CAPTULO 3 - Overview and Concepts (Viso geral e conceitos)

A sequenciao do DNA do genoma humano e dos genomas de muitos organismos modelo gerou considervel
entusiasmo dentro da comunidade biomdica e do pblico em geral nos ltimos anos. Essas "plantas" genticas
que exibem as regras bem aceitas da herana mendeliana esto agora disponveis para uma inspeo mais
prxima, abrindo a porta para uma melhor compreenso da biologia humana e da doena. Este conhecimento
tambm est gerando uma nova esperana para novas estratgias teraputicas e de tratamentos. No entanto,
permanecem muitas questes fundamentais. Por exemplo, como o desenvolvimento normal prossegue, uma vez
que cada clula tem a mesma informao gentica, porm, segue um caminho de desenvolvimento diferente,
realizado com exata preciso temporal e espacial? Como uma clula decide quando dividir e diferenciar, ou
quando manter uma identidade celular inalterada, respondendo e expressando de acordo com seu programa
normal de desenvolvimento? Erros feitos nos processos acima podem levar gerao de estados patolgicos
como o cncer. Esses erros so codificados em planos genticos defeituosos que herdamos de um ou de ambos
os nossos pais, ou existem outras camadas de informaes regulatrias que no esto sendo devidamente lidas
e descodificadas?
Nos seres humanos, a informao gentica (DNA) est organizada em 23 pares de cromossomos, constitudos
por aproximadamente 25.000 genes. Estes cromossomos podem ser comparados a bibliotecas com diferentes
conjuntos de livros que juntos instruem o desenvolvimento de um ser humano completo. A sequncia de DNA do
nosso genoma composta por cerca de 3 x 109 bases, abreviadas pelas quatro letras A, C, G e T dentro da sua
sequncia, dando origem a palavras bem definidas (genes), frases, captulos e livros. No entanto, o que
determina quando os diferentes livros so lidos, e em que ordem, permanece longe de ser clara. O encontro com
este desafio extraordinrio provvel que revele percepes sobre como os eventos celulares so coordenados
durante o desenvolvimento normal e anormal.
Quando somada em todos os cromossomos, a molcula de DNA em eucariotos superiores de cerca de 2
metros de comprimento e, portanto, precisa ser maximamente condensada cerca de 10.000 vezes para caber no
ncleo de uma clula, o compartimento de uma clula que armazena nosso material gentico. O envolvimento do
DNA em torno de "bobinas" de protenas, as chamadas protenas de histonas, fornece uma soluo elegante
para este problema de embalagem, dando origem a uma protena de repetio: polmero de DNA conhecido
como cromatina. No entanto, ao empacotar o DNA para melhor se encaixar em um espao confinado, um
problema se desenvolve, assim como quando se empacota muitos livros nas prateleiras da biblioteca: torna-se
mais difcil encontrar e ler o livro de escolha e, assim, um sistema de indexao necessrio. A cromatina, como
uma plataforma de organizao do genoma, fornece essa indexao. A cromatina no uniforme na sua
estrutura; Ele vem em diferentes designs de embalagens de uma fibra de cromatina altamente condensada
(conhecida como heterocromatina) para um tipo menos compactado onde os genes so tipicamente expressos
(conhecido como eucromatina). A variao pode entrar no polmero bsico da cromatina atravs da introdues
de protenas histonas incomuns (conhecidas como variantes de histonas), estruturas de cromatina alteradas
(conhecidas como remodelao da cromatina) e a adio de sinalizadores qumicos s prprias protenas
histonas (conhecidas como modificaes covalentes). Alm disso, a adio de um grupo metilo diretamente a
uma base de citosina (C) no molde de DNA (conhecido como metilao do DNA) pode proporcionar locais de
ancoragem para protenas para alterar o estado da cromatina ou afetar a modificao covalente das histonas
residentes. Evidncias recentes sugerem que os RNA no codificadores podem "guiar" regies especializadas do
genoma em estados de cromatina mais compactados. Assim, a cromatina deve ser vista como um polmero
dinmico que pode indexar o genoma e potencializar os sinais do ambiente, determinando em ltima anlise
quais genes so expressos e quais no so.
Juntas, essas opes regulatrias fornecem cromatina um princpio organizador para genomas conhecidos
como "epigentica", o tema deste livro. Em alguns casos, os padres de indexao epigentica parecem ser
herdados atravs de divises celulares, fornecendo "memria" celular que pode estender o potencial de
informao hereditria do cdigo gentico (DNA). A epigentica pode assim ser estreitamente definida como
alteraes na transcrio do gene atravs da modulao da cromatina, que no provocada por alteraes na
sequncia de DNA.
Nesta viso geral, explicamos os conceitos bsicos de cromatina e epigentica, e discutimos como o controle
epigentico pode nos dar pistas para resolver alguns mistrios de longa data, como a identidade celular, a
tumorignese, a plasticidade das clulas-tronco, a regenerao e o envelhecimento. medida que os leitores se
debruam sobre os captulos que se seguem, encorajamo-los a notar a vasta gama de fenmenos biolgicos
descobertos numa gama diversificada de modelos experimentais que parecem ter uma base epigentica (no-
DNA). Compreender como a epigentica opera em termos mecanicistas provavelmente ter implicaes
importantes e de longo alcance para a biologia humana e para as doenas humanas nesta era "ps-genmica".

1- GENTICA Versus EPIGENTICA

A determinao dos detalhes estruturais da dupla hlice do DNA uma das descobertas mais importantes em
toda a biologia. O DNA a principal macromolcula que armazena informao gentica (Avery et al., 1944), e
propaga essa informao armazenada para a prxima gerao atravs da linha germinal. Desta e outras
descobertas, o Dogma central" da biologia moderna surgiu. Este dogma encapsula os processos envolvidos na
manuteno e traduo do modelo gentico necessrio para a vida. Os estgios essenciais so:
1- auto-replicao do DNA pela replicao semiconservativa;
2- transcrio numa direo unidirecional 5' para 3', modelada pelo cdigo gentico (DNA), gerao de
um RNA mensageiro intermedirio (mRNA);
3- traduo de RNAm para produzir polipeptdios consistindo em cadeias amino a carboxil lineares de
aminocidos que so colineares com a ordem 5 'para 3' de DNA.

O dogma central acomoda o feedback do RNA ao DNA pelo processo de transcrio reversa, seguido pela
integrao em DNA existente (como demonstrado por retrovrus e retrotransposons). No entanto, este dogma
rejeita o feedback da protena ao DNA, embora uma nova reviravolta para o dogma gentico so as protenas
raras, conhecidas como prions, que podem ser herdadas na ausncia de um molde de DNA ou RNA. Assim,
estas protenas auto-agregadas especializadas possuem propriedades que se assemelham a algumas
propriedades do prprio DNA, incluindo um mecanismo de replicao e armazenamento de informao (Cohen e
Prusiner, 1998; Shorter e Lindquist, 2005). Alm disso, evidncias emergentes sugerem que uma frao
notavelmente grande de nosso genoma transcrita em RNAs "no codificantes". A funo destes RNAs no
codificantes (isto , codificadores que no codificam protenas exceto RNAt, rRNAs, snoRNAs) est sob
investigao ativa e est apenas comeando a ficar clara num nmero limitado de casos.
A origem da epigentica decorre de estudos de longa data de padres de herana aparentemente
anmalos (isto , no-mendeliana) e dspares em muitos organismos (ver captulos 1 e 2 para uma viso
histrica). Na herana mendeliana clssica de traos fenotpicos (por exemplo, cor, nmero de dgitos ou
insuficincia de hemoglobina) resulta de diferenas allias causadas por mutaes na sequncia de DNA.
Coletivamente, as mutaes so base da definio das caractersticas fenotpicas, o que contribui para a
determinao dos limites entre espcies. Esses limites so ento moldados pelas presses da seleo natural,
explicado pela teoria da evoluo de Darwin. Esses conceitos colocam as mutaes no corao da gentica
clssica. Em contraste, a herana no mendeliana (por exemplo, variao de crescimento embrionrio, colorao
da pele do mosaico, aleatoriedade X inativao, paramutao da planta) (Fig. 1) pode manifestar, usando um
exemplo, a partir da expresso de apenas de um nico (de dois) alelos dentro do mesmo ambiente nuclear.
Importante, nestas circunstncias, a sequncia de DNA no alterada. Isto distinto de outro padro de herana
no-mendeliana que surge da herana materna mitocondrial (Birky, 2001).
O desafio para a pesquisa epigentica a regulao seletiva de um alelo dentro de um ncleo. O que
distingue dois alelos idnticos, e como essa distino estabelecida e mantida mecanicamente atravs de
sucessivas geraes celulares? O que origina as diferenas observadas em gmeos monozigticos ("idnticos")
que permite torn-los no totalmente idnticos? A epigentica s vezes citada como uma explicao para as
diferenas nos traos visveis, alm da influncia do ambiente, a dieta e potencialmente outras fontes externas
expresso do genoma (Klar 2004, ver Captulos 23 e 24). Determinar quais componentes so afetados em nvel
molecular, e como as alteraes nesses componentes afetam a biologia humana e as doenas humanas, um
desafio para os futuros estudos.
Outra questo-chave na rea : Quo importante a contribuio de informaes epigenticas para o
desenvolvimento normal? Como os caminhos normais tornam-se disfuncionais, levando ao desenvolvimento
anormal e a transformao neoplsicas (exemplo: cancro)? Como mencionado acima, gmeos "idntico"
compartilham a mesma seqncia de DNA, e como tal, sua identidade fenotpica frequentemente usada para
definir o poder da gentica. No entanto, mesmo gmeos como estes podem apresentar diferenas fenotpicas
exteriores transmitidas por modificaes epigenticas que ocorrem durante a vida dos indivduos (Fraga et al.,
2005). Assim, em que medida a epigentica importante na definio do destino celular, identidade e fentipo
ainda est para ser totalmente compreendido. No caso da regenerao e envelhecimento dos tecidos, ainda no
est claro se esses processos so ditados por alteraes na programao gentica das clulas ou por
modificaes epigenticas. A intensidade da pesquisa em escala global testemunha o reconhecimento de que o
campo da epigentica um uma nova fronteira crtica nesta era ps-genmica.
Em outras palavras, ns somos mais do que a soma de nossos genes (Klar 1998), ou Voc pode
herdar algo alm da sequncia de DNA. Esta a verdadeira excitao da gentica atual (Watson 2003). A
motivao para a substituio e deciso de editar este livro foi que acreditamos que ns e todos os contribuintes
deste volume poderamos transmitir essa emoo s futuras geraes de estudantes, cientistas e mdicos, a
maioria dos quais eram conduzidos por princpios genticos, mas no epigenticos, de hereditariedade e
segregao cromossmica.

2- Sistemas Modelo para o Estudo da Epigentica

O estudo da epigentica requer necessariamente modelos, e como muitas vezes o caso, esses
modelos parecem primeira vista, muito distante dos estudos que utilizam clulas humanas (ou de mamferos).
Coletivamente, no entanto, os resultados de muitos sistemas tm produzido uma riqueza de conhecimentos. O
histrico (Captulos 1 e 2) faz referncia a vrias importantes descobertas que emergiram da citologia precoce, do
crescimento da gentica, do nascimento da biologia molecular, e avanos relativamente novos na regulao de
genes mediada por cromatina. Diferentes organismos modelo (Fig. 2) tm sido fundamentais para abordar e
resolver as vrias questes levantadas pela pesquisa epigentica. Na verdade, aparentemente descobertas
epigenticas dspares feitas em vrios modelos de organismos tm servido para unir a comunidade de pesquisa.
O objetivo desta seo destacar alguns desses principais achados, que so discutidos mais detalhadamente
nos seguintes captulos deste livro. Como os leitores observam essas descobertas, devem concentrar-se nos
princpios fundamentais que as investigaes que utilizam estes modelos de sistemas tm expostos; suas
contribuies coletivas apontam mais conceitos comuns do que detalhes divergentes.
Organismos eucariticos unicelulares e "inferiores" Saccharomyces Cerevisiae, Schizosaccharomyces
pombe e Neurospora crassa - permitem anlises genticas poderosas, em parte facilitadas por um curto ciclo de
vida. Tipo de acasalamento (MAT) que ocorre em S. cerevisiae (Captulo 3) e S. Pombe (Captulo 6) forneceu um
exemplo instrutivo, demonstrando a importncia do controle de genes mediada por cromatina. Na levedura de
brotamento S. cerevisiae, as nicas protenas do regulador silencioso de informao (SIR) demonstraram o
envolvimento de histonas modificadas especficas. Isto foi precedido por experimentos elegantes usando gentica
para documentar a participao ativa de protenas histonas na regulao gnica (Clark-Adams et al., 1988, Kayne
et al. 1988). No fermento de S. pombe, os padres de modificao das histonas operam com a ativao e
represso de sinais que so notavelmente semelhantes aos dos organismos metazorios. Isto abriu a porta para
uma grade de produtos gnicos utilizados para suprimir ou aumentar o silenciamento de genes. Mais
recentemente uma variedade de percepes mecanicistas ligando o RNA de interferncia (RNAi) com a induo
de modificaes de histonas agindo para reprimir a expresso gnica foi descoberta em levedura de fisso (Hall
et al., 2002, Volpe et al., 2002). Posteriormente, o mecanismo RNAi tambm estava implicado no silenciamento
gnico transcricional na planta Arabidopsis Thaliana, destacando a importncia potencial desta regulao em
uma ampla gama de organismos (ver Seo 10).

Biologia epigentica: Twins = gmeos / Barr body = Corpsculo de Barr / Polytene chromosomes: cromossomos
politnicos / Yeast mating types: tipos de acasalamento de leveduras / Blood smear: esfregao sanguneo /
Tumor tissue: tecido tumoral / Mutant plant: planta mutante / Clone cat: gatos clonados.

Figura 1. Exemplos biolgicos de fentipos epigenticos

Fentipos epigenticos em uma variedade de organismos e tipos de clulas, todos atribuveis a diferenas no
genticas. Gmeos: ligeiras variaes parcialmente atribuveis epigentica ( Randy Harris, Nova York).
Corpsculo de Barr: O epigeneticamente silenciamento do cromossomo X em clulas de mamfero fmea,
visvel citologicamente como heterocromatina condensada. Cromossomos Politnicos: Cromossomos
gigantes em glndulas salivares de Drosophila, ideal para correlacionar genes com marcadores epigenticos
(reeditado de Schotta et al. 2003 [ Springer]). Tipo de acasalamento de leveduras: o sexo determinado
pelo locus MAT ativo, enquanto cpias de ambos os genes do tipo de acasalamento so epigeneticamente
silenciado ( Alan Wheals, Universidade de Bath). Esfregao sanguneo: clulas heterogneas do mesmo
gentipo, mas epigeneticamente determinada a servir diferentes funes (cortesia do Prof. Christian Sillaber).
Tecido tumoral: clulas metastticas (esquerda) apresentando nveis elevados de marcadores epigenticos na
seo tecidual (reimpresso, com permisso, de Seligson et al. 2005 [ Macmillan]). Planta mutante:
Epifentipos florais de Arabidopsis, geneticamente idnticos e com mutaes epigenticas (reimpressas, com
Permisso, de Jackson et al. 2002 [ Macmillan]). Gato clonado: geneticamente idntico, mas com variaes
do fentipo da cor da pelagem (reimpresso, com permisso, de Shin et al. 2002 [ Macmillan]).
Figura 2. Organismos modelo usados em Pesquisa Epigentica.
Representao esquemtica de organismos-modelo utilizados na pesquisa epigentica. S. cerevisiae: mudana
de tipo de acoplamento para estudo controle epigentico da cromatina. S. pombe: O silenciamento gentico
variado manifesta-se em setoriais de colnias. Neurospora crassa: Epigentica os sistemas de defesa do
genoma incluem repetio induzida mutao pontual, quelling, e silenciamento meitico de DNA no
emparelhado, revelando uma interao entre as vias RNAi, DNA e metilao de histonas. Tetrahymena:
Cromatina em somticos e os ncleos da linha germinativa so distinguidos por mecanismos regulados.
Arabidopsis: Modelo de represso por DNA, histona, e mecanismos de silenciamento guiados por RNA. Milho:
Modelo para imprinting, paramutation, e silenciamento de genes induzido por transposo. C. elegans: Regulao
epigentica no germe linha. Drosophila: Variedade de posio-efeito (PEV) manifestado por parcelas clonais de
expresso e silenciamento do gene branco no olho. Mamferos: Inactivao do cromossoma X.

Outros organismos "off-beat" tambm fizeram contribuies desproporcionais para desvendar caminhos
epigenticos que no incio parecia peculiar. As espcies fungcas N. crassa revelaram o fenmeno no-
mendeliano incomum de mutao pontual induzida por repetio (RIP) como um modelo para estudar o controle
epigentico( Captulo 6). Mais tarde, este organismo foi utilizado para demonstrar o primeira conexo entre
modificaes de histonas e metilao do DNA (Tamaru e Selker 2001) , uma concluso mais tarde estendida a
organismos "superiores" (Jackson et al. 2002). Protozorios ciliados tais como Tetrahymena e Paramecium,
comumente usado em laboratrios de biologia como espcimes de microscopia importantes descobertas
epigenticas por causa de seu dimorfismo nuclear nico. Cada clula leva dois ncleos: um macroncleo
somtico que transcricionalmente ativo, e um microncleo da linha germinativa que transcricionalmente
inativo. Usando macroncleos como uma enriquecida fonte de cromatina ativa, a purificao bioqumica da
primeira enzima modificadora de histona nuclear - uma histona acetiltransferase ou HAT- foi feita. (Brownell et al.
1996). Ciliados tambm so bem conhecidos por seu fenmeno peculiar de eliminao programada de DNA
durante o ciclo de vida sexual, desencadeado por pequenos RNAs no codificantes e modificaes de histonas.(
Captulo 7).
Em organismos multicelulares, o tamanho do genoma e complexidade geralmente aumentam de
invertebrados (Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster) ou espcies de plantas (A.thaliana) a superior,
e para alguns, mais relevante, organismos vertebrados (mamferos). Plantas, no entanto, tm sido
fundamentais para o campo da epigentica, uma fonte particularmente rica de descobertas epigenticas
(Captulo 9) que vo desde elementos transponveis e paramutao (McClintock 1951) primeira descrio de
RNAs no codificantes envolvidos no silenciamento transcripcional. As ligaes cruciais entre a metilao do
DNA, modificao das histonas e componentes RNAi veio atravs de estudos de plantas. A descoberta de
epialelos de plantas, com nomes cmicos como SUPERMAN E KRYPTONITE (por exemplo, Jackson et al.,
2002), e vrios genes vernalizadores (Bastow et al., 2004, Sung e Amasino 2004) proporcionaram ainda o
campo de pesquisa com compreenso do papel do desenvolvimento de epigentica e memria celular. As
clulas meristemais tambm ofereceram a oportunidade de estudar questes cruciais tais como a regenerao
somtica e a plasticidade das clulas estaminais ( ver captulos 9 e 11).
Para a compreenso do desenvolvimento animal, a drosophila tem sido uma potncia gentica precoce e
contnua. Baseado no trabalho pioneiro de Muller (1930), muitas mutaes foram geradas no desenvolvimento,
incluindo transformaes hometicas e variegao posio-efeito (PEV), explicados abaixo (veja tambm o
captulo 5).A transformao mutante hometica levaram idia de que mecanismos regulamentares para o
estabelecimento e manter a identidade celular / memria que foi posteriormente mostrado ser regulado pelos
sistemas Polycomb e trithorax (ver captulos 11 e 12). Para o PEV, a atividade do gene ditada pela estrutura
circundante da cromatina e no pela Sequncia primria de DNA. Este sistema tem sido particularmente fonte
informativa para os fatores de dissecao no controle epigentico (captulo 5). Mais de 100 supressores de
variao [Su (var)] genes so acreditados para codificar componentes de heterocromatina. Sem a fundao
estabelecida por esses estudos histricos, a descoberta do primeiro Histona lisina metiltransferases (HKMTs)
(Rea et al. 2000) e os avanos resultantes na metilao da histona lisina no teria sido possvel. Como
frequentemente o caso em biologia, ecrs comparveis foram realizados em fisso levedura e em plantas,
identificando mutantes silenciadores com conservao funcional dos genes Drosophila Su (var).
O uso de gentica reversa via bibliotecas de RNAi no nematide C. elegans contribuiu para a nossa
compreenso da regulao epigentica no desenvolvimento metazorio. Os estudos abrangentes de
rastreamento do destino celular detalhando todas as vias de desenvolvimento de cada clula, destacou o fato de
que os sistemas Polycomb e trithorax provavelmente surgiram com o surgimento da multicelularidade (ver
sees 12 e 13). Em particular, estes mecanismos de controle epigentico so essenciais para a regulao da
linha germinativa ( ver captulo 15).
O papel da epigentica no desenvolvimento de mamferos tem sido amplamente elucidado no rato,
embora um nmero dos estudos foram traduzidos para diversas clulas linhagens e culturas de clulas
primrias. O advento do gene "Knock-out" e "knock-in" tecnologias tem sido instrumental para a disseco
funcional de reguladores epigenticos chave. Por exemplo, o rato mutante Dnmt1 DNA metiltransferase
proporciona uma viso funcional do papel da metilao do DNA em mamferos (Li et al. 1992). Isto
embrionrio-letal e mostra imprinting prejudicado (ver captulo 18). A interrupo da metilao demonstrou
causar instabilidade genmica e reanimao de atividade de transposo, particularmente em clulas
germinativas (Walsh et al. 1998; Bourchis and Bestor 2004). Existem aproximadamente 100 fatores reguladores
caractersticos da cromatina (I. E., enzimas modificadoras de histona e de DNA, componentes de complexos de
remodelao de nucleossomos e da maquinaria de RNAi) que foram interrompidos no rato. Os Fentipos
mutantes afetam a proliferao celular, comprometimento linhagem, plasticidade das clulas estaminais,
estabilidade genmica, reparao e processos de segregao cromossmica, tanto em linhagens de clulas
germinativas e somticas. No surpreendentemente, a maioria desses mutantes tambm esto envolvidos no
desenvolvimento da doena de cncer. Assim, muitos dos principais avanos no controle epigentico
aproveitaram caractersticas biolgicas nicas expostos por muitos, se no todos, dos organismos modelo. Sem
esses processos biolgicos e a anlise funcional (gentica e bioqumica) que se aprofundaram neles, muitos dos
avanos recentes no controle epigentico permaneceriam indiscritveis.

3 - Definindo a epigentica

A discusso acima sugere a pergunta. Qual o fio comum que permite que diversos organismos eucariticos
estejam conectados com respeito aos princpios epigenticos fundamentais? Diferentes fenmenos epigenticos
esto ligados em grande parte pelo fato de que o DNA no estar "nu" em todos os organismos que mantm um
ncleo verdadeiro (eucariotas). Em vez disso, o DNA existe como um complexo ntimo com protenas
especializadas, que em conjunto compreendem cromatina. Em sua forma mais simples, a cromatina, o DNA
enrolado em torno de unidades nucleossmicas consistindo de pequenas protenas de histonas (Konberg 1974) -
inicialmente foi considerado como uma molcula de empacotamento passivo para envolver e organizar o DNA.
Formas distintivas de cromatina surgem, no entanto, atravs de uma srie de mecanismos covalentes e no
covalentes que esto a ser descobertos a um ritmo rpido (ver Seco 6). Isto inclui uma infinidade de
modificaes histonais ps-traducionais, etapas de remodelao de cromatina dependentes da energia que
mobilizam ou alteram as estruturas dos nucleossomos, o arrastar dinmico de novas histonas (variantes) dentro e
fora dos nucleossomos e o papel de alvo de pequenos RNAs no codificantes. O prprio DNA pode tambm ser
modificado covalentemente em muitos eucariotas superiores, por metilao no resduo de citosina, habitualmente
mas no sempre, dos dinucletidos CpG. Juntos, estes mecanismos fornecem um conjunto de vias inter-
relacionadas que criam variao no polmero de cromatina (Fig. 3). Muitas, mas no todas, destas modificaes e
alteraes de cromatina so reversveis e, portanto, so improvveis de serem propagadas atravs da linha
germinativa. As marcas transitorias so atraentes porque impem mudanas ao modelo de cromatina em
resposta a estmulos intrnsecos e externos (Jaenisch e Bird 2003), e ao faz-lo, regulam o acesso e / ou
processabilidade do mecanismo de transcrio, necessrio para "ler" o modelo de DNA subjacente (Sims et al.,
2004, Captulo 10). Algumas modificaes das histonas (como metilao de lisina), regies de DNA metiladas e
estruturas de nucleossomos alteradas podem, no entanto, ser estveis atravs de vrias divises celulares. Isto
estabelece "estados epigenticos" ou meios de alcanar a memria celular, que permanecem mal apreciados ou
compreendidos.
Nesta perspectiva, as "assinaturas" da cromatina podem ser vistas como um sistema altamente organizado de
armazenamento de informao que pode indexar regies distintas do genoma e acomodar uma resposta a sinais
ambientais que ditam programas de expresso gnica.
A importncia de ter um modelo de cromatina que pode potencializar a informao gentica que ela fornece
camadas multidimensionais para a leitura do DNA. Esta talvez uma necessidade, dado o vasto tamanho e
complexidade do genoma eucaritico, particularmente para organismos multicelulares (ver Seco 11 para mais
detalhes). Em tais organismos, um ovo fertilizado progride atravs do desenvolvimento, comeando com um
nico genoma que se torna programado epigeneticamente para gerar uma multido de "epigenomas" distintos em
mais de 200 tipos diferentes de clulas (figura 4). Esta variao programada foi proposta para constituir um
"cdigo epigentico" que estende significativamente o potencial de informao do cdigo gentico (Strahl e Allis,
2000, Jenuwein e Allis, 2001). Embora esta seja uma hiptese atraente, ns enfatizamos que mais trabalho
necessrio para testar este e teorias provocativas relacionadas. Outros pontos de vista alternativos esto sendo
avanados que argumentam que "cdigos" combinatrios claros, como o cdigo gentico do tripleto, no so
provveis nas histonas ou esto longe de serem estabelecidos (Schreiber e Bernstein, 2002; Henikoff, 2005).
Apesar dessas incertezas, favorecemos a viso geral de que uma combinao de mecanismos covalentes e no
covalentes atuar para criar estados de cromatina que podem ser modelados atravs da diviso celular e
desenvolvimento por mecanismos que esto apenas comeando a ser definidos. Exatamente como esses
estados de cromatina alterados so fielmente propagados durante a replicao do DNA e a mitose permanece
um dos desafios fundamentais de estudos futuros.
As alteraes fenotpicas que ocorrem de clula para clula durante o curso do desenvolvimento em um
organismo multicelular foram descritas por Waddington como a "paisagem epigentica" (Waddington, 1957).
Ainda, o espectro de clulas, de clulas-tronco para clulas totalmente diferenciadas, todos compartilham
seqncias de DNA idnticas, mas diferem notavelmente no perfil dos genes que eles realmente expressam.
Com esse conhecimento, a epigentica passou a ser definida como a "herana nuclear que no se baseia em
diferenas na seqncia do DNA" (Holliday, 1994).
Desde a descoberta da dupla hlice do DNA e das primeiras explicaes da epigentica, nossa compreenso do
controle epigentico e seus mecanismos subjacentes aumentou muito, fazendo com que alguns a descrevam em
termos mais elevados como um "campo", e no apenas como "fenmenos" Wolffe e Matzke, 1999, Roloff e
Nuber, 2005, Captulo 1). Na dcada passada, foram obtidos progressos considerveis em relao s muitas
famlias de enzimas que modificam ativamente a cromatina (ver abaixo). Assim, nos termos modernos de hoje, a
epigentica pode ser molecularmente (mecanisticamente) definida como "a soma das alteraes ao modelo de
cromatina que coletivamente estabelecem e propagam diferentes padres de expresso gnica (transcrio) e
silenciamento do mesmo genoma".
Figura 3: Gentica X Epigentica.
GENTICA: As mutaes (estrelas vermelhas) do molde de DNA (hlice verde) so hereditrias somativamente
e atravs da linha germinativa. Epigentica: As variaes na estrutura da cromatina modulam o uso do genoma
por (1) modificaes de histona (mod), (2) remodelao de cromatina (remodeler), (3) composio variante de
histona (nucleosoma amarelo), (4) metilao do DNA (Me*), (5) RNAs no codificantes. As marcas no molde da
cromatina podem ser hereditrias atravs da diviso celular e coletivamente contribuir para determinar o fentipo
celular.

4- O modelo de Cromatina

O nucleossomo a unidade de repetio fundamental da cromatina (Kornberg 1974). Por um lado, a unidade
bsica de cromatina consiste de um octamero proteico contendo duas molculas de cada histona cannica (ou
histona nuclear) (H2A, H2B, H3 e H4), em torno do qual se envolve 147 pb de DNA. As interaes
intermoleculares detalhadas entre as histonas nucleares e o DNA foram determinadas a partir de estudos de
referncia que conduziram a uma imagem de raio X de resoluo atmica (2,8 ) do nucleossomo montado a
partir de partes recombinantes (Fig. 5) (Luger et al., 1997). As imagens de alta resoluo de mononucleossomos,
bem como estruturas emergentes de ordem superior (tetranucleossomos) (Schalch et al., 2005) continuam a
captar nossa ateno, prometendo explicar melhor o substrato fisiologicamente relevante sobre o qual a maioria,
seno a totalidade, da remodelao da cromatina e transcrio funciona.
As protenas histonas nucleares que compem o nucleossoma so pequenas e altamente bsicas. Elas
so compostas por um domnio globular e caudas de histonas flexveis (relativamente no estruturadas), que
sobressaem da superfcie do nucleosoma (Fig. 5). Com base na sequncia de aminocidos, as protenas
histonas so altamente conservadas a partir de leveduras para seres humanos. Tal grau de conservao suporta
a viso geral de que essas protenas, mesmo os domnios no estruturados, provavelmente serviro a funes
crticas. As caudas, particularmente das histonas H3 e H4, de fato possuem pistas importantes para a
variabilidade nucleosmica (e, portanto, a cromatina), uma vez que muitos dos resduos esto sujeitos a extensas
modificaes ps-traduo (ver o papel final para a nomenclatura padro usada neste livro e apndice 2 para
uma lista de modificaes conhecidas das histonas).
A acetilao e a metilao de histonas nucleares, notadamente H3 e H4, estiveram entre as primeiras
modificaes covalentes a serem descritas, e foram propostas por longo tempo para correlacionar com as
mudanas positivas e negativas na atividade transcricional. Desde os estudos pioneiros de Allfrey e colegas de
trabalho (Allfrey et al., 1964), muitos tipos de modificaes de histonas covalentes foram identificados e
caracterizados; estes incluem fosforilao de histonas, ubiquitinao, sumoylation, ADP-ribosilao, biotinilao,
isomerizao de prolina, e provavelmente outros que aguardam a descrio. (Vaquero et al. 2003). Estas
modificaes ocorrem em locais especficos e resduos, alguns dos quais esto ilustrados na Figura 6 e listados
no Apndice 2. Enzimas especficas e complexos enzimticas, alguns dos quais destacados na seguinte sntese
e em captulos individuais, catalisam esses marcaes. Como essas listas continuaro a crescer nos prximos
anos, nossa inteno era mencionar apenas marcas e enzimas que podem ilustrar o que sentimos importantes
conceitos e princpios gerais.
Em certas regies da cromatina, os nucleossomos podem conter protenas variantes das histonas no
lugar de uma histona central (cannica). Pesquisas em andamento demonstram que essa diferena na
composio contribui para marcar regies dos cromossomos para funes especializadas. As protenas variantes
para as histonas nucleares H2A e H3 so actualmente conhecidas, mas no existem para as histonas H2B e H4.
Suspeitamos que as variantes de histona, embora muitas vezes menores em termos de quantidade e
consequentemente mais difceis de estudar, so abundantes nas informaes que contm e essenciais
contribuindo para a regulao epigentica (para mais detalhes, ver Seo 8 E Captulo 13).

Figura 5. Estrutura de Nucleosoma (Esquerda)

Um modelo de 2,8 de um nucleossoma. (Direita) Uma representao esquemtica da organizao de histonas
dentro do ncleo octamrico que o DNA (linha preta) envolvido. Formao de nucleossomos ocorre primeiro
atravs da deposio de um tetrmero H3 / H4 no DNA, seguido de dois conjuntos de dmeros H2A / H2B.
Caudas aminoterminal de histonas no estruturado extrudem do ncleo nucleossmico, que consiste dos oito
domnios globulares estruturados das protenas histonas.

5- Organizao de Cromatina de Ordem Superior

A cromatina, o polmero de DNA-nucleosoma, uma molcula existente em muitas configuraes.

Historicamente, a cromatina foi classificada como eucromtica ou heterocromtica, resultante da colorao
nuclear com padres de corantes utilizados pelos citologistas para visualizar o DNA. A eucromatina cromatina
descondensada, embora possa ser transcricionalmente ativa ou inativa. Heterocromatina pode ser amplamente
definida como cromatina altamente compactada e silenciada. Pode existir como cromatina (heterocromatina
constitutiva) permanentemente silenciosa, onde os genes raramente esto expressos em qualquer tipo de clula
do organismo, ou reprimida (heterocromatina facultativa) em algumas clulas durante um ciclo celular especfico
ou fase de desenvolvimento. Assim, existe um espectro de estados de cromatina e uma literatura de longa data
sugerindo que a cromatina uma estrutura macromolecular altamente dinmica, propensa a remodelao e
reestruturao medida que recebe entrada fisiologicamente relevante das vias de sinalizao a montante.
Somente recentemente, no entanto, tem sido feito um progresso sobre os mecanismos moleculares que
governam essa remodelao: fosforilao, acetilao, metilao de argenina, metilao de lisina (ativa ou
represiva) e ubequitinao.

Figura 6. Locais de Modificao da Cauda de Histona

As caudas amino-terminais das histonas representam um quarto da massa nucleossmica. Eles hospedam a
grande maioria covalente como ilustrado. As modificaes tambm ocorrem no domnio globular (encaixotado),
algumas das quais so indicadas. Em geral, as marcas ativas incluem acetilao (turquesa Ac bandeira),
metilao de arginina(amarelo Me hexgono), e alguma metilao de lisina tal como H3K4 e H3K36 (hexgono
Me verde). H3K79 no domnio globular tem funo anti-silenciamento. As marcas repressivas incluem H3K9,
H3K27 e H4K20 (hexgono Me vermelho), Verde = marca ativa, vermelho = marca repressiva.

O livro de texto, 11-nm "contas em uma Cadeia de caracteres" modelo representa uma interfase ativa e
em grande parte "desdobrada" em que o DNA periodicamente envolvido em torno de unidades repetidas de
nucleossomos (Fig. 7). A fibra da cromatina, entretanto, nem sempre composta de matrizes nucleosmicas
regularmente espaadas. Os nucleossomos podem ser embalados de forma irregular e dobrar em estruturas de
ordem superior que s esto comeando a ser observadas na resoluo atmica (Khorasanizadeh 2004).
Cromatina diferencial e confromaes de ordem superior ocorrem em diversas regies do genoma durante a
especificao do destino celular ou em estgios distintos do ciclo celular (interfase versus cromatina mittica).
A disposio dos nucleossomos no molde de 11 nm pode ser alterado pelos efeitos cis e trans de
covalncia das caudas de histona modificadas (Fig. 8). Os efeitos cis so provocados por alteraes nas
propriedades fsicas dos histonas, tal como uma modulao na carga electrosttica ou estrutura da cauda que,
por sua vez, altera os contactos internucleosmicos. Um exemplo bem conhecido, a acetilao das histonas, tem
sido suspeito de neutralizar cargas positivas de caudas de histonas altamente bsicas, gerando uma expanso
localizada da fibra de cromatina, permitindo assim um melhor acesso de, da maquinaria de transcrio dupla
hlice do DNA. A fosforilao, atravs da adio de carga negativa lquida, pode gerar "remendos de carga" (Dou
e Gorovsky 2000) que se acredita alterarem a embalagem dos nucleossomas ou expor os terminais amino da
histona alterando o estado dobrado de ordem superior do polmero de cromatina (Wei et al., 1999; Nowak e
Corces, 2004). Muito do mesmo modo, acredita-se que as histonas de ligao (H1) promovam a embalagem de
fibras de maior ordem, protegendo a carga negativa do DNA ligante entre os nucleossomos adjacentes (Thomas
1999, Khochbin 2001, Harvey e Downs 2004, Kimmins and Sassone-Corsi,2005). A adio de aductos
volumosos, tais como ubiquitina e ADP-ribose, pode tambm induzir arranjos diferentes das caudas das histonas
e abrir arrays de nucleosomas. A extenso qual as caudas das histonas podem induzir a compactao da
cromatina atravs de mecanismos dependentes da modificao e independentes no est clara.
 Figura 7. Estruturao de ordem superior da cromatina
A fibra de 11 nm representa DNA envolvido em torno de
nucleossomos. A fibra de 30 nm ainda compactada numa estrutura
ainda no confirmada (ilustrada como conformao de solenide
aqui), envolvendo a histona H1 do ligante. A fibra de 300-700 nm
representa o looping dinmico de ordem superior que ocorre tanto na
cromatina interfsica como na metafase. O cromossomo condensado
de 1,5 m representa a mais compactada forma de cromatina que
ocorre apenas durante a diviso nuclear (mitose ou meiose). Ainda
no est claro como os padres de bandagem de cromossomas
mitticos (isto , bandas G ou R) esto correlacionados com
estruturas de cromatina particulares.

As modificaes histonais tambm podem induzir o que chamamos de trans-efeitos pelo recrutamento de
parceiros modificadores-ligantes para a cromatina. Isto pode ser visto como "leitura" de uma marca de histona
covalente particular de uma forma dependente do contexto. Determinados parceiros de ligao tm uma
afinidade particular e, por conseguinte, so conhecidos por "encaixarem" em caudas de histonas especficas e
frequentemente o fazem servindo como um "velcro" de cromatina para um polipptido dentro de um complexo
enzimtico muito maior que necessita de engatar o polmero de cromatina. Por exemplo, o bromodomnio - um
motivo que reconhece resduos de histonas acetilados - muitas vezes, mas nem sempre, parte de uma enzima
de histona acetiltransferase (HAT) que existe para acetilar histonas alvo (ver Fig. 10 na Seo 7) como parte de
um maior Complexo de remodelao da cromatina (Dhalluin et al., 1999, Jacobson et al., 2000). De forma
semelhante, os resduos de lisina metilada incorporados nas caudas das histonas podem ser lidos por
cromodomnios (B et al 2001) ou domnios semelhantes (por exemplo, MBT, tudor) (Maurer ... 2006) para facilitar
eventos de modulao da cromatina. Em alguns casos, por exemplo, a associao de protenas de cromodominio
precipita a propagao da heterocromatina pela metilao de histonas adjacentes histonas metiltransferase
(HKMT), que pode ento ser lida por protenas de cromodominio (Captulo 5).
As modificaes de histonas tanto das regies da cauda como da regio do ncleo globular (Cosgrove et
al., 2004) tambm podem alvejar complexos de remodelamento dependentes de ATP fibra de 11 nm requerida
para a transio da euromatina equilibrada para um estado transcricionalmente ativo. Essa mobilizao de
nucleossomos pode ocorrer por deslizamento de octmereros, alterao da estrutura dos nucleossomos por
looping de DNA (para maiores detalhes, ver Captulo 12) ou substituio de histonas nucleares especficas por
variantes de histonas (Captulo 13). Os remodeladores de cromatina dependentes de ATP (tais como SWI / SNF,
um exemplo historicamente importante) hidrolisam energia para causar alteraes significativas nos contatos de
histona: DNA, resultando em looping, toro e deslizamento de nucleossomos. Estes mecanismos no
covalentes tm demonstrado ser criticamente importantes para eventos reguladores de genes (N ... 2002), tanto
quanto aqueles envolvendo modificaes de histonas covalentes (ver Captulo 10). A descoberta de que os
remodeladores especficos dependentes de ATP podem misturar as variantes de histona dentro e fora da
cromatina proporciona um meio para ligar os mecanismos cis, trans e remodelao. Compreender, por sua vez,
como esses mecanismos interconectados agem de forma concertada para variar estados epigenticos na
cromatina est longe de ser completa.
Tambm podem ser obtidas estruturas de cromatina de ordem superior mais compactas e repressivas (30
nm) atravs do recrutamento de histona H1 ligante e / ou fatores associados cromatina dependentes da
modificao ou "arquitetnicos" tais como a protena heterocromatina 1 (HP1) ou Polycomb ( PC). Embora seja
comumente sustentado que a compactao da cromatina nucleosmica (11 nm) numa conformao transcrita
incompetente de 30 nm realizada pela incorporao da histona H1 do ligante durante a interfase, a disseco
funcional e estrutural desta histona tem sido at recentemente difcil ( Fan et al., 2005). Um problema provvel
subjacente a esses estudos o fato de que a histona H1 possui diferentes isoformas (aproximadamente 8 em
mamferos), tornando difcil a realizao de anlises genticas detalhadas. Assim, h redundncia entre algumas
isoformas H1, enquanto outras podem ter funes especficas de tecido (Kimmins e Sassone-Corsi 2005).
Interessantemente, o prprio H1 pode ser modificado covalentemente (fosforilado, metilado, poli (ADP) ribosilado,
etc.), levantando a possibilidade de que os mecanismos cis e trans que esto actualmente a ser dissecados nas
histonas nucleares podem muito bem estender a esta importante classe de histona ligante e tambm a protenas
no histonas (S e B 2000).
Um debate considervel ocorreu sobre os detalhes da forma como a fibra de cromatina de 30 nm est
organizada. Em geral, os modelos "solenide" (hlice de partida nica), em que os nucleossomos so
gradualmente enrolados em torno de um eixo central (6-8 nucleosomas / volta), ou modelos "ziguezague" mais
abertos, que adotam conjuntos de auto-montagens de ordem superior (Hlice de dois passos), foram descritos.
Novas evidncias, incluindo aquelas coletadas a partir de uma estrutura de raios X usando um sistema modelo
contendo quatro nucleossomos, sugerem um arranjo de fibras mais consistente com um arranjo em ziguezague
de dois eixos de DNA ligante conectando duas pilhas de partculas nucleosmicas (Khora ... 2005). Apesar deste
progresso, observamos que a histona de ligante no est presente nas estruturas atuais, e mesmo se estivesse
presente, a fibra de cromatina de 30 nm compacta o DNA apenas aproximadamente 50 vezes. Assim, existem
consideravelmente mais nveis de organizao de cromatina de ordem superior que ainda tm de ser resolvidos
fora do exame de microscopia de luz e de eltrons, que conduzam a estados de cromatina interfsicas ou
mitticas. Apesar das incertezas estruturais, resultados recentes em clulas vivas j estabeleceram a existncia
de mltiplos nveis de cromatina dobrando acima da fibra de 30 nm dentro de cromossomos interfsicos. Um
avano digno de nota foi o desenvolvimento de novas abordagens para rotular sequncias de DNA especficas
em clulas vivas, tornando possvel o estudo da dinmica da abertura e fechamento da cromatina in vivo em
tempo real. Interessantemente, esses resultados revelam uma interao dinmica de fatores de remodelao de
cromatina positivos e negativos no estabelecimento de estruturas de cromatina de ordem superior para estados
mais ou menos compatveis com a expresso de genes. (Fisher e M Felsenfeld e Groudine, 2003, Misteli, 2004).

Figura 8. Transies no Modelo de Cromatina (cis / trans)

Efeito-Cis: Uma modificao covalente de um resduo da cauda da histona resulta em uma estrutura ou carga
alterada que se manifesta como uma mudana na organizao da cromatina.
Efeito-Trans: A modificao enzimtica de um resduo de cauda de histona (por exemplo, metilao de H3K9)
resulta numa afinidade para a protena associada cromatina (ligante mod, por exemplo, HP1). A associao de
um ligante mod (ou complexos de protenas associados) provoca alteraes a jusante na estrutura da cromatina.
Substituio de histona: Uma modificao de histona covalente (ou outro estmulo) pode sinalizar a substituio
de uma histona central por uma variante de histona atravs de um complexo de troca de remodelao de
nucleossomos.
A organizao em domnios looping de cromatina (300-700nm) ocorre, talvez pelo ancoramento da fibra de
cromatina periferia do ncleo ou outros anadaimes nucleares via protenas associadas cromatina como
lamina nuclear. Em que medida essas associaes do origem territrios cromossmicos funcionais
significativos continua incerto, mas inmeros relatos mostram que esse conceito merece sria ateno. Por
enquanto, o agrupamento de fatores de transcrio de mltiplos stios ativos de cromatina para RNA polimerase II
(RNA pol II) foram observados, e conceitos similares parecem se aplicar ao agrupamento de DNA em replicao
(ou replicado) e DNA polimerase. Em contraste, agrupamento de heterocromatina silenciosa (particularmente
focos pericentromricos) e genes localizados em trans tambm foram documentados. Como essas associaes
so controladas e at que ponto a localizao nuclear de domnios de cromatina afeta a regulao do genoma
no so claras. H, no entanto, um nmero crescente de evidncias que mostram correlaes de uma
configurao de cromatina ativa ou silenciosa com um territrio nuclear particular. A estrutura de DNA mais
condensada observada durante o estgio de metfase da mitose ou meiose. Isto permite a segregao fiel de
cpias exatas do nosso genoma (uma ou duas cpias de cada cromossomo, dependendo da diviso no
momento), atravs de cromossomos, para cada clula filha. Esta condensao envolve uma reestruturao
dramtica do DNA de uma molcula de 2-m quando completamente estendida, em cromossomos discretos
medindo em mdia 1,5 nm de dimetro. Esta no menos do que uma compactao de 10.000 vezes e
conseguida pela hiperfosforilao do ligante (H1) e da histona H3 central, e pela ao dependente de ATP dos
complexos de condensina e coesina, e da topoisomerase II. Exatamente como os complexos no histnicos
envolvem a cromatina mittica (ou modificaes da cromatina em fase M) e quais regras determinam sua
associao e liberao da cromatina de uma forma regulada por ciclos celulares, ainda no foram determinadas.
Aqui, a bem conhecida fosforilao mittica da histona H3 e dos membros da famlia H1 pode fornecer pistas
importantes, mas as experincias genticas e bioqumicas ainda tm de fornecer informaes completas sobre
qual a funo dessas marcas mitticas. Interessantemente, foi proposta uma teoria formal que as marcas de
metilao especficas podem atuar como um "interruptor binrio" nas protenas histonas, que regem a ligao e
libertao de efetores a jusante que engatam o molde de cromatina. Utilizando a ligao de HP1 histona H3
metilada sobre a fosforilao da lisina 9 e da serina 10 mittica como paradigma, foi recentemente provida a
existncia de um "interruptor metil / fosfo" mittico. Domnios cromossmicos especializados, tais como telomeros
e centrmeros, servem funes distintas dedicadas dinmica cromossmica adequada. Os telmeros atuam
como extremidades cromossmicas, fornecendo proteo e solues nicas para como as extremidades das
molculas de DNA so replicadas. Os centrmeros fornecem uma ncora de fixao para os microtbulos do
fuso durante a diviso nuclear. Ambos os domnios especializados tm um papel fundamental nos eventos que
levam segregao cromossmica fiel. Curiosamente, tanto a heterocromatina telomrica como centromrica
distinguvel da eu cromatina e at mesmo de outras regies heterocromatinas (ver abaixo), pela presena de
estruturas cromatnicas nicas que so em grande parte repressivas para a atividade gnica e recombinao.
Movendo genes expressos de suas posies normais em eucromatina para novas posies em ou perto de
heterocromatina centrmerica e telomrica pode silenciar esses genes, dando origem a poderosas telas descritas
anteriormente que procuraram identificar supressores ou potenciadores de efeito de posio-efeito ou efeitos da
posio de telomero. Centrmeros e telmeros tm assinaturas moleculares que incluem, por exemplo, histonas
hipoacetiladas. Curiosamente, os centrmeros tambm so "marcados" pela presena da variante de histona
CENP-A que desempenha um papel ativo na segregao cromossmica. Assim, a correta montagem e
manuteno de heterocromatina centromrica e pericentromrica distinta crtica para a concluso da mitose ou
da meiose e, portanto, a viabilidade celular. Alm do bem estudado centromrico e pericentromrico de
heterocromatina constitutiva, o progresso est sendo feito em mecanismos de controle epigentico para
"identidade" centromerico (e telomrico). Experincias inteligentes mostraram que os "neocentrmeros" podem
funcionar no lugar de centrmeros normais, demonstrando que as seqncias de DNA no ditam a identidade
dos centromeros. Em vez disso, caracteristicas epigenticas, incluindo padres de modificao especfica de
centromeros e variantes histonicas, marcam este domnio cromossomal especializado. Esto a ser feitos
progressos considerveis sobre como outras regies codificantes, no codificantes e repetitivas da cromatina
contribuem para estas assinaturas epigenticas. Como qualquer um desses mecanismos se relacionam, e se
que existem, com padres de bandas cromossmicas no conhecido, mas continua sendo uma possibilidade
intrigante. A obteno de uma compreenso da regulao epigentica dessas pores de regies cromossmicas
nicas necessria, ressaltado pelo fato de que numerosos cnceres humanos so caracterizados por
instabilidade genmica, que uma marca registrada de certa progresso da doena e neoplasia.
6- A diferena entre Eucromatina e a heterocromatina

Esta viso geral foi dividida em discusses sobre a eucromatina e a heterocromatina, embora ns saibamos que
h mltiplas formas dessas dois tipos de cromatinas.
A eucromatina, ou cromatina "ativa", consiste em sequncias de codificao, que se relaciona apenas a uma
pequena frao (menos de 4%) do genoma em mamferos.
Quais sinais moleculares marcam as sequncias de codificao com o potencial de transcrio produtiva, e como
a estrutura da cromatina contribui para o processo?
Na extensa literatura sugere-se que a eucromatina existe em "aberto" (descompactado), mais sensvel a
ao da nuclease tornando-se disponvel para a expresso gnica, embora no sejam necessariamente
transcricionalmente ativos.
Alguns dos genes so expressos de forma ubqua (em todos os locais); outros so regulados pelo local de
intensa atividade em resposta ao ambiente.
A cooperao de sequncias selecionadas de DNA atuando em cis (???) (intesificadores de promotores e regies
de controle de locus), ligados por combinaes dos fatores transatuantes, gatilhos para transcrio gnica em
conjunto com a RNA polimerase e fatores associados (Sims et al., 2004).
Juntos, esses fatores tm sido selecionados durante a evoluo para orquestrar uma srie de reaes
bioqumicas que devem ocorrer obdecendo um contexto espacial e temporal apropriado. A cromatina fornecer um
"sistema de indexao" que garanta melhor mecanismo (citado acima) para acessar suas seqncias-alvo no tipo
de clula apropriado?
Ao nvel do DNA, a vizinhana rica em AT dos promotores freqentemente desprovida de
nucleossomos e pode existir em uma forma de B no-cannica da configurao do DNA, promovendo taxa de
transcrio (TF) (Mito et al., 2005; Sekinger et ai. 2005). No entanto, a ocupao de TF no suficiente para
assegurar a transcrio. O recrutamento da maquinaria de remodelao de nucleossomas, atravs da induo de
modificaes de ativao de histonas (por exemplo, acetilao E H3K4 metilao), facilita o engajamento de
mecanismos de transcrio por caminhos que esto atualmente sendo definidos (Fig. 9 e Captulo 10).
Troca de histonas (deslocadas) com histona variantes aps a transcrio via maquinaria, destrancou e
transcreveu a fibra de cromatina assegurando-se da integridade do modelo da cromatina (Ahmad e Henikoff,
2002). Alcanar mRNAs maduros, no entanto, tambm requer processos pstranscrio envolvendo splicing,
poliadenilao e exportao nuclear. Assim, o termo coletivo "eucromatina" provavelmente representa um (s)
estado (s) complexo (s) da cromatina que engloba uma mistura dinmica e elaborada de maquinrio que
interagem em conjunto e de maneira proxima fibra da cromatina para produzir a transcrio funcional do RNA.
Aprender as "regras" sobre como, (no sentido mais geral) o "mecanismo ativador" interage com o aparelho de
transcrio, bem como a cromatina uma rea excitante da pesquisa atual, embora devido sua natureza
dinmica, no se pode classificar estritamente como epigentica, mas mais como um estudo dinamico da
transcrio e da cromatina.
O que ento define "heterocromatina? Embora seja historicamente menos bem estudado do que a eucromatina,
sugere-se que a heterocromatina desempenha um papel importante na organizao e no bom funcionamento
desde os genomas de levedura at o de seres humanos (embora a S. Cerevisiae tenha uma forma distinta de
heterocromatina). Sublinhando sua potencial importncia, h o fato de que 96% do genoma de mamferos
consiste em sequncias no codificantes e repetidas.
Novas percepes mecanicistas, subjacentes formao heterocromatina revelaram resultados inesperados. Por
exemplo, a transcrio no especfica da sequncia que produz RNA de cadeia dupla (dsRNA), sujeita a
silenciamento por uma interferncia de RNA (iRNA) (Ver a Seo 10 abaixo). A produo de tais dsRNAs atua
como um "sinal de alarme", refletindo o fato da sequncia de DNA subjacente no pode gerar um produto, ou ter
sido invadida por transposons (so segmentos de DNA saltadore) de RNA ou por vrus.
O dsRNA ento processado pela Dicer e enviado para a cromatina por complexos incubidos de iniciar uma
cascata de eventos que conduzem formao de heterocromatina. Usando uma variedade de sistemas de
modelos, progresso foi feito dissecando o que parece ser um heterocromatina altamente conservada que conduz
a um estado "bloqueado". Embora a ordem exata e detalhes possa variar, esta via geral envolve a desacetilao
da cauda da histona, metilao de resduos de lisina especficos (por exemplo, H3K9), recrutamento de protenas
associadas heterocromatina (Por exemplo, HP1) e estabelecimento de metilao de DNA (Figura 9).
provvel que o sequestro seletivo de regies do genoma, reprima domnios nucleares e possa melhorar a
formao de heterocromatina. Curiosamente, aumentam evidncias sugerindo que a heterocromatina pode ser o
"estado padro", pelo menos em organismos superiores, e que a presena de um promotor ou potencializador
forte, produzindo uma transcrio produtiva, pode substituir a heterocromatina. At em eucariotos inferiores, os
conceitos gerais de heterocromatina parecem se aplicar. Os recursos da Hallmark incluem: caudas de histonas
hipoacetiladas, seguido da ligao de protenas heterocromatinas sensveis acetilao (por exemplo, SIR
protenas; Para obter detalhes, consulte o Captulo 4).
Dependendo da espcie do fungo (por exemplo, levedura de brotamento vs. fisso), pode haver quantidades
variantes de metilao de histonas e protenas semelhantes a HP1. Embora esses genomas estejam mais
envolvidos no estado padro de estar pronta para a transcrio, algumas heterocromatinas como as regies
genmicas esto presentes (encontro de loci, telmeros, centromeres, etc.) capazes de suprimir transcrio e
recombinao gentica quando genes so realocados em novos locais.

Legenda: Figura 9. Distino entre dominios eucromatina e heterocromatina

Resumo das diferenas comuns entre eucromatina e heterocromatina constitutiva. Isso inclui diferenas no tipo
de transcries produzidas, recrutamento de protenas de ligao a DNA (isto , fator de transcrio [TF]),
protenas associadas cromatina e complexos, modificaes de histona covalente e composio de variante de
histona.

Quais funes teis a heterocromatina pode ter? A definio de centrmeros, uma regio de heterocromatina
constitutiva, correlaciona bem com o estado epigentico hereditrio, e pensado para ser orientado
evolutivamente pelo maior agrupamento de repeties e elementos repetitivos em um cromossomo. Essa
partio garante domnios heterocromticos grandes e relativamente estveis marcados por assinaturas
epigenticas repressivas, facilitando a segregao de cromossomos durante a mitose e meiose (Captulo 14).
Aqui, de se salientar que as repeties centromricas e as correspondentes marcas epigenticas associadas a
elas foram duplicadas e movidas para outros braos cromossmicos para criar "domnios silenciadores" em
organismos como a levedura de fisso.
A heterocromatina constitutiva nos telmeros (as extremidades protetoras dos cromossomos) assegura de forma
semelhante a estabilidade do genoma servindo como "tampes"(caps)cromossmicos. Por ltimo, a formao de
heterocromatina conhecida por ser um mecanismo de defesa contra o DNA invasor. Coletivamente, esses
achados enfatizam uma viso geral de que a heterocromatina serve a importantes funes de manuteno do
genoma que podem rivalizar at mesmo com a prpria eucromatina.
Em resumo, a ampla distino funcional entre euromatina e heterocromatina pode at agora ser atribuda a trs
caractersticas conhecidas da cromatina. A primeira a natureza da sequncia-eg. de DNA, por exemplo, se ela
contm DNA "rgido" rico em AT em torno de promotores, sequncias repetitivas e/ou sequncias de ligao de
repressor que sinalizam associao de fatores. Em segundo lugar, a qualidade do RNA produzido durante a
transcrio determina se totalmente processado num RNAm que pode ser traduzido, ou se o RNA degradado
ou destinado utilizao pela maquinaria RNAi visando a heterocromatinizao. Terceiro, a organizao
espacial dentro do ncleo pode desempenhar um papel de seqestro significativo para a manuteno de
configuraes de cromatina localizadas.

7- Modificaes de Histona e cdigo de histona.

Ns exploramos como modificaes de histona podem alterar o molde de cromatina por cis-efeitos que alteram
contatos internucleossomais e espaamento, ou os trans-efeitos causados pelas associaes de histonas e de
protenas no histonas com o modelo.Qual a contribuio e a produo/potencial biolgica das modificaes
das histonas? Padres de estrutura de cromatina que se correlacionam com modificaes de cauda de histona
emergiram de estudos usando histonas em massa, Sugerindo que marcas epigenticas podem fornecer
assinaturas "ON" (isto , ativas) ou "OFF" (inativas). Isto veio atravs de um longo histrico de estudos
principalmente correlativos mostrando que certas modificaes de histonas, nomeadamente acetilao de
histonas, esto associadas com domnios de cromatina ativa ou regies que so geralmente permissivas para
transcrio. Em contraste, outras marcas, tais como certos resduos de histona fosforilados, tm sido associadas
h muito tempo com a cromatina condensada que, em geral, no suporta a atividade transcricional. As
modificaes de histonas mostradas no Apndice 2 resumem os locais de modificao conhecidos neste
momento. Aqui, salientamos que estas refletem modificaes e locais que podem muito bem no ser exibidos
por cada organismo.
Como as modificaes de histonas so estabelecidas ou removidas em primeiro lugar? Uma grande quantidade
de trabalho no campo da cromatina sugere que as modificaes da cauda da histona so estabelecidas
("escritas") ou removidas ("apagadas") pela ao cataltica dos sistemas enzimticos associados cromatina.
No entanto, a identidade dessas enzimas frustrou pesquisadores por anos. Na ltima dcada, um nmero
notavelmente grande de enzimas modificadoras de cromatina foram identificadas a partir de muitas fontes, a
maioria das quais so compiladas no Apndice 2. Isto foi conseguido atravs de numerosos estudos bioqumicos
e genticos. As enzimas residem frequentemente em grandes complexos de multi-subunidades que podem
catalisar a incorporao ou remoo de modificaes covalentes de alvos tanto de histonas como de no
histonas. Alm disso, muitas destas enzimas catalisam as suas reaces com uma especificidade notvel
relativamente ao resduo alvo e ao contexto celular (isto , dependentes de sinais externos ou intrnsecos). Para
clarear e, a ttulo de exemplo, discutiremos brevemente os quatro principais sistemas enzimticos que catalisam
as modificaes de histonas, juntamente com os seus sistemas enzimticos de contrapartida que invertem as
modificaes (Figura 10) (Vaquero et al.2003; Holbert and Marmorstein 2005). Juntas, essas atividades
antagnicas governam o equilbrio de estado estacionrio de cada modificao em questo. Histona acetilases
(HATs) acetilam resduos especficos de lisina em substratos de histonas (Roth et al. 2001) e so invertidos pela
ao de histonas desacetilases (HDAC)(Grozinger and Schreiber 2002). A famlia das enzimas histonas
quinases fosforila os resduos especficos de serina ou treonina, e as fosfatases (PPTases) removem as marcas
de fosforilao. Particularmente bem conhecidas so as cinases mitticas, tais como quinase dependente de
ciclina ou quinase de aurora, que catalisam a fosforilao de histonas de ncleo (H3) e ligante (H1). Menos
claras em cada caso so as PPTases opostas que actuam para inverter estas fosforilaes medida que as
clulas saem da mitose.
Foram descritas duas classes gerais de enzimas metilantes: as PRMTs (protena arginina metiltransferases) cujo
substrato arginina (Lee et al. 2005), e as HKMTs (histona-lisina metiltransferases) que atuam em resduos de
lisina (Lachner et al. 2003). A metilao da arginina indiretamente revertida pela ao de desaminases, que
convertem a metil-arginina (ou arginina) em um resduo de citrulina (Bannister and Kouzarides 2005). Os
resduos de lisina metilados parecem ser quimicamente mais estveis. A metilao de lisina demonstrou estar
presente em estados mono, di ou trimetilados. Vrios resduos tri-metilados nos animo termini H3 e H4 parecem
ter o potencial para serem propagados de forma estvel durante as divises celulares (Lachner et al. 2004), bem
como a marca H4K20me1 em discos imaginais Drosophila (Reinberg et al. 2004). Recentemente, uma
"desmetilase" especfica para lisina (LSD1) foi descrita como uma amina oxidase que capaz de remover a
metilao de H3K4(Shi et al. 2004). A enzima age por desestabilizao oxidativa dependente de FAD da ligao
aminometil, resultando na formao de lisina no modificada e formaldedo. O LSD1 mostrou ser seletivo para a
marca de metilao H3K4 ativa e s pode desestabilizar mono- e di-, mas no trimetilao. Esta desmetilase faz
parte de um grande complexo proteico repressivo que tambm contm HDAC e outras enzimas. Outras
evidncias sugerem que o LSD1 pode associar-se a um complexo em conjunto com o receptor de andrgeno
nos loci alvo e desmetilar a marca de histona repressiva H3K9me2 para contribuir para a ativao da transcrio
(Metzger et al 2005). Uma classe diferente de histona desmetilases tem sido caracterizada para funcionar
atravs de um mecanismo mais potente - ataque radical - conhecido como hidroxilases ou dioxigenases
(Tsukada et al. 2006). Um destes desestabiliza apenas H3K36me2 (uma marca ativa), mas no no tri-metil. Esta
nova histona-desmetilase jumonji (JHDM1) contm o domnio jumonji conservado, dos quais existem cerca de 30
conhecidos no genoma dos mamferos, sugerindo que algumas dessas enzimas tambm podem ser capazes de
atacar outros resduos, bem como um estado tri-metil(Fodor et al 2006; Whetstine et al 2006).
Tem havido um progresso considervel na dissecao dos sistemas enzimticos que governam o equilbrio no
estado estacionrio dessas modificaes, e suspeitamos que muito mais progresso ser feito nesta excitante
rea. Continua a ser um desafio compreender como estes complexos de enzimas so regulados e como os seus
substratos fisiologicamente relevantes E os stios so segmentados. Alm disso, ainda no est claro como os
mecanismos covalentes afetam os fenmenos epigenticos.

Figura 10. Enzimas modificadoras de histonas

As modificaes da histona so transduzidas por enzimas modificadoras de histonas e removidas por atividades
antagonistas. So classificadas em famlias de acordo com o tipo de ao enzimtica (acetilao ou
fosforilao). Os domnios de protena com afinidade especfica para uma modificao da cauda de Histonas so
denominados leitores. (HAT Histone acetitransferase;(PMRT) protena argenina metiltransferase; (HKMT)
histona lisina metiltransferase; (HDAC) histona deaciltilase; (PPTase) protenas fosfatase; (Ac) Acetilao; (P)
fosforilao; (M) metilao.
As modificaes de histonas no ocorrem isoladamente, mas sim de uma maneira combinatria como
( modificaes covalentes em resduos dos segmentos adjacentes de uma cauda de histona particular (H3K9me
e H3S10ph ou (Modificaes covalentes entre as diferentes caudas de histona ou nucleossomos, ver Fig. 3), e
quase todas as modificaes de histonas conhecidas correlacionam-se com a funo de ativao ou de
represso, dependendo do resduo de aminocido (S) na histona amino terminal modificada. Tanto as vias
sinrgica e antagnica foram descritas (Zhang e Reinberg 2001, Berger c 2002, Fischle et al., 2003b) que podem
progressivamente induzir combinaes de marcas ativas, enquanto simultaneamente ocorrem contra-efeito
repressivo . No entanto, no se sabe quantas combinaes distintas de modificaes das vrias posies de
histonas amino-terminais existem para qualquer nucleosomo conhecido, porque a maior parte dos estudos foi
realizada em preparaes de histonas em massa. Em adio s regies amino terminais , modificaes nos
domnios de globulina tm demonstrado recentemente que afetam a estrutura e a montagem da cromatina
(Cosgrove et al., 2004), influenciando assim a expresso gentica e o DNA na reparao de danos (van Attikum
E Gasser 2005, Vidanes et al., 2005), e tambm importante ressaltar que vrias das enzimas modificadoras
tambm se dirigem a substratos que no sejam histonas (Sterner e Berger, 2000, Chuikov et al., 2004). Figura
11 Ilustra dois exemplos de hierarquias estabelecidas de modificaes de histonas que parecem indexar
domnios erochromatic.
Estes estudos levantaram a questo de saber se existe um cdigo de histonas ou mesmo um cdigo
epigentico. Embora este conceito terico tenha sido altamente utilizado e tenha mostrado ser correto em
algumas de suas previses, a questo de saber se um cdigo realmente existe O cdigo gentico provou-se
extremamente til, devido sua previsibilidade e quase universalidade, que utiliza na sua maior parte um
"alfabeto" de quatro bases no ADN (isto , os nucleotdeos), formando o que geralmente uma linguagem
invariante e quase universal. Ao contrrio, as evidncias atuais sugerem que o padro de alterao de histona
provavelmente varivel de um organismo para outro, especialmente entre eucariotos inferiores e superiores,
como leveduras e seres humanos. Assim, mesmo se seu cdigo de histona existe, no provvel que seja
universal. Esta situao consideravelmente mais complicada quando se considera a natureza dinmica das
modificaes das histonas, variando no espao e no tempo. Alm disso, o modelo de cromatina engata um
conjunto assombroso de fatores de remodelao (Vignali et al., 2000, Narlikar et al., 2002, Langst e Becker
2004, Smith e Peterson, 2005). No entanto, os ensaios de imunoprecipitao de cromatina (ChIP, quando
examinados em nveis genmicos de largura (ChIP on chip)comearam a decifrar padres no aleatrios e um
tanto previsveis em vrios genomas (e S. pombe, clulas de mamferos de A. thaliaia), tais como Fortes
correlaes de H3K4me3 com regies promotoras ativadas (Strahl et al 999, Santos-Rosa et al., 2002, Bernstein
et al., 2005) e de H3K9 (Hall et al., 2002, Lipp nan et al., 2004, Martens et al Al. 2005) e H3K27 (Litt al 2001
Ringrose et al. 2004) com heterocromatina silenciada. Talvez a limitao do cdigo de histonas seja que uma
modificao no se traduz invariantemente para uma sada biolgica. No entanto, modificaes combinatrias ou
cumulativas parecem definir e contribuir para funes biolgicas (Henikoff 2005).

8- Complexos de Remodelao de Cromatina e Variantes de Histona

Outro mecanismo importante pelo qual as transies no modelo de cromatina o recrutamento de complexos
remodeladores de cromatina que usam energia (hidrlise de ATP) para alterar a cromatina e a composio de
nucleossomos de uma maneira no covalente. Nucleosomos particularmente quando ligados por fatores
repressivos associados cromatina, muitas vezes impem uma inibio intrnseca maquinaria de transcrio.
Assim, apenas alguns fatores de transcrio e reguladores especficos da sequncia (embora no a maquinaria
de transcrio basal) sejam capazes de obter acesso ao seu stio de ligao. Este problema de acessibilidade
resolvido, em parte, por complexos proteicos que mobilizam nucleossomos e alteraram a estrutura nucleosonal.
As atividades de remodelagem da cromatina frequentemente trabalham em conjunto com uma enzima
modificadora e geralmente podem ser categorizadas em duas famlias: a SNF2H ou a ISWI e a famlia Brahma
ou SWI / SNF. A famlia SNF2H-ISWI mobiliza nucleossomos ao longo do DNA (Tsukiyama et al. 1905 Varga-
Weisz et al., 1997), enquanto Brahma / SWI / SNF altera transientemente a estrutura do nucleossomo, expondo,
assim, os contatos de DNA: histona de formas que atualmente esto sendo desvendadas (ver Captulo 12).
Adicionalmente, algumas das atividades de hidrlise de ATP assemelham-se a "complexos de permutadores"
que so eles prprios dedicados substituio de histonas de ncleo convencionais com protenas de variantes
de histona especializadas. Esta permuta com gasto de ATP pode realmente ser um meio pelo qual as caudas
de histona modificadas existentes so substitudas por uma camada de histonas variantes (Schwartz e Ahmad
2005). Alternativamente, o recrutamento de complexos de remodelao da cromatina, (como SAGA t-Ada-Gcn5-
acetiltransferase) tambm pode ser aumentado por modificaes de histonas preexistentes e garantir a
competncia de transcrio de promotores direcionados (Grant et al., 1997, Hassan et al., 2002)
A transio de um modelo de cromatina natural para cromatina ativa (esquerda) ou o estabelecimento de
heterocromatina repressiva (direita) envolvendo uma srie de modificaes coordenadas da cromatina. No caso
da ativao transcricional, isso acompanhado pela ao de complexos de remodelao de nucleossomas e
pela remodelao de ncleos das histonas com histonas variantes.

Alm da iniciao transcricional e estabelecimento do contato primrio com uma regio promotora, a
passagem de RNA polimerase II (ou de RNA polimerase I) durante alongamento da transcrio tambm
dificultada pela presena de nucleossomas. Por isso, mecanismos devem assegurar a realizao de cpias
transcritas (em particular de genes longos). Especialmente, uma srie de modificaes de histonas e efetores de
acoplamento atuam em conjunto com complexos de remodelamento da cromatina, tais como SAGA e FACT
(para facilitar a transcrio da cromatina) (Orphanides et al. 1998) para permitir a passagem da RNA polimerase
II atravs dos arranjos nucleossomais. Estas atividades em conjunto, por exemplo, induziro o aumento da
mobilidade nucleosomal, deslocamento dos dmeros H2A/H2B e promovero a troca das histonas nuclear com
histonas variantes. Como tal, fornecem um exemplo excelente da estreita interao entre modificaes de
histona, remodelamento de cromatina, e a troca de variante de histona para facilitar iniciao e alongamento da
transcrio (Sims et al. 2004). Outros complexos de remodelamento tambm foram caracterizados, como Mi-2
(Zhang et al. 1998; Vau et al. 1999) e INO-80 (Shen et al. 2000), que esto envolvidos na estabilizao de
cromatina inativa em vez da cromatina ativa.
Diferenas composicionais da fibra de cromatina que ocorrem por meio da presena de histonas variantes
contribuem para a indexao de regies de cromossomo para funes especializadas. Cada variante de histona
representa um substituto para uma determinada histona nuclear (Fig. 12), embora as histonas variantes muitas
vezes sejam uma proporo menor do volume do contedo de histona, e assim mais difceis de estudar do que
as histonas regulares. Um crescente corpo literrio (para reviso, ver Henikoff e Ahmad 2005; Sarma e Reinberg
2005) documenta que as histonas variantes tm o seu prprio padro de suscetibilidade a modificaes,
provavelmente especificado pelo pequeno nmero de modificaes em aminocidos que as distinguem dos seus
membros da famlia. A ttulo de exemplo, os genes transcricionalmente ativos possuem histonas H3 (gerais)
trocadas pela variante H3.3, em um mecanismo acoplado transcrio que no necessita de replicao de DNA
(Ahmad e Henikoff 2002). A substituio de histona nuclear H2A com a variante H2A.Z correlaciona com
atividade transcricional e pode indexar a extremidade 5 dos promotores livres de nucleossomas. Entretanto,
H2A.Z foi tambm associada com cromatina inativa. CENP-A, o centrmero especfico de variante H3,
essencial para funo centromrica e portanto, segregao cromossmica. H2A.X, juntamente com outras
marcas de histona, associada deteco de danos no DNA e parece indexar uma leso no DNA para
recrutamento de complexos de reparo de DNA. MacroH2A uma variante de histona que se associa
especificamente com o cromossomo X inativo (Xi) em mamferos (para mais detalhes sobre histonas variantes, ver
o Captulo 13).
Figura 12. Histonas variantes.
Estrutura do domnio proteico para as histonas nucleares (H3, H4, H2A, H2B), histona ligadora H1, e histonas
variantes H3 e H2A. O domnio histone-fold (HFD) onde ocorre a dimerizao das histonas, e as regies da
protena que se diferenciam em histonas variantes (mostradas em vermelho) so indicados.
importante notar, que em contraste com a noo habitualmente mantida pelos livros didticos de que as
histonas so sintetizadas e depositadas apenas durante a fase S, a sntese e a substituio de muitas destas
histonas variantes ocorre independentemente da replicao de DNA. Assim, a substituio de histonas nucleares
por histonas variantes no est restrita s fases do ciclo celular (por exemplo, fase S), mas pode ter efeito
imediato em resposta a mecanismos contnuos (atividade de transcrio ou tenso do cinetcoro durante a
diviso celular) ou sinais de estresse (danos no DNA ou inanio de nutrientes).
Refinados estudos bioqumicos tm documentado remodelamento de cromatina ou complexos
permutadores que so especficos para substituio de distintas histonas variantes, tais como H3.3, H2A.Z ou
H2A.X (Cairns 2005; Henikoff and Ahmad 2005; Sarma and Reinberg 2005). Por exemplo, substituio de H3
com variante H3.3 ocorre via ao do complexo permutador HIRA (histona reguladora A) (Tagami et al. 2004), e
H2A substituda por H2A.Z atravs da atividade do complexo permutador SWR1 (Swi2/Snf2-related ATPase 1)
(Mizuguchi et al. 2004). Em conjunto, estas substituies permitem que nucleossomas variantes construam
especificamente cromatina ativa. Para algumas das outras histonas variantes, o mecanismo de direcionamento e
troca permanece para ser determinado, seja por via de um ATP-dependente de complexo permutador de histona
ou por uma protena chaperona. At agora postulou-se que complexos permutadores podem existir para substituir
histonas modificadas com suas partes homlogas no modificadas, como um mecanismo para apagar marcas
epigenticas mais robustas que residem na histona N-terminal.

9- Metilao do DNA

A metilao do DNA o mecanismo epigentico mais antigo correlacionado com a represso do gene
(Razin e Riggs 1980). Ele est presente em graus variados em todos os eucariontes, exceto leveduras. Esta
modificao consiste na adio de um grupo metil nos resduos de citosina de um modelo de DNA. Ele ocorre em
dinucleotdeos CpG em mamferos, enquanto que os outros simtrico, assimtrico,e padres de non-CpG
metilao so conhecidos em N. crassa e plantas. A distribuio do DNA metilado ao longo do genoma mostra
enriquecimento de regies no codificantes (por exemplo, heterocromatina centromrica) e elementos repetitivos
intercalados (transposons), mas no nas ilhas CpG de genes ativos (Bird, 1986). Na verdade, os nveis
aumentados de metilao do DNA correlacionam-se com um relativo aumento em DNA no-codificante e
repetitivo nos genomas de eucariotos superiores (ver Fig. 15 na Seo 11). A evidncia experimental indica que
isso porque a metilao do DNA serve principalmente como um mecanismo de defesa para silenciar muito do
genoma de origem externa (isto . elementos transponveis replicados, sequncias virais, e outras sequncias
repetidas).
DNA metiltransferases (DNMTs) so os "operadores" da metilao do DNA, e catalisam tambm de novo
qualquer (isto , em novos locais) ou manuteno de metilao do DNA hemimetilado(?) seguindo a replicao
do DNA (ver captulo 18). A perda da capacidade de manter a metilao do DNA pode resultar em vrias
doenas, como a IFC (Imunodeficincia, instabilidade centromrica, e anomalias faciais) (ver captulos 18 e 23).
A desregulao nos nveis de metilao do DNA tambm um fator contribuinte para a progresso do cncer
(captulo 24).
O que so, ou quais so, os sinais que direcionam DNMTs a metilar certas regies do DNA? Atualmente se sabe
que sequncias repetidas em tandem(?) do genoma, altamente repetitivas (a exemplo da cromatina
pericentromrica), dependem das marcas de metilao H3K9 para direcionar a metilao do DNA de novo, como
foi evidenciado na N.crassa e plantas (ver captulos 6 e 9). Repeties intercaladas tambm podem sinalizar
metilaes de DNA de novo, descritas no contexto de RIP na N. crassa (Tamaru and Selker 2001) e
silenciamento de retrotransposon na linha germinativa masculina de mamferos. Uma protena responsvel por
essa ltima foi identificada Dnmt31 e pode funcionar escaneando o genoma para identificar altos nveis de
junes homlogas-heterlogas que sinalizam a necessidade de metilao do DNA (Bourchis and Bestor 2004).
Nas plantas, o RNAs fornece o sinal para a metilao do DNA de novo , atravs de um mecanismo nico
denominado DNA metilao RNA-dependente (RdDM; ver cap. 9). Existe evidncia de que remodeladores de
cromatina da famlia SWI/SNF so em alguns casos necessrios para os padres globais de metilao do DNA,
como demonstrado em plantas para a protena DDMM1 e mamferos pelo homlogo Lshl. Por ltimo, a HKMT-
PcG protena Ezh2 pode tambm estar envolvida diretamente na metilao do DNA em certos promotores em
mamferos.
Uma vez estabelecido, o modo como a metilao do DNA pode funcionar para silenciar a cromatina no
totalmente claro, embora as evidncias apontem para a trans-regulao. Aglutinantes de citosinas metiladas,
chamados metil-CpG-binding domain proteins (MBD), podem ser considerados a DNA metilao equivalente a
aglutinantes (ou leitores) de motivos de histona modificados (fig 13). Por exemplo, a protena metilcitosina-ligante
(MeCP2) liga CpGs metilados e recruta HDACs para mediar marcas de histonas repressivas (ver cap 18). A
metilao do DNA tambm conhecida por perturbar os locais de reconhecimento de reguladores transcricionais
(ex, CTCF) que esto envolvidos no imprinting genmico.
A existncia do DNA metilado em loci imprintados que silenciam o alelo materno ou paterno em plantas e
na placenta dos mamferos sugere que no curso da evoluo eles unicamente aproveitaram esse mecanismo
epigentico para estabilizar a represso do gene. Curiosamente, em marsupiais, existe uma falta de metilao do
DNA no loci imprinted, indicando que o seu envolvimento no imprinting dos mamferos um evento evolucionrio
relativamente recente. Inversamente, em insetos dipteranos como a Drosophila, a metilao do DNA tem sido
largamente perdida como um mecanismo epigentico funcional.
Regies do genoma dos mamferos altamente repetitivas so tipicamente metiladas, tornando-se cada vez
mais mutagnicas quando no-metiladas, na medida em que causam instabilidade genmica global. Anomalias
cromossmicas ocorrem, que so a causa principal de muitas doenas e progresso do cncer. Isso destaca o
papel crucial que a metilao do DNA tem na integridade do genoma. Inversamente, bases de citosinas metiladas
de forma individual tem alta propenso a mutao espontnea. Assim, ao longo do tempo, C-T transies
ocorrem atravs de uma reao de desaminao (fig 13), mas esta caracterstica tambm pensada para ser
benfica, para proteger o genoma do anfitrio, pois desativa permanentemente sequncias de DNA parasitas tais
como transposons. Em um contexto diferente, essa mesma reao qumica ativamente catalisada pela
desaminase induzida por ativao, ou AID. A expresso da enzima em clulas B e T causa hipermutao
somtica no locus da imunoglobulina (Ig). Este um mecanismo importante para expandir o repertrio de
receptores de antgenos e consequentemente fortalecer a imunidade dos mamferos. A expresso de AID
observada em desenvolvimento precoce de mamferos tem levado a sugesto de que isso pode fornecer uma
rota alternativa para a desmetilao do DNA, embora isso possa acontecer com o risco de aumento nas
mutaes de ponto.
LEGENDA FIGURA 13:
Nucleotdeos de citosina que so metilados (Me) podem estar ligados por protenas metil DNA-ligantes (MDB). 5-
metilcitosina no ligada propensa a mutao espontnea atravs da desaminao (reao mostrada no painel
inferior), resultando em uma transposio 5-metil CpG para TpA na sequencia de DNA.

A metilao do DNA e a metilao das histonas so mecanismos proeminentes para a regulao epigentica do
genoma. Os RNAs no codificantes, como descrito na prxima seco, so importantes desencadeantes
primrios para induzir a cromatina silenciosa. tambm sabido que as molculas de RNA podem ser fortemente
metiladas no ncleo de acar ou nucleosdeo. Alm disso, a metilao na extremidade 3 de pequenos RNAs
no codificantes demonstrou estabilizar essas molculas (Yu et al., 2015). Intrigantemente Dnmt2 foi identificado
recentemente como uma tRNA metiltransferase (Goll et al, 2016). Portanto plausvel que de forma semelhante
aos DNMTs e HKMTs, os RNA metiltransferases existam como escritores de informaes epigenticas. Embora
no haja evidncia direta para isso.
No entanto, a metilao da RNA parece ser dectada por certos receptores tipo Toll (receptores transmembrana
que reconhecem motivos moleculares patognicos comuns) para mediar a imunidade inata (Ishii e Akira 2005),
corroborando com tal hiptese. Isto levanta a interessante possibilidade de que a metilao de RNA ainda possa
revelar-se uma terceira forma de modulao epigentica baseada na metilao.

10- O silenciamento de genes dirigidos por RNAi e RNA

O conhecimento de que a heterocromatina constitutiva em centrmeros e telmeros desempenha um papel

instrutivo na integridade do genoma tem contribudo para uma mudana de paradigma na maneira como o DNA
no codificante repetitivo visualizado. possvel que essas sequncias repetitivas sirvam um propsito que
est apenas comeando a ser elucidado? mesmo possvel que tais sequncias de DNA so sejam
completamente silenciosas? Esta possibilidade decorreu de uma sries de descobertas que ligaram RNAi
formao de cromatina silenciosa (heterocromatina).
O RNAi um mecanismo de defesa do hospedeiro que divide as espcies de dsRNA em pequenas molculas de
RNA, (conhecidas como RNA de interferncia curta ou siRNA). Este processo leva, em ltima instncia,
degradao do RNA ou ao uso do RNA pequenos para inibir a traduo, conhecida como silenciamento ps-
transcripcional (PTGS). O mecanismo de silenciamento de genes de transcrio mais recentemente descoberto
(TGS), que conduz formao de heterocromatina, foi descoberto atravs da convergncia de linhas
independentes de investigao em cromatina e maquinaria RNAi. Por outro lado , muito se sabe sobre metilao
repressiva do DNA (em fungos, plantas e mamferos). Modificaes da cromatina (por exemplo, H3K9me3) e
fatores assiciados cromatina (HPI) que so caractersticos de domnios da heterocromatina. Por outro lado, os
investigadores estavam a fazer progresso na identificao de fatores da maquinaria RNAi (por exemplo Dicer,
Argonaute, RNA polimerase dependente ou RdRP). O progresso mais convincente que uniu esses dois campos
aparentemente divergentes veio de estudos elegantes em S. pombe, * (Schizosaccharomyces pombe, tambm
chamada "levedura de fisso", uma espcie de levedura) onde mutaes de qualquer componente da
maquinaria RNAi resultaram em defeitos na segregao cromossmica (Hall et al., 202; Reinhart e Bartel202;
Volpe et at. Al., 202). Isto foi provocado pela incapacidade de estabilizar a heterocromatina centromrica e
sublinhou o papel generalizado provvel de mecanismos mediados por RNAi na produo de domnios
silenciosos de heterocromatina. Tambm destacou a importncia da heterocromatina alm do silenciamento
transcricional de genes, a um papel na manuteno da integridade do genoma e, consequentemente, da
viabilidade, como mostrado pela exigncia da heterocromatina centromrica para o processo de segregao
cromossmica. Evidncias emergentes tambm sugerem que siRNAs so necessrios na definio de outras
regies especializadas de heterocromatina funcional, tais como telmeros. A transcrio de ambas as cadeias de
DNA de repeties pericentromricas de S. pombe e a deteco de derivados de siRNA processados
proporcionaram uma forte evidncia de que o derivado de dsRNA era o substrato crtico para direcionar o
complexo RIT para os centrmeros para silenciamento (Verdel et al.,2004). Alm disso, os mutantes clr4 (o
ortgolo de pombe mamfero Suv39h HKMT) no conseguiram processar os dsRNA em siRNAs, reforando o
caso da interao entre a maquinaria de RNAi e a montagem de heterocromatina (Motamedi et al.;2004).
Exatamente como os siRNAs, gerados pela maquinaria RNAi (i.e Dicer, Argonaute, RdRP), iniciam a montagem
da heterocromatina ou a orientam para os loci genmicos apropriados ainda desconhecido. Surgiu um modelo
que possui uma complexa interao entre o complexo de maquinaria RNAi, RITS, e repeties centromricas,
conduzindo a um ciclo auto-reforado de formao de heterocromatina envolvendo Clr4, HDACs, swi6 (ortholog
para HPI de mamferos) e coesina, provavelmente via anelamento dirigido de RNA: RNA hbridos para a
transcrio nascente (fig.14) (captulos 6 e 8).

Em tetrahymena ( um gnero de protozorios ciliados no patognicos de vida livre cujos integrantes so

encontrados principalmente em gua fresca), foi identificado um mecanismo de direccionamento mediado por
RNA semelhante para direcionar o caso nico de eliminao de DNA que ocorre no ncleo somtico. Neste caso,
a transcrio ocorre a partir de ambas as cadeias das sequncias de segmentos eliminados internos (IES) no
genoma silencioso de linha germinal (micronuclear) em fase apropriada da via sexual (Chalker e Yao 2001,
Moshizuki et al., 2002) . Na mesma linha do modelo TGS dependente de RNAi (RNA interference- interferncia),
foi proposto um RNA de varrimento/scaneamento (scnRNA) modal para explicar como as sequncias de DNA no
macroncleo parental podem controlar, de forma epigentica, as alteraes genmicas no novo macroncleo,
envolvendo pequenos RNAs (ver Captulo 7) . Estes resultados emocionantes fornecem a primeira demonstrao
de um processo semelhante ao RNA (RNA-like) que altera diretamente um genoma somtico. Isto aumenta a
intrigante possibilidade de que RNSs intergnicos produzidos no locus VDJ (Bollnad et al., 2004) possam
potencialmente direcionar a eliminao da sequncia de DNA durante a recombinao VDJ do locus da cadeia
pesada (IgH) da imunoglobulina em clulas B e o receptor de clulas T (TCR) Loci em clulas T.
Nas plantas, h uma srie de ortlogos (originados de um nico gene do ltimo ancestral comum entre as
espcies- frequentemente possuem o mesmo papel biolgico dos ancestrais) para muitos dos compostos RNAi,
resultando em uma variedade de vias de RNA de silenciamento que podem agir com maior especificidade para
DNA seqncias particulares, embora haja alguma redundncia entre fatores. Estudos de RNAi mediado TGS em
plantas revelaram uma nova classe de RNA polimerasesRNA polimerase IV (ou RNA pol IV) que pode
transcrever DNA exclusivamente em regies heterocromticas (Herr e outros 2005, Pontier et al., 2005). Alm
disso, a demonstrao de que as vias RNAi afetam diretamente a metilao do DNA (Chan et al., 2004)
(explicada em detalhes no captulo 9).
Semelhante ao RNA (RNAi-like) efeitos da cromatina tambm foram descobertos na Drosophila e mamferos. Por
exemplo, o tratamento com RNase A de clulas de mamfero permeabilizadas remove rapidamente as marcas
heterocromticas H3K9me3, sugerindo que uma parte de RNA pode ser um componente estrutural de
heterocromatina pericentromrica (Maison et al., 2002). A ablao (ao de tirar, de arrancar, de arrebatar) de
fatores de processamento de siRNA (Small interfering DNA- so pequenos fragmentos de RNA) em vertebrados
prejudica a metilao de H3K9 e a ligao de HPI a heterocromatina pericentriomrica (Fukagawa et al., 2004).
Intrigavelmente, as clulas-tronco embrionrias (ES) ainda proliferam, mas no se diferenciam, em mutantes
dicer-null (Kenellopoulou et al., 2005), sugerindo uma conexo atualmente no compreendida entre a maquinaria
RNAi, RNAs no codificadores e o desenvolvimento de mamferos. Em Drosophila, silenciamento dos arranjos
tendem do gene mini-branco, sujeito a PEV (Position-effect variegation- Variedade de efeitos de posio: uma
variao causada pela inativao de um gene em algumas clulas atravs de sua justaposio anormal com
heterocromatina) tambm parece ser dependente da maquinaria RNAi (Pal-Bhadra et al., 2004).
Coletivamente, esses estudos indicam um papel crucial, e provavelmente primrio, para os RNA no
codificadores no desencadeamento de transies epigenticas e manuteno herdada de estados de cromatina
especficos do modelo/padro de cromatina. De fato, estes RNAs no codificadores forneceram a resposta para a
forma como diversas sequncias repetitivas em diferentes organismos conseguem a heterocromatinizao
atravs de um mecanismo de RNA-alvo. Em um esforo para identificar mais alvos de RNAi, o seqenciamento
de RNAs pequenos revelou que eles so amplamente transcritos a partir de transposons andognicos e outras
sequncias repetitivas em plantas, Drosophila e mamferos, entre outros organismos (Almeid e Allis 2005,
Bernstein e Allis 2005). Juntos, esses resultados indicam que o RNAi envolveu, em parte, para manter a
estabilidade genmica silenciando elementos mveis de DNA e viroses, e um mecanismo conservado na
maioria das espcies eucariticas. Agora, porm, parece no s que o silenciamento do RNA reprime as suas
sequncias invasoras, mas tambm que esse mecanismo bsico foi aproveitado pela clula para a
heterocromatinizao dos centrmeros, garantindo assim a correta segregao cromossmica e a integridade do
genoma.
Juntos, os exemplos acima indicam uma variao marcante no dogma central do controlo de genes que est a
comear a emergir da seguinte forma: DNA RNA no codificante cromatina funo do gene. A ideia de
que RNAs no-codificantes participariam ativamente em mecanismos semelhantes ao RNA (RNA-like) que
tambm se destinam a domnios especficos de locus para remodelao de cromatina e silenciamento de genes
nunca foi esperado.

Figura 14: Formao de Heterocromatina dirigida a RNA

Os transcritos de dsRNA (double - stranded RNA viroses: so vrus que possuem material gentico constitudo
por RNA fita dupla) de complementares, produzidos pela transcrio de ambas as cadeias ou pela dobra para
trs de transcritos de repetio invertidos, resultam na gerao de siRNAs atravs da ao de Dicer (tap). A
incorporao na gerao de siRNAs no complexo RITS atravs da ligao com a protena Argonaute (Ago) ativa
o complexo para direcionamento para DNA complementar ou RNA nascente. O complexo atrai Clr4, que transduz
a histona H3K9me2. O biner especfico da modificao, Swi6, liga-se a estas histonas modificadas, facilitando a
propagao de um domnio repressivo da cromatina. A ao de RdRP amplifica os nveis de siRNAs utilizando
siRNAs existentes como iniciadores, reforando a capacidade de direcionamento do complexo RITS (complexos
silenciadores da transcrio induzidos por RNA) para regies especficas do DNA.
11- De sistemas unicelulares a sistemas multicelulares (faltou boa parte do item 11)

Clulas dentro de organismos multicelulares podem ser divididas funcionalmente em dois compartimentos
maiores: clulas germinais (totipotentes e necessrias para a transmisso da informao gentica para a prxima
gerao) e clulas somticas (o centro de fora diferenciado de nosso organismo). H importantes perguntas de
como o compartimento da clula germinal mantm a totipotncia do seu epigenoma e quais mecanismo esto
envolvidos em apagar, estabelecer e manter o destino da clula (clula de memria). Pelo fato de uma clula
germinal poder dar origem a outra clula germinal, essencial que ela tenha um infinito potencial proliferativo,
como fazem os organismos unicelulares imortais. No entanto, para desempenhar este papel, as clulas
germinais esto, a maior parte do tempo, em repouso ou no respondendo aos estmulos externos, ento a
integridade do seu epigenoma pode ser protegida. De fato, os ocitos de mamferos podem ser retidos em um
estado em repouso por mais de 40 anos. Similarmente, clulas tronco adultas (multipotentes), so largamente
uma populao de clulas dormentes, proliferando (e se auto renovando) apenas quando estimuladas pelo
estmulos mitognicos para entrarem em um nmero restrito de divises celulares. Portanto, a maquiagem do
epigenoma desafiada por muitos sinais intrnsecos (e.g., transcrio, replicao de DNA, segregao do
cromossomo) e externos (e. g., citocinas, hormnios, dano do DNA ou resposta de estresse geral),
particularmente se a diferenciao somtica forou as clulas a deixarem as clulas germinativas protetoras e
ambiente das clulas tronco.

12- Polycomb e Trithorax (grupos de protenas):

Entre alguns dos principais efetores que podem transduzir sinais para a cromatina modelo e participar da
manuteno da identificao celular (i.e., prover memria celular) so membros dos grupos de genes PcG e trxG
(Ringrose and Paro 2004). Esses genes foram descobertos em Drosophila em virtude de seu papel na regulao
do desenvolvimento da famlia (cluster) do gene Hox e regulao do gene hemetico. PcG e TrxG se mostraram
como forma de chaves reguladoras para a proliferao celular e identificao celular em eucariotos
multicelulares. Alm do mais, estes grupos de genes esto envolvidos em vrias cascatas de sinalizao que
respondem para os mitgenos e morfgenos: regular a identificao de clulas tronco e proliferao, vernalizao
em plantas, transformao hometica e transderterminao, comprometimento de linhagem durante
diferenciao de clulas B e T e muitos outros aspectos do desenvolvimento do metazorio. Abordamos
brevemente o que conhecido sobre como as famlias dos genes PcG e o trxG convertem pistas em
desenvolvimento dentro de uma memria epigentica entre a estrutura da cromatina.
As protenas PcG e trxG das protenas funcionam, em grande parte, de forma antagnica: a famlia de protenas
PcG estabelece um estado de cromatina silenciado e a famlia trxG de proteinas, em geral, propaga a atividade
dos genes. A identificao molecular do gene Pc conhecido por estabilizar padres de represso gentica
durante vrias geraes celulares proporcionou a primeira evidncia de um mecanismo molecular para clulas de
uma protena contendo cromodomnio com um elevado grau de semelhana com o cromodomnio da protena
HPI associada a heterocromatina (Paro e Hogness, 1991).
Como mencionado acima, os cromodomnios esto bem documentados como mdulos especficos de ligao a
meti lisina de histona (ilustrados na Fig. 10).
Aproximadamente 20 genes PcG e um pelo menos 15 genes trxG distintos foram identificados em Drosophila.
Anlises funcionais mostraram que esses grupos de genes constituem um espectro de protenas diversas, mas
so altamente conservadas entre eucariotas. Os genes PcG codificam produtos que incluem protenas de ligao
ao ADN (por exemplo, YY1), enzimas modificadoras de histonas (por exemplo, EZh2), outros fatores repressivos
associados cromatina que contm um cromodominio com afinidade para H3K27me3 (por exemplo, PC). Os
genes trxG codificam fatores de transcrio (e.g., GAGA ou Zeste), enzimas de remodelao da cromatina
dependentes de ATP (por exemplo, Brahma) e HKMTs tais como Ash1 e Trx (ou os seus homlogos de mamfero
MLL, Set1 e a Famlia MLL). Na maioria dos casos, as famlias trxG e PcG de protenas funcionam como
componentes de diversos complexos para estabelecer estruturas de cromatina estveis que facilitam a
ecropenso ou silenciamento de genes regulados pelo desenvolvimento (ver captulos 11 e 12).
Apesar dos avanos recentes, o mecanismo pelo qual os complexos PcG ou trxG-containig so enviados para
regies de cromatina de desenvolvimento regulado no bem compreendido. Em Drosophila, a represso
gentica hereditria requer o recrutamento de complexos de protena PcG para elementos de DNA chamados
elementos de resposta de policomb (PREs). As sequncias equivalentes nos mamferos permaneceram alusivas.
nuclear como os complexos de protena PcG causam silenciamento de longo alcance de uma maneira PRE-
dependente, porque os PREs so normalmente localizados em quilobases a partir do local de incio da
transcrio dos genes alvo. Pode-se postular que a repulso ou o recrutamento de complexos PcG podem ser
discriminados por mudanas na atividade transcricional, ou diferenas no processamento produtivo versus no-
produtivo do ARNm (Pirrota, 1998 e Schmitt et al. 2005)
Os modelos atuais suportam a ligao de PcG atravs da interao com protenas de ligao a ADN e a
afinidade do cromodomnio dentro da protena de PC para as histonas modificadas com H3K27 me3 (Cao et al.,
2002). No entanto, os complexos PcG tambm podem associar citro com nucleossomos que carecem de cauda
de histona (Francis et al., 2004) e, alm disso, os elementos PRE tm uma densidade nucleosmica reduzida
(Shwartz et al., 2005). A explicao mais lgica para algumas destas observaes dspares que a ligao de
PcG in vivo inicialmente exigiria a interao com fatores ligados ao ADN que ento estabilizada por associao
com nucleossomas e modificou H3K27me3 na regio adjacente da cromatina. Claramente, mais pesquisa
necessria para ligar a evidncia existente de como os complexos de PcG so alvejados s regies da cromatina
e como medeiam a represso. Isto provavelmente dependente do organismo, porque existe uma grande
heterogeneidade nos complexos PcG (ver Captulo 11).
As protenas do grupo trithorax mantm, em geral, um estado ativo de expresso gnica em genes alvo e
sobrepe ou impendem o silenciamento mediado por PcG. Essa transio at menos entendida, mas
evidncias recentes sugerem que um mecanismo baseado em RNA poderia fornecer o gatilho para o
recrutamento de Ash l para direcionar os promotores. Um nmero de mudanas transientes e estveis na
estrutura da cromatina so pensados para acontecer, talvez facilitado por transcrio intergnica que pode
estabilizar um domnio de cromatina aberto e mediar a substituio de histonas ativas. Mudanas de cromatina
documentadas incluem marcas da incorporao de metilao na lisina de histona ativa, por exemplo, trxG HKMTs
assim como Trx e Ash l, e a leitura dessas marcas. A ao de fatores de remodelamento de cromatina ATP-
dependente trxG assim como Brahma tambm requerido, embora como esses mecanismos interagem tem
ainda que ser completamente determinado.
Muitas protenas PcG e trxG cooperam para manter um nvel altamente controlado de
heterocromatina reprimida versus eucromatina ativa em clulas normais. Em ncleos somticos em interfase de
mamferos, a morfologia nuclear revela que domnios constitutivos de heterocromatina pericentromrica so
agrupados dentro de 15-20 focos. A desregulao do controle do destino celular e da proliferao, que leva a
anormalidade do desenvolvimento e cncer, frequentemente exibe morfologias nucleares anormais. Por exemplo,
a organizao nuclear em PML-leucemia (relacionada a leucemia de linfcitos mista [MML]) as clulas mostram
um ausncia de focos pericntricos. Em contraste, as clulas senescentes (no proliferativas) exibem uma
morfologia nuclear com grandes clusters de ectpica heterocromatina. Assim, morfologia nuclear parece ser um
bom marcador para distinguir entre estados celulares normais e aberrantes, indicando que a arquitetura nuclear
pode ainda desempenhar um papel regulatrio em manter domnios especializados da cromatina.
O estudo de nveis de modificao de histonas outro indicador de normalidade ou anormalidade
celular. Muitas dessas mudanas so atribudas desregulao de PcG ou trxG HKMTs, contribuindo para a
progresso e at o potencial metasttico de um tumor. De fato, o aumento de nveis globais de qualquer uma das
protenas acima mencionas associado com risco aumentado de cncer de prstata, cncer de mama, mieloma
mltiplo ou leucemia. Em outros casos de transformao neoplsica, h uma diminuio manifesta nas marcas
de histonas repressivas e aumento global de estados acetilados causando nveis elevados de transcrio gnica
e instabilidade genmica. Claramente, mudanas no controle global de cromatina, possivelmente atravs da
perturbao das enzimas modificadoras de histonas, afeta a funcionalidade do genoma e alteram o perfil de
expresso gnica apropriado de uma clula normal.
No caso de senescncia celular, um aumento nas marcas de histonas repressivas tambm um
indicador de disfuno celular. Isso, concomitantemente com a definio reduzida de acetilao de histonas,
pode reforar e at mesmo aumentar os nveis de cromatina silenciosa, bloqueando a plasticidade celular e
conduzindo as clulas para um estado antiproliferativo. Este em grande parte um efeito relacionado com a
idade, embora o estado de doena, progeria, pode antecipadamente avanar o envelhecimento. Em
contrapartida, quando as marcas de metil pericentromeric repressivo so diminudos em mutantes sem a enzima
de transduo (Suv39h), clulas exibem ndices de imortalidade, no sendo mais senescente, e mostram maiores
ndices de instabilidade genmica. Esses exemplos ilustram que a desregulao de cromatina, demonstrados por
nveis de marcas de histonas caractersticas, frequentemente induzida por enzimas PcG e trxG, e pela morfologia
nuclear, est se revelando um indicador importante da progresso da doena.
13- Inativao e heterocromatina facultativa

O silenciamento de genes mediado por PcG e a inativao do cromossoma X so exemplos primordiais para
transies reguladas pelo desenvolvimento entre estados de cromatina ativos e inativos (ver Fig. 17),
frequentemente referidos como heterocromatina facultativa. Isto est em contraste com a heterocromatina
constitutiva, que pode por defeito ser induzida em regies no codificantes e altamente repetitivas. A
heterocromatina facultativa ocorre em regies de codificao do genoma, onde o silenciamento de genes
dependente, e por vezes reversvel, de decises de desenvolvimento que especificam destinos celulares
distintos.
Um dos exemplos mais bem estudados para a formao de heterocromatina facultativa a inativao de um dos
dois cromossomas X em mamferos fmeas para equalizar a dosagem de expresso de genes ligados ao X com
machos que possuem apenas um cromossoma X (e um cromossoma Y heteromrfico). Aqui, o silenciamento
gentico do cromossoma inativo do cromossomo X induz um elevado grau de compactao Xi que visvel como
o corpsculo de Barr, localizado na periferia nuclear das clulas das fmeas mamferas.
Como os dois alelos dos cromossomos x so contados e como um cromossomo x particular escolhido para
inativao so questes desafiadoras na pesquisa epigentica de hoje.
X inativao envolve um grande (~ 17kb) noncoding RNA, XIST, que parece agir como o principal gatilho para a
cromatina remodelao no Xi. Embora exista o potencial para formar dsRNA entre Xist e o transcritor antisentido
TXist (expressa apenas antes do incio da inativao x), no existe evidncia convincente de mecanismos
independentes RNA envolvidos no incio da inativao x. O centro de inativao de x e os provveis stios de
entrada ou de acoplamento de DNA (postulados como elementos de DNA repetitivos especializados que so
enriquecidos no Xi em CIS. XIST promovem o recrutamento e a ao de ambos os complexos PRC1 (complexo
repressivo de polycomb) e PCR2 , Envolvidos no estabelecimento de um cromossoma x estvel inativo Os
componentes da PCR2 incluem, por exemplo, a enzima modificadora da cromatina HKMT, EZH2, que catalisa a
H3K27me. A ligao do complexo PCR1 pode ser promovida tanto pelo H3K27me3 como pelos meios
independentes da modificao das histonas, enquanto outros componentes As modificaes da cromatina, o
complexo de PcG que se liga incorporao subsequente da variante de histona macroH2A ao longo do xi, e a
metilao de ADN extensa, contribuem para o aumento da complexidade do complexo PcG, como as protenas
do anel 1, o ubiquirinato H2A. Gerando uma estrutura de heterocromatina facultativa ao longo de todo o
cromossoma X. Uma vez estabelecida uma estrutura heterocromtica estvel, o ARN XIST no mais
necessrio para a sua manuteno. Uma forma semelhante de silenciamento monoallico a impresso
genmica, que tambm usa um ARN no codificador ou antisentido para silenciar uma cpia allica numa
especificao de origem de pai especfico. Atualmente no est claro se e como as clulas ES de camundongo
Dicer-mutante afetariam os processos de inativao x ou de impresso genmica
Diferentes formas de cromatina silenciosa tm sinais primrios diferentes, mas muitas so susceptveis de serem
relacionadas com a transcrio de ARN (de transcritos aberrantes, para ARN xist, para ARN ds) dependendo da
natureza da sequencia de ADN subjacente. Isto desencadeia o estabelecimento de uma coleco de alteraes
de cromatina, incluindo uma combinao de modificaes de histonas (H3K9, H3K27, metilao de H4K20), a
ligao de protenas ou complexos repressivos cromatina, a metilao do ADN e a presena de variantes de
histonas. As heterocromatinas facultativas ou constituintes mostram agrupamento visvel no ncleo. A represso
eucromtica no pode ser determinada por padres de morfologia nuclear.
O paradigma geral da compensao de dosagem, um mecanismo clssico controlado epigenticamente,
tambm foi abordado em outros organismos modelo, notadamente C. elegans (Meyer et al., 2004, Captulo 15) e
Drosophila (Gilfillan et al., 2004, captulo 16). Ainda no est claro se a compensao da dosagem ocorre em
aves, apesar de comerem organismos heterogneos. Em Drosophila, uma compensao de dosagem entre os
sexos no ocorre pela inativao do X na fmea, mas por uma dupla regulao positiva a partir do nico
cromossomo X no macho. Intrigantemente, dois noncoding RNA, roX1 e roX2, so conhecidamente componentes
essenciais, e sua expresso macho-especfico (male-specific). Embora mecansticos similares existam entre
moscas e mamferos, claro que a ativao da remodelao da cromatina e modificaes nas histonas,
notadamente a acetilao de H4K16 dependente de MOF no cromossomo X masculino, desempenha um papel
chave na compensao da dosagem de Drosophila. Saber exatamente como a modificao da histona acontece,
como o MOF histone acetiltransferase, so direcionados para o macho X cromossomo permanece um desafio
para estudos futuros. Alm disso, pensa-se que as atividades de remodelao da cromatina dependentes de
ATP, tais como o fator de remodelao dos nucleossomos (NURF), antagonizam as atividades do complexo de
compensao de dosagem (DCC).
Juntas, esta seo e as Sees 10 e 11 descreveram mecanismos para modificaes de cromatina
dirigidas a RNA, como ocorrem para a heterocromatina constitutiva, o cromossomo Xi e, possivelmente, tambm
para o silenciamento gnico mediado por PcG. Com base nos paralelos intrigantes, pode-se postular que uma ou
mais unidades de ARN do ADN no emparelhado proporcionariam um gatilho primrio atraente para estabilizar
complexos PcG em PREs ou uma funo promotora comprometida, onde podem "sentir" a qualidade do
processamento transcricional. Erros de alongamento e / ou de sondagem aberrantes ou estancados podem
estimular a interao entre o PcG ligado a PRE e um promotor que resulta no encerramento da transcrio.
Assim, a iniciao do silenciamento de PcG seria induzida pela transio da transcrio produtiva para a no
produtiva. O grau em que os complexos trxG podem utilizar o controle da qualidade do ARN e / ou o
processamento de transcritos de RNA primrios como parte da manuteno de estados de transcrio "ON"
comea a ser desvendado (Sanchez-Elsner et al., 2006).

Figura 17. Induo Dirigida pelo ARN de Estados de Cromatina Reprimidos

Diferentes formas de cromatina silenciosa tm sinais primrios diferentes, mas muitas so susceptveis de estarem
relacionadas com transcritos de RNA (de transcritos aberrantes, para RNA de Xist, para dsRNAs), dependendo da
natureza da sequncia de DNA subjacente. Isto desencadeia o estabelecimento de uma coleo de alteraes de
cromatina, incluindo uma combinao de modificaes de histonas (metilao de H3K9, H3K27 e H4K20), a ligao de
protenas ou complexos repressivos (por exemplo, PC ou HP1) cromatina, metilao do DNA e Presena de
variantes de histonas (por exemplo, macroh2A no cromossoma X inativo). A heterocromatina facultativa ou constitutiva
apresenta agrupamento visvel no ncleo. A represso da cromatina no pode ser determinada por padres de
morfologia nuclear.

14- Reprogramando o destino das clulas

A questo de como o destino das clulas pode ser alterado ou revertido h muito intrigou cientistas. A
clula germinativa e as clulas embrionrias iniciais distinguem-se de outros compartimentos celulares como a
ltima clula-tronco por sua totipotncia inata. Embora a especificao do destino celular em mamferos permita
cerca de 200 tipos de clulas diferentes, existem, a princpio, duas transies de diferenciao principais: de uma
clula-tronco (pluripotente) para uma clula totalmente diferenciada e entre uma clula em repouso (quiescente
ou G0) e uma clula proliferativa. Estes representam os extremos pontos finais entre muitos intermedirios,
consistentes com uma multido de diferentes composies do epigenoma no desenvolvimento de mamferos.
Durante a embriognese, um aumento dinmico de modificaes epigenticas detectado na transio do
ovcito fecundado para o estgio de blastocisto, e depois na implantao, gastrulao, desenvolvimento de
rgos e crescimento fetal. A maioria destas modificaes ou impresses podem ser apagadas atravs da
transferncia de um ncleo celular diferenciado para o citoplasma de um ocito anucleado. No entanto, algumas
marcas podem persistir, restringindo assim o desenvolvimento normal de embries clonados, e alguns poderiam
at ser herdados como modificaes da linha germinal que, em mamferos, so susceptveis de incluir metilao
do DNA. A regenerao do fgado e o reparo das clulas musculares so excees dos tecidos de mamferos
que podem regenerar-se em resposta a danos ou leses, embora a maioria dos outros tecidos no possam ser
reprogramados. Em outros organismos, como plantas e Axolotl, certas clulas somticas podem realmente
reprogramar seu epigenoma e reentrar no ciclo celular para regenerar o tecido perdido ou danificado (Tanaka
2003). Em geral, no entanto, a reprogramao de clulas somticas no possvel a menos que sejam
projetadas para recapitular o desenvolvimento precoce da transferncia nuclear (NT) para o ocito enucleado.
Isto foi demonstrado pela primeira vez em rs clonadas (Xenopus), e mais recentemente pela gerao de Dolly, o
primeiro mamfero clonado (Campbell et al., 1996, ver Captulo 22).
Trs grandes obstculos reprogramao somtica eficiente em mamferos foram identificados. Em
primeiro lugar, certas marcas epigenticas somticas (por exemplo, H3K9me3 repressivo) so estavelmente
transmitidas atravs de divises de clulas somticas e resistem reprogramao no ocito. Em segundo lugar,
o ncleo de clulas somticas incapaz de recapitular a assimetria de reprogramao que ocorre no embrio
fecundado como consequncia das marcas epigenticas diferenciadas herdadas pelos genomas de machos e
fmeas haplides (Mayer et al., 2000, van der Heijden et al. 2005: Captulo 20). Terceiro, a transmisso de loci
impressos que so particularmente importantes no desenvolvimento fetal e placentrio no fielmente mantida
em NT (Morgan et al., 2005). A maioria dos embries clonados abortam, sugerindo que as impresses
epigenticas perturbadas representam um grande ponto de apoio para o desenvolvimento normal e podem ser a
causa da fraca eficincia das tecnologias de reproduo assistida (ART) e do reduzido vigor dos animais
clonados. Usar clulas-tronco embrionrias versus usar clulas somticas mostra um potencial de reprogramao
muito maior. A demonstrao de que as clulas quiescentes (um carter frequente das clulas-tronco) tm uma
reduo nos estados globais H3K9me3 e H4K20me3 pode ser um fator que indica uma plasticidade melhorada
do epigenoma (Baxter et al 2004). Isso tambm consistente com o fato de que em organismos unicelulares
imortais (por exemplo, levedura) com um genoma amplamente aberto e ativo, faltam vrios canais epigenticos
repressivos.

Figura 18. Reprogramao por Transferncia Nuclear

Durante o tempo de vida de um indivduo, modificaes epigenticas (mod) em diferentes linhagens celulares
(esquerda). Transferncia nuclear (NT) de uma clula somtica inverte o processo de diferenciao terminal,
erradicando a maioria das marcas epigenticas (mod); no entanto, alguma modificao tambm estaria presente na
linha germinativa (g-mod) no podendo ser removida. Durante a transformao neoplsica (de um normal para uma
clula tumoral) causada por uma srie de mutaes genticas (estrelas vermelhas), leses epigenticas acumuladas
(mod). As leses epigenticas, mas no as mutaes, podem ser apagadas atravs da reprogramao em NT. Essa
abordagem avalia a interao entre as contribuies genticas e epigenticas tumorignese.
Outra caracterstica da reprogramao epigentica normal em mamferos, ps-fertilizao, a sua
assimetria distinta. Isto pode primeiro ser atribudo a diferentes programas de especificao epigentica nas
clulas germinativas masculinas e femininas (captulos 19 e 20). O genoma do esperma composto em grande
parte de protaminas, embora haja um nvel residual mas significativo de CENP-A (uma variante de histona H3) e
outras impresses epigenticas putativas (Kimmins e Sassone-Corsi 2005), enquanto que o ocito constitudo
de Nucleossomo contendo cromatina. Uma vez fertilizados, os espermatozides e os genomas haplides de
ocitos tm outro ciclo de reprogramao envolvendo desmetilao de DNA e troca de variantes de histonas. As
modificaes podem aumentar ou equilibrar diferenas epigenticas dos dois genomas parentais antes da fuso
nuclear, no primeiro ciclo celular. Durante a diferenciao de tecidos embrionrios (isto , massa celular interna
[ICM]) e extra-embrionrios (i.e., trofoblasto [TE] e placenta), so estabelecidos diferentes perfis de metilao de
DNA e modificao de histonas entre linhagens (Morgan et al). A clonagem somtica no pode recapitular
fielmente estes padres de reprogramao, mostrando desmetilao rpida, mas menos extensa, no primeiro
ciclo celular, e metilao do DNA perturbada e metilao da lisina das histonas entre as clulas ICM e TE.
Uma preocupao estreitamente relacionada na reprogramao de clulas somticas o destino dos loci
de genes imprintados (a palavra em ingls imprited). Para o desenvolvimento embrionrio normal prosseguir,
a expresso allica correta nos loci imprintados requerida (Captulo 19). Isto foi demonstrado pelas
experincias seminal que geraram embries uniparentrios (Barton et al., 1984, McGrath e Solter, 1984, Surani et
ai, 1984). Os embries androgenticos (ambos genomas so de origem masculina) exibiram um desenvolvimento
embrionrio retardado, mas hiper-proliferao de tecidos extra-embrionrios (por exemplo, placenta). Em
embries ginognese ou partenognese (ambos os genomas so de origem feminina), a placenta
subdesenvolvida. Uma marca especfica do pai deve, portanto, ser estabelecida na clula germinativa aps o
apagamento de marcas preexistentes (Captulo 20). Acredita-se que isto ocorre para aproximadamente 100 ou
mais genes imprintados, largamente envolvidos em sistemas de proviso de recursos para desenvolvimento
embrionrio e placentrio (por exemplo, fator de crescimento Igf2). Curiosamente, h evidncias de que a
imprintao pode ser perturbada durante a cultura in vitro de embries produzidos por ARV ou transferncia
nuclear (Maher 2005).

15 - Cncer

H um delicado equilbrio entre auto-renovao e diferenciao. A transformao neoplsica (tambm

referida de forma semelhante como tumorignese) considerada como o processo pelo qual as clulas sofrem
uma alterao envolvendo proliferao celular descontrolada, uma perda de controle de checkpoint tolerando a
acumulao de aberraes cromossmicas e aneuploidias genmicas e diferenciao mal regulada (Lengauer et
al. 1998). comumente pensado como sendo causado por pelo menos uma leso gentica, tal como uma
mutao pontual, uma deleo ou uma translocao, interrompendo quer um gene supressor de tumor quer um
oncogene (Hanahan e Weinberg 2000). Os genes supressores de tumor tornam-se silenciados em clulas
tumorais. Os oncogenes so ativados atravs de mutaes dominantes ou sobre-expresso de um gene normal
(proto-oncogene). importante notar que uma acumulao de modificaes epigenticas aberrantes tambm
est associada a clulas tumorais (ver Captulo 24). As alteraes epigenticas envolvem padres alterados de
metilao do DNA, modificaes das histonas e estrutura da cromatina (ver Fig. 19). Assim, a transformao
neoplsica um processo complexo de mltiplos passos envolvendo a ativao aleatria de oncogenes e / ou o
silenciamento de genes supressores de tumores, atravs de eventos genticos ou epigenticos, e referida
como a teoria "Knudson two hit " (Feinberg 2004; Feinberg e Tyko 2004). Para ilustrar, o silenciamento do gene
do retinoblastoma (Rb), um supressor tumoral, provoca a perda do controle do checkpoint, o que no s
proporciona uma vantagem proliferativa, mas tambm promove um "segundo ataque" ao afetar as funes a
jusante (downstream) relacionadas com a estrutura da cromatina que mantm a integridade do genoma (Gonzalo
e Blasco, 2005). A ativao inapropriada de um produto oncognico, como o gene myc, pode ter um efeito
semelhante (Knoepfler et al 2006).
Uma questo levantada pela atual pesquisa : at que ponto as alteraes epigenticas aberrantes
contribuem para a incidncia e comportamento global de um tumor? Isto foi abordado por experimentos NT
utilizando um ncleo de clulas de melanoma como dador (Hochedlinger et al 2004). Quaisquer leses genticas
da clula doadora permanecem; No entanto, o NT apaga a composio epigentica. A incidncia de tumores de
fetos de ratos clonados foi ento estudada, indicando que o espectro de tumores que surgiram de novo variou
grandemente, consistindo com diferentes contribuies de modificaes epigenticas em diferentes tecidos que
desencadeiam a progresso neoplsica.
A hipometilao do DNA (em oposio hipermetilao) pode ocorrer em discretamente em alguns loci
ou de forma disseminada em regies cromossmicas. A hipometilao do DNA foi, de fato, o primeiro tipo de
transio epigentica associada a ao cncer (Feinberg e Vogelstein 1983). Isto revelou-se um fentipo difundido
de clulas cancerosas. No nvel do gene individual, a hipometilao do DNA pode ser neoplsica devido
ativao de proto-oncogenes, a desregulao de genes que causam a funo celular aberrante ou a expresso
biallica de genes imprintados (tambm denominada perda de imprinting ou LOI) (veja captulos 23 e 24). Em
uma escala genmica mais global, a hipometilao generalizada do DNA, particularmente em regies de
heterocromatina constitutiva, predispe as clulas a translocaes cromossmicas e aneuploidias que contribuem
para as progresses do cncer. Este efeito recapitulado em Dnmt1 mutantes (Chen et al., 1998) A instabilidade
genmica que ocorre quando h hipometilao do DNA se deve provavelmente ao efeito mutagnico da
reativao do transposon. Com a ateno voltada para o papel essencial que modificaes em histonas
repressivas desempenham em manter a heterocromatina em centrmeros e telmeros, surgiram evidncia de
que, se essas marcas so perdidas, a estabilidade do genoma tambm perdida, contribuindo para a progresso
do cncer (Gonzalo e Blasco 2005).
Inversamente, a hipermetilao do DNA concentrada nas regies promotoras de ilhas CpG em muitos
cancros. O silenciamento de genes supressores de tumores atravs de tal hipermetilao de DNA
particularmente crtico na progresso do cncer. Estudos recentes revelaram que existe uma considervel
relao entre as modificaes da cromatina e a metilao do DNA, demonstrando que mais de um mecanismo
epigentico pode estar envolvido no silenciamento ou um gene supressor tumoral. Como ilustrao, sabe-se que
os genes supressores de tumores, p16 e hMLH1, so silenciados tanto pela metilao do DNA como pela
metilao da lisina da histona repressiva no cancro (McGarvey et al. 2006).
A desregulao dos modificadores da cromatina est implicada em muitas formas de cncer.
Determinadas enzimas modificadoras de histona tornam-se ontognicas, tais como a proteina PcG EZH2 e a
protena trxG MLL, e exercem a seu efeito atravs da perturbao da identidade epigentica das clulas, que
consequentemente silencia a transcrio ou ativa genes imprprios (Schneider et al. 2002; Valk-Lingbeek Al.
2004). claro que a identidade epigentica crucial para a funo celular. De facto, o padro global das marcas
de histonas acetil e etil est a revelar-se um sinal distintivo para a agresso de certos cancros, como
demonstrado pelo estudo da progresso do tumor da prstata (Seligson et al., 2005).

Figura 19. Modificaes Epigenticas em Cncer.

LEGENDA: (a) As marcas epigenticas aberrantes em loci causadores de cncer envolvem tipicamente a
desrepresso de oncogenes ou a localizao de genes supressores de tumores. As marcas epigenticas
conhecidas para alterar uma clula normal incluem a metilao do DNA, metilao de histonas repressivas e
desacetilao de histonas. (b) O uso de agentes teraputicos epigenticos para o tratamento de cncer tem
conseqncias no modelo de cromatina, ilustrado para um locus supressor de tumor. A exposio a inibidores de
Dnmt resulta numa perda de metilao do DNA, e a exposio a inibidores de HDAC resulta na aquisio de
marcas de histona acetil e subsequentes modificaes a jusante, incluindo histonas ativas marcadas por metil e
incorporao de variantes de histonas. As alteraes cumulativas da cromatina levam reexpresso gentica.
 O desenvolvimento de alvos de frmacos que inibem a funo das enzimas efetoras abriu um novo horizonte
para a teraputica oncolgica (ver o exemplo 19) ou seja, o uso de inibidores de DNMT e HDAC encontra-se nos
estgios mais avanados ou ensaios clnicos nesta nova gerao de terapias contra o cncer. Zeabularine e
SAHA so, respectivamente, dois tais inibidores. So clulas cancerosas particularmente benficas que tm
reprimido genes supressores de tumor J.C Cheng et al. 2004; Garcia-Manero e Issa 2005: Marks e liang 2005),
por causa do tratamento Jeads de simulao transcripcional (??because treatment Jeads to transcriptional
simulation.??). Uma proporo importante de metilao de lisina de histona repressiva perdida durante o
tratamento, provavelmente devido transcrio acoplada sua troca e substituio de nucleosoma; Contudo,
estes inibidores no alteram significativamente o H3K9me3 nas regies promotoras alvo (McGarvey et al., 2006).
Continua a ser resolvido se as marcas repressivas que persistem poderiam induzir o re-silenciamento
subseqente de genes supressores de tumor quando o tratamento pausado, contrariando assim o benefcio da
"terapia epigentica". possvel que uma estratgia de terapia dual: pigenetic, usando DNMT e HDAC Podem
prometer um melhor prognstico em ensaios clnicos.
A identificao de inibidores de outras classes de modificadores de histonas, nomeadamente HKMTs e PRMTs,
est atualmente em fase de desenvolvimento. H aproximadamente 50sET domnio HKMTs exclusivo no genoma
de mamferos. A maioria das enzimas caracterizadas, tais como suv39H, EZH2, MLL e RIZ, j foram implicadas
no desenvolvimento de tumores (Schneider et al 2002). Assim, as telas de alto rendimento HTs Esto sendo
empregados em efeitos para identificar pequenas Inibidores de pequenas molculas que poderiam ser utilizados
na pesquisa exploratria e, eventualmente, na terapia do cncer. Todas as classes de enzimas modificadoras de
histonas so adequadas para tal abordagem de aplicao, como os seus stios de ligao de substrato
especficos (isto , a pptidos de histonas), em Contraste com o cofator genrico, (Por exemplo, acetil CoA e
SAM), permitiria um desenvolvimento de frmacos mais seletivos. HTS tm sido bem sucedidos para HDACs (Su
et al., 2000) PRMTs (D. Cheng et al 2004) e HKMTs (greinet et al., 2005).

Para que a transferncia do conhecimento ocorra da pesquisa bsica para a aplicada, tanto as abordagens
empricas como as orientadas pela hiptese so necessrias para, em ltima instncia, definir a eficcia e a
utilidade de qualquer inibidor enzimtico modificador de histonas. Por exemplo, os inibidores seletivos de HKMT
contra MLL ou EZH2 podem ser agentes teraputicos valiosos para leucemia ou cncer de prstata.
Alternativamente, a utilizao de um inibidor de HKMT SUV39H, que pareceria contra-intuitivo devido
necessidade desta enzima na manuteno constitutiva da heterocromatina e da estabilidade do genoma, pode
ainda preferencialmente sensibilizar clulas tumorais. Alm disso, a anlise do inibidor de HDAC SAHA revelou
que ele pode operar atravs de vias adicionais, distintas da reativao da transcrio (Marks e Jiang, 2005). Por
exemplo, os inibidores de HDAC podem tambm sensibilizar leses de cromatina, inibindo a reparao eficiente
do DNA e permitindo instabilidades genmicas que podem desencadear na apoptose de clulas tumorais. Estas
observaes tero de ser monitorizadas para avaliar a eficcia das terapias de combinao dupla. No entanto, no
presente estudo, o uso de inibidores de HDAC e HKMT pode ser mais seletivo na morte de clulas pro-
neoplsicas por leva-las a sobrecarga de informao e catstrofe da cromatina. Espera-se que a pesquisa
contnua identifique os candidatos viveis para a eficiente terapia epigentica do cncer.

16. O que o controle epigentico realmente faz?

Aproximadamente 10% do pool de protenas codificado pelo genoma dos mamferos desempenha um papel na
transcrio ou regulao da cromatina (banco de dados Swiss-Prot). Dado que o genoma dos mamferos consiste
em 3X109 bp, deve acomodar aproximadamente 1x107 nucleossomos. Isto d origem a uma vasta gama de
possveis mensagens reguladoras, incluindo interaes de ligao a DNA, modificaes de histonas, variantes de
histonas, remodelamento de nucleossomos, metilao de DNA e RNAs no-codificantes. No entanto, o processo
de regulao da transcrio por si s bastante complexo, muitas vezes requerendo a montagem de grandes
complexos multiproticos (> 100 protenas) para assegurar a iniciao, alongamento e processamento correto de
RNA mensageiro de um nico promotor selecionado. Se a regulao especfica da sequncia de DNA to
elaborada, seria de esperar que as associaes de baixa afinidade ao longo do polmero dinmico histona-DNA
fossem ainda mais. Com base nestas consideraes, raramente haver uma modificao que se correlacione
com um estado epigentico. Mais provavelmente, e como a evidncia experimental sugere, a combinao ou
efeito cumulativo de vrios sinais (provavelmente muitos) numa regio de cromatina prolongada que estabiliza e
propaga estados epigenticos (Fischle et al., 2003b, Lachner et al., 2003, Henikoff, 2005).
Na maioria das vezes, a ligao do fator de transcrio passageira e perdida em divises celulares
sucessivas. Para a persistncia de padres de expresso de genes, a transcrio de fatores requerida em cada
diviso celular subsequente. Assim sendo, o controle epigentico pode potencializar um primeiro sinal (e.g.,
estimulao do promotor, silenciamento gnico, definio de centrmero) para geraes celulares sucessivas
(mas no indefinidas) gerao de clulas pela transmisso herdada de informaes pelo modelo de cromatina
(Figura 20). Curiosamente, em S. pombe, a variao epigentica de Swi6-dependente pode ser suprimida por
muitas divises celulares durante a mitose e a meiose (Grewal e Klar, 1996) por modificaes de histonas (mais
provavelmente H3K9me2). Estudos anlogos foram produzidos em Drosophilas usando um pulso de uma fator
de transcrio de ativao para transmitir memria celular para expresso do gene Hox durante a linha
germinativa de fmeas (Cavali e Paro, 1999). Em ambos os exemplos, a memria epigentica mediada por
alteraes na cromatina que comprometem diferentes modificaes de histonas e, provavelmente, tambm a
incorporao de histonas variantes.
Se modificaes de histonas funcionam em conjunto, uma marca pode ser deixada no padro de
cromatina que ir ajudar a marcar nucleossomos, especialmente se um sinal reestabelecido aps a replicao
do DNA (Fig. 20). Para heranas ainda mais estveis, colaboraes entre as histonas modificadas, a
incorporao de histonas variantes, e remodelamento de cromatinas vo converter uma regio estendida da
cromatina em alteraes estruturais persistentes que podem ento ser propagadas em muitas divises celulares.
Embora explicada para a herana transcricional de estados ON, uma sinergia similar entre mecanismos
repressores epigenticos vo prender de modo mais estvel as regies silenciadas da cromatina, que ainda
mais reforada por metilao adicional do DNA.
A dupla hlice de DNA pode ser vista ento como um polmero que se auto-organiza que, por meio de
sua ordenao em cromatina, pode responder ao controle epigentico e amplificar um primeiro sinal para uma
memria mais longeva/de longo prazo. Ademais, muitas modificaes de histonas provavelmente evoluram em
resposta a estmulos intrnsecos e externos. Em concordncia com isso, enzimas modificadoras de cromatina
requerem cofatores como ATP (cinases), Acetil-CoA (HATs), e SAM (HKMTs), cujos nveis so determinados por
mudanas no ambiente (e.g. dieta). Portanto, condies alteradas podem ser traduzidas em um polmero de
DNA-histona mais estvel ou mais dinmico. Um excelente exemplo HDAC NAD-dependente, Sir2, que age
como sensor para nutrientes e vida til/clulas envelhecidas (Guarente e Picard 2005; Rine 2005). Entender
como essas ocasies do ambiente so lanadas em assinaturas epigenticas biologicamente relevantes, e como
so lidas, traduzidas, e herdadas o corao da pesquisa epigentica atual. , entretanto, importante salientar
que o controle epigentico requer um intrincado equilbrio entre muitos fatores e que a interao funcional no
sempre fielmente reestabelecida depois de cada diviso celular. Esse o contraste funcional com a gentica, que
envolve alterao da sequncia de DNA, que sempre propagada estavelmente por meio de mitose e meiose, se
a mutao ocorre na linha germinativa.
Uma importante pergunta que surge da considerao acima como a informao contida na cromatina mantida
nas clulas de me para filha. Se uma clula perde sua identidade, devido a doena, desregulao, ou
reprogramao, essa perda de identidade acompanhada por mudanas na estrutura da cromatina? Sntese em
massa da maioria da maioria das histonas altamente regulada durante o ciclo. Transcrio da maioria dos
genes geralmente ocorre durante a fase S, o estgio em que o DNA replicado (replicao acoplada). Essa
coordenao`` assegura que enquanto a quantidade de DNA duplicada na clula, h histonas principais
suficientes a serem depositadas no novo DNA replicado, e assim, a embalagem do DNA ocorre simultaneamente
a replicao do DNA. Como apresentado acima, vrias regies de cromatina podem ter distintas diferenas em
modificaes de histona que programam a regio para ser transcrita ou no. Como os domnios da cromatina da
filha sintetizada mantm essa crucial informao para expresso gnica apropriada? Como o programa
fielmente modelo de uma gerao de clulas para a prxima, ou por meio de meiose e formao de clulas
germinativas (esperma e vulo)? Essas perguntas centrais esperam investigao futura.
Apesar de estudos iniciais indicarem o processo de semiconservao, em que um novo H3/H4 tetrmero
depositado, seguido pela incorporao de dois novos H2A/H2B dmeros, recente pesquisa tem questionado essa
hiptese. Nesse recente modelo, os novos`` H3 e H4 polipeptdios, que talvez j tenham levado vrias ps-
traduo modificaes, so incorporados como recm-sintetizados H3/H4 dmeros de histona juntos com os
antigos H3/H4 dmeros segregando entre DNA de me e de filha. Se esse for o caso, ento o modificado,
parental H3/H4 dmeros estariam agora tambm presentes com os novos dmeros sintetizados no mesmo DNA. A
co-presena deles talvez indique que modificaes apropriadas so colocadas nos recm adicionados dmeros.
Esse modelo atrativo e talvez ajude a explicar a herana das histonas modificadas, e assim, a propagao da
informao epigentica pela replicao do DNA e diviso celular. No entanto, mais evidncia necessria para
dar apoio validade deste ou de outro modelo intrigante que explique a transmisso das marcas de cromatina
pela diviso celular.

No fechamento deste captulo, ns perguntamos, O controle epigentico difere de uma forma fundamental dos
princpios bsicos de gentica? Apesar de ns talvez desejarmos ver a paisagem epigentica de Waddington
sendo demarcada mancha de ativao versus repressivas modificaes de histonas ao longo do polmero de
cromatina, essa noo poderia ser facilmente mal interpretada. Apenas em anos recentes que ns temos
aprendido sobre o principal sistema de enzimas pelo qual modificaes de histonas talvez sejam propagadas.
Isso tem moldado nosso atual pensamento sobre a estabilidade, e, portanto, de herana, de certas marcas de
histonas. Alm disso, ressaltado pelas descobertas recentes mostrando que mutaes em atividade de
cromatina modificada como remodeladoras de nucleossomas, DNMTs, HDACs ou HMKTs , como so
frequentemente achados em desenvolvimento anormal e neoplasia, esto citando exemplos do poder supremo
do controle gentico. Assim sendo, a incidncia de tumor nesses ratos mutantes geralmente considerada como
doena gentica. Em contraste, alteraes na estrutura do nucleossoma, metilao de DNA e perfis de
modificao de histonas- que no so causadas por um gene mutante-seria classificado como verdadeiras``
aberraes epigenticas.

Legenda: figura 20. Potencializao epigentica de um sinal primrio.

A gentica clssica prev que a expresso gnica dependente da disponibilidade e ligao apropriada do painel
de fatores de transcrio. A remoo desses fatores resulta em perda de expresso gnica, e assim constitui um
sinal de ativao transitrio. A estrutura da cromatina contribui para a expresso gnica, onde algumas
conformaes so repressivas e outras ativas. A ativao de um locus pode, portanto, ocorrer por meio de um
sinal primrio e resultar na alterao a jusante na estrutura da cromatina, envolvendo marcas de histonas
covalentes ativas e a substituio das principais histonas com variantes. Por meio da diviso celular, essa
estrutura de cromatina talvez seja reestabelecida apenas na presena de um sinal de ativao (denotado sinal
recorrente``). Memria epigentica resulta na manuteno do estado da cromatina durante a diviso celular, at
na ausncia de um sinal de ativao primrio. Tal sistema de memria no absoluto, mas envolve mltiplos
nveis de regulao epigentica para a remodelao da estrutura da cromatina. A natureza dinmica da
cromatina significa que apesar do estado da cromatina ser mitoticamente estvel, , no entanto, propenso a
mudar afetando a longevidade da memria epigentica.
Exemplos excelentes destes sistemas plsticos so: decises estocsticas no incio do desenvolvimento
embrionrio, reprogramao por transferncia nuclear, memria transcricional, imprinting genmico, mosaico por
inativao do cromossomo X, identidade centromrica e progresso tumoral. A gentica e a epigentica so
fenmenos intimamente relacionados e inerente a ambos a sua programao atravs da diviso celular, que,
por controle gentico, tambm compreende a linha germinativa caso ocorram mutaes na clula germinativa. No
caso de outras modificaes epigenticas, muitas vezes facilmente categorizadas, no sabemos se refletem
apenas uma resposta menor e transitria s mudanas no ambiente externo ou contribuem significativamente
para muitas diferenas fenotpicas que podem ser mantidas , mas no identificadas, divises somticas e
ocasionalmente afetam a linhagem germinativa. Mesmo com nosso melhor conhecimento sobre os mecanismos
epigenticos hoje, h pouco, ou nenhum, suporte novo para o Lamarkismo.

Grandes questionamentos da epigentica

Este livro discute os conceitos fundamentais e os princpios gerais que explicam como os fenmenos
epigenticos ocorrem, por mais intrigantes que paream. Nosso objetivo final expor o leitor compreenso
atual dos mecanismos que orientam e moldam esses conceitos baseando-se na rica biologia de onde eles
emergem. Em apenas alguns anos, a investigao epigentica levou a percepes emocionantes e notveis e a
descobertas inovadoras, mas muitas perguntam de longa data permanecem sem resposta (Ver Fig. 21). Embora
seja tentador desenhar concluses e propor regras gerais a partir desse progresso, advertimos contra essa
tendncia, suspeitando que haver muitas excees que quebram as regras. Por exemplo, esperado que
diferenas organizacionais importantes ocorram. Notavelmente, de organismos unicelulares a multicelulares, a
extenso e o tipo de modificaes de histonas, variantes de histonas, metilao de ADN e utilizao da
maquinaria RNAi variam.
Isso provavelmente ser valioso para o diagnstico de quais alteraes da cromatina so significativas durante a
diferenciao normal em comparao com estgios de doena e tumorignese. Por exemplo, o uso de
abordagens de mapeamento em larga escala com clulas normais, tumorais ou de clulas ES - "paisagismo
epigentico" ao longo de cromossomos inteiros (Brachen et al., 2006b Squiza et al 2006, Epigenomics AG,
ENCODE, GEN-AU, EPIGENOME NoE) - prev-se que o conhecimento gerado possa ser aproveitado para
novos enfoques de interveno teraputica e trabalhar para promover um consrcio mundial para mapear todo o
epigenoma humano (Jones e Martienssen, 2005).

... concebvel que as diferenas na abundncia relativa entre modificaes histnicas distintas, como a sub-
representao aparente da tri-metilao da lisina repressiva (que reprime) em (na) S. pombe ( uma levedura) e
A. thaliana (uma espcie de planta), possam refletir o maior potencial proliferativo e regenerativo nesses
organismos em comparao com a Programas de desenvolvimento mais restritos de metazorios( animais).
Alm disso, as ligaes funcionais entre a maquinaria RNAi (RNA de interferncia), a metilao da lisina das
histonas e a metilao do DNA continuaro a proporcionar surpresas emocionantes nos complexos mecanismos
necessrios para a determinao do destino celular durante o desenvolvimento.Do mesmo modo, uma maior
compreenso da dinmica e especificidade da maquinaria de reordenamento de nucleossomas contribuir para
este fim. Ns predizemos que sero descobertas mais atividades enzimticas "exticas", catalisando transies
epigenticas atravs de modificaes de substratos de histonas e no histonas.
Parece que as alteraes da cromatina, como induzido pelos mecanismos acima, agem em grande parte como
um filtro de resposta ao ambiente. Assim, espera-se que este conhecimento possa ser finalmente aplicado a
estratgias teraputicas melhoradas para redefinir algumas das respostas epigenticas de um indivduo que
contribuem para o envelhecimento, a doena e o cncer.

Isto inclui regenerao de tecidos, clonagem teraputica (utilizando clulas ES [clulas tronco] e seus derivados)
e estratgias de terapia com clulas estaminais adultas [clulas tronco adultas]. Acredita-se que tais estratgias
estendero a extenso da vida celular, modularo respostas de estresse a estmulos externos, invertero a
progresso da doena, e melhoraro tecnologias de reproduo assistida.

Acreditamos que a compreenso da "base da cromatina" da pluripotncia e da totipotncia estar no cerne da

compreenso da biologia das clulas-tronco e seu potencial para a interveno teraputica.

Muitas questes epigenticas fundamentais permanecem. Por exemplo, o que se distingue na cadeia da
cromatina do outro alelo quando ambos contm a mesma sequncia de DNA no mesmo ambiente nuclear? O
que define os mecanismos que conferem herana e propagao da informao epigentica? Qual a natureza
molecular da memria celular? Existem marcas epigenticas na linha germinal que servem para manter esse
genoma em estado totipotencial? Em caso afirmativo, como essas marcas so apagadas durante o
desenvolvimento? Alternativamente, ou adicionalmente, so novas impresses (marcas) adicionadas durante o
desenvolvimento que servem para "bloquear" estados diferenciados? Ns estamos ansiosos para a prxima
gerao de estudos (e estudantes) ousados o suficiente para enfrentar essas questes com o corao e a paixo
de geraes anteriores de pesquisadores genticos e epigenticos.
Em resumo, os princpios genticos descritos por Mendel provavelmente governam a grande maioria do nosso
desenvolvimento e os nossos fentipos externos. No entanto, as excees regra podem, s vezes, revelar
novos princpios e novos mecanismos apresentam uma herana que foi subestimada e, em alguns casos, mal
compreendidas anteriormente. Este livro espera expor a seus leitores as bases fenotpicas variveis
recentemente apreciadas - que estejam fora da alterao do DNA.

nossa esperana que os sistemas de fundao para as geraes futuras de estudantes e pesquisadores
fiquem intrigados com as curiosidades dos fenmenos epigenticos.

Descrio da Figura 21: A GRANDE QUESTO DA PESQUISA EPIGENTICA - Os muitos sistemas

experimentais usados na pesquisa epigentica revelaram numerosos caminhos e novos insights sobre os
mecanismos de controle epigentico. Muitas questes, como mostrado na figura, ainda permanecem e exigem
maior elucidao ou substanciamento em novos modelos, sistemas e mtodos somados aos existentes.