarrollo Arabidopss
Los resultados presentados en esta tesis muestran que los roles de phyA, phyB,
cryl y cry2 afectan diferentes etapas del desarrollo, sin embargo, muchos de estos efectos
fueron evidentes solo en mltiples mutantes, indicando redundancia en el control del
desarrollo. La redundancia es entonces considerada una fuente de estabilidad (Hartman et
al., 2001).
Los fotorreceptores se acoplan durante el crecimiento y desarrollo con diferentes
jerarquas. Evidentemente el phyB contribuye fuertemente en todos los procesos del
desarrollo (des-etiolacin, crecimiento vegetativo y oracin), ya que el simple mutante
presenta defectos durante todo el ciclo de vida. El phyB y el cryl son los fotorreceptores
ms importantes durante el proceso de des-etiolacin bajo luz solar directa (Yanovsky ez
al., 1995) (Fig. 3.14), mientras que la contribucin del phyA (Yanovsky et al., 1995) (Fig.
3.14) y cry2 (Fig 3.15) no es evidente. Bajo canopeos densos ricos en RL la contribucin de
estos fotorreceptores cambia y la des-etiolacin esta mediada exclusivamente por el phyA
(Yanovsky et al., 1995). El cry2 por otra parte es el ms efectivo en la promocin de la
transicin del estado vegetativo al reproductivo (Guo et al., 1998).
La jerarqua relativa de los fotorreceptores depende fuertemente del contexto del
desarrollo. Para la expresin del promotor del Lhcb1*2 el efecto de la mutacin de cryZ fue
mayor que aquella provocada por la mutacin cryl en el background PH YAPHYB pero el
patrn complementario se observ en el background phyA phyB (Cerdn , 1999). En la
ausencia simultnea de phyA y phyB, el cryl, phyD y phyE son todos necesarios para
suprimir la elongacin del entrenudo (Devlin et al., 1998; Devlin et al., 1999) (Tabla 3.2).
Para el alargamiento del entrenudo, la mutacin de phyA tuvo efectos pequeos en el
background de phyB cry] pero fue crtica en el background phyB phyE (Devlin et al.,
1999). Sin embargo, los efectos de la mutacin de phyA aumentaron la extensin del
hipocotilo durante la des-etiolacin an en el background de phyB y cry] (Tabla 3.3).
La jerarqua de los distintos fotorreceptores podra ser el resultado de distintas
compartimentalizacin subcelular, estabilidad de la protena y/o la eciencia en el camino
de transduccin (Cashmore et al., 1999; Guo et al., 1998; Kleiner et al., 1999). Una alta
Discusin 83
jerarqua del cry2 podra conferir regulacin fotoperidca a un proceso dado (como
oracin), mientras que una alta jerarqua del phyB podra resultar en la modulacin del
patrn de desarrollo por la percepcin de R/RL.
En muchos procesos en plantas, como en el camino de las auxinas, cido abssico,
seales lumnicas y la floracin estn involucradas regulaciones negativas. La mayora de
las respuestas de las plantas a las seales ambientales que percibe son irreversibles, y
lentas, para permitir as un reaseguro mltiple. Esto podra explicar el hecho que las plantas
controlen un gran nmero de procesos a travs de regulaciones negativas controlando el
grado de respuesta. En sistemas animales, por ejemplo, las regulaciones negativas permiten
reajustar el desarrollo cuando hay perturbacin (Golembo et aL, 2000). Para la inhibicin
del alargamiento del hipocotilo durante la des-etiolacin en respuesta a la irradiancia o al
fotoperodo, las interacciones negativas fueron ms fuertes que las positivas, ya que se
produjo como resultado neto (balance entre interacciones positivas y negativas) la
reduccin del grado de inhibicin de] alargamiento del hipocotilo (Fig. 3.18 y 3.19).
En conclusin, mientras que la redundancia y la regulacin negativa podran
prevenir patrones aberrantes del desarrollo (como aquel observado en el cudruple mutante)
en condiciones ambientales extremas; es decir, permitiran mantener la estabilidad, la
jerarqua de los fotorreceptores tendran como consecuencia la modulacin de aspectos
especficos del crecimiento y desarrollo por seales lumnicas particulares.
4.6 CONCLUSIONES
Discusin 84
con regulaciones positivas y negativas. El balance neto de las interacciones en general
muestra que las regulaciones negativas son ms iertes generando un alto grado de
redundancia entre los fotorreceptores. La redundancia es una fuente de estabilidad contra
variaciones en el ambiente que no forman parte de las seales que desencadenan o modulan
el desarrollo de las plantas. El phyA, phyB, cryl y cry2 se acoplan durantre el desarrollo
,
con diferentes jerarquas que permiten un patrn de crecimineto y desarrollo especcos en
condiciones particulares de] ambiente luminoso.
M
la
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