MANUAL DE PROCEDIMIENTOS EN INMUNOLOGIA APLICADA

Presentacin

Este manual pretende ser una herramienta til para el desarrollo acadmico y profesional de los
estudiantes que cursen la Unidad de Aprendizaje Inmunologa Aplicada, conozcan el manejo
correcto de los productos biolgicos y fomentar las buenas prcticas de laboratorio de inmunologa
as como capacitar a los alumnos para el manejo de los distintos materiales e instrumentos que
apoyan la construccin de conocimientos acerca de los rganos, clulas y molculas que integran el
sistema inmunolgico.

En cada prctica se describen los aspectos tericos que se han considerado ms importantes e
indispensables para la interpretacin de los resultados de cada prueba, las habilidades que los
estudiantes deben poner en prctica, los materiales que se usarn para desarrollar las tcnicas que
se proponen, los datos que deben tenerse presentes al interpretar los resultados, los valores
normales y las referencias bibliogrficas que fueron empleadas para elaborar cada uno de los
instructivos.

No debe sorprender al lector que los procedimientos tcnicos usados en este manual tengan un
propsito distinto al que se persigue al aplicarlos en el laboratorio clnico. Aqu, la finalidad central
es que el estudiante obtenga aprendizajes significativos sobre los componentes del sistema
inmunolgico, sobre su funcin y tambin sobre los mtodos que se usan rutinariamente para
detectarlos. Los propsitos pueden ser diversos.

Competencias

a) Competencias especficas del perfil profesional

Aplica mtodos y esquemas de anlisis empleados en el estudio de diversas muestras biolgicas,

e interpreta con claridad los resultados

Obtiene y procesa diversas muestras del organismo humano para determinar parmetros
bioqumicos, qumicos y biolgicos mediante mtodos de laboratorio pertinentes a fin de contribuir
a la evaluacin del estado de salud de las personas, respetando los cdigos de calidad y tica
aplicables

b) Competencia de la UAp

Comprende la funcin e interacciones de los mecanismos efectores inmunitarios tisulares, celulares

o moleculares y el fundamento de los mtodos de laboratorio empleados para medir parmetros
del sistema inmune en diversas muestras biolgicas, con el fin de valorar el estado de su
funcionamiento, siguiendo las normas de biotica, bioseguridad y de control de calidad aplicables
en un manejo responsable.

Medidas de seguridad
La sangre y sus derivados son de los biolgicos ms peligrosos a que puede estar expuesto el
personal que trabaja en un laboratorio clnico. Por tal razn, se proponen normas que deben
cumplirse cuando se est en el laboratorio o se est trabajando con muestras de sangre o reactivos
como los sueros control, que pueden ser el medio para la transmisin de infecciones por virus de la
hepatitis o virus de la inmunodeficiencia humana. El personal del laboratorio, en general, debe
evitar el contacto indebido con cualquier de los reactivos que se usan en las distintas
determinaciones que se hacen en inmunologa, evitando especialmente el contacto con la piel,
mucosas y heridas abiertas o lceras. As se evitaran riesgos para la salud.

A continuacin se propone una serie de normas mnimas de seguridad para preservar la salud de los
estudiantes y del personal del laboratorio, pero tambin para generar el hbito de trabajar
adecuada y profesionalmente.

Precauciones que deben tenerse en el laboratorio

1. Usar bata blanca, manga larga y abotonada.

2. No comer, beber, fumar, maquillarse, ni llevarse cosas a la cara.
3. No humedecer etiquetas con la lengua, morder los lpices ni llevarse objetos a la boca.
4. Usar guantes al manejar muestras biolgicas o al trabajar con reactivos para diagnstico.
5. Limpiar inmediatamente los reactivos y muestras de sangre que se derramen sobre la mesa de
trabajo o el piso, con una solucin de hipoclorito de sodio al 1% y, de preferencia, sumergir en la
misma solucin el material usado (algodn, franela).
6. Mantener una adecuada ventilacin del rea de trabajo, para evitar la inhalacin de compuestos
voltiles.
7. Usar siempre agujas y jeringas desechables y no hacer con ellas ms de una puncin.
8. Cubrir las agujas con su protector plstico despus de usadas y desecharlas en el recipiente rgido
indicado.
9. Evitar salpicaduras o formacin de aerosoles.
10. Esterilizar con calor hmedo (autoclave a 121.5 C) aquellos materiales que consideren
susceptibles de transmitir alguna infeccin. Usar hipoclorito de sodio al 1% (con los lquidos a
desechar) en lquidos que no contengan cidos. Deje trascurrir 30 minutos para que ocurra la
desinfeccin.
11. Poner el material empleado en la manipulacin de biolgicos en benzal, fenol o hipoclorito de
sodio al 5%.
12. Lvese meticulosamente las manos despus de cada prueba.
13. En caso de accidente (derrame de sangre o reactivos, contacto con ellos, etc.) avisar al profesor
o encargado del laboratorio.
14. Manejar todos los sueros (controles y muestras) como capaces de trasmitir hepatitis, infeccin
por VIH, etc.
15. Aplicar adecuadamente la NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Proteccin
ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos biolgico-infecciosos-Clasificacin y
especificaciones de manejo.
 Prctica 1. Inflamacin

Introduccin

Cuando los patgenos superan las barreras externas de la inmunidad innata como la piel y mucosas,
la infeccin o lesin tisular resultante puede inducir una compleja cascada de fenmenos conocida
como respuesta inflamatoria (Goldsby, et. al., 2014).

El primer suceso en la inflamacin aguda es la liberacin de factores quimiotcticos, actuando como

seales qumicas que activan molculas de adhesin (selectinas) en los capilares locales. Esto genera
un movimiento ms lento para los leucocitos circulantes por los capilares. La liberacin de
interleucinas (IL-8) acta atrayendo los polimorfonucleares (PMN) que transitan por el sitio y activa
las adhesiones entre integrinas de superficie generando uniones firmes con el endotelio seguido de
la extravasacin del PMN a los tejidos donde se lleva a cabo la inflamacin. La liberacin de
histamina (de los mastocitos), cido araquidnico y prostaglandina completa el proceso de
inflamacin y dolor. Ante la primera interaccin entre husped y patgeno, las seales qumicas
movilizan las clulas y mediadores del sistema inmunolgico al sitio inflamado, para llegar a una
resolucin del dao generado (Ryan & Ray, 2011).

La respuesta de fase aguda es inducida por seales que viajan por la sangre desde sitios de lesin o
infeccin. Las citosinas proinflamatorias e inflamatorios Factor de Necrosis Tumoral (TNF- ), IL-1 e
IL-6 son las principales seales que inducen la fase aguda; actan sobre los hepatocitos en el hgado
activando la secrecin de protenas de respuesta de fase aguda (protenas PRA). Algunas de las
protenas PARA son la protena C reactiva (PCR), se encuentra en bajas concentraciones en sangre
perifrica. El aumento de las concentraciones de PCR proporciona una funcin protectora en
infecciones, facilita la activacin del complemento, acta como una opsonina, dentro del hallazgo
clnico la concentracin circulante de PCR indica la magnitud del proceso de la inflamacin (Goldsby,
et. al., 2014).

Las respuestas inmunitarias e inflamatorias por lo general se limitan por s solas, de modo que una
vez que el agente patgeno y el tejido daado son eliminados, la inflamacin por lo general
disminuye y los tejidos sanan. La persistencia de agentes patgenos o de sustancias perjudiciales
pueden causar inflamacin crnica y dao tisular (Goldsby, et. al., 2014).

La inflamacin crnica agrupa las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. Si se presenta una
fase aguda, en general no se percibe y la infiltracin celular est compuesta de linfocitos y
macrfagos, con un nmero relativamente pequeo de PMN. En trminos generales se asocia con
patgenos de lento crecimiento, como las micobacterias, hongos y parsitos, para los que la
inmunidad mediada por clulas (Th1) es la defensa adaptativa principal. Muchos de estos patgenos
tienen mecanismos que les permiten endocitar macrfagos no activados y multiplicarse. Si las
clulas T activan efectivamente a los macrfagos, cesa la multiplicacin, y la inflamacin y lesin son
mnimas. En caso contrario, la multiplicacin y la inflamacin crnica continan, generando un
granuloma, siendo un indicativo de un componente de hipersensibilidad destructiva en la
inflamacin (Ryan & Ray, 2011).
Habilidades

Identifica la presencia de inflamacin mediante tcnicas de laboratorio

Sigue correctamente un protocolo para asegurar la confiabilidad del resultado
Interpreta correctamente los resultados de las pruebas de laboratorio para el diagnstico
de inflamacin.

Material y mtodos

A) Equipo

Microscopio ptico
Centrfuga
Agitador mecnico
Clitmetro de flujo hemtico

B) Material

Jeringa de 3 ml
Torniquete
Torundas con etanol
Tubos de 4 ml con anticoagulante (EDTA)
Portaobjetos
Cnulas
Tubos de wintrobe
Gradilla pata tubos de wintrobe
Cubreobjetos
Gasas
Tubos de ensaye de 13 X 100 mm
Gradilla para tubos de ensaye
Pipetas automticas de 1000 l
Pipetas Pasteur
Placas de fondo negro
Hisopos estriles

C) Soluciones, biolgicos y reactivos

Reactivo de ltex para protena C reactiva

100 ml de solucin de wright
250 ml de buffer de fosfatos de pH 6.4 para tincin de Wright
100 ml de solucin de cristal violeta para tincin de Gram
100 ml de lugol para tincin de Gram
100 ml de solucin de safranina para tincin Gram
 100 ml de alcohol-acetona para tincin de Gram
50 ml de solucin salina de NaCl al 0.85%.
50 ml de agua destilada
5 ml de sangre perifrica con EDTA
50 ml de orina de chorro medio de la primera orina de la maana
Muestra de exudado farngeo
Suero

Procedimientos

Toma de muestra

1. Tomar la muestra de exudado farngeo a partir de una persona que refiera molestias de garganta,
sin tratamiento con antibiticos o antiinflamatorios, sin aseo bucal en ayunas, haciendo uso de
hisopos estriles.

2. Descargar la muestra haciendo rotar el hisopo sobre un portaobjetos limpio. La rotacin debe ser
suave, sin friccionar vigorosamente, con el objeto de mantener lo ms intacta posible la estructura
celular.

3. Fijar inmediatamente los extendidos al calor y teir por la tcnica de Gram y/o wright

Tincin de Wright

1. Baar la preparacin con tincin de Wright e incubar durante 2 o 3 minutos

2. Aadir tampn de fosfato (pH 6.4) y agitar suavemente la mezcla y dejar en reposo durante 2 o 3
minutos.
3. Lavar con agua destilada
4. Secar al aire y observar el extendido al microscopio para hacer el conteo de clulas.
NOTA: Si la preparacin de Wright se observa sedimentada se filtra antes de su uso.

Tincin de Gram

1. Agregar cristal violeta en la zona donde se descarg la muestra con el hisopo y dejar durante 1
minuto.

2. Realizar lavado con agua comn sin que el chorro toque directamente la muestra para quitar
excedente del colorante.

3. Agregar lugol en la zona de la muestra y dejar durante 1 minuto.

4. Realizar nuevamente el lavado con agua comn para quitar excedente del colorante.

5. Agregar alcohol-cetona para decolorar la tincin durante 10 segundos y realizar el lavado con
agua comn inmediatamente.
6. Agregar safranina en la zona de la muestra durante 1 minuto y realizar el lavado con agua comn.

7. Dejar secar la muestra, posterior se agrega aceite de inmersin y observar por microscopia a 100
X.

Examen del sedimento urinario

1. Homogenice la muestra de orina y llene con ella un tubo de 13 x 100 mm. Centrifugue a 1500
rpm, durante 5 min.

2. Con una pipeta Pasteur tomar 1 ml del fondo del tubo homogenizar y colocar 500 l en un
portaobjetos, colocar el cubreobjetos para observar el sedimento.

2. Elimine el sobrenadante. Resuspenda el sedimento en la cantidad de orina que le haya quedado.

Con esta suspensin haga una preparacin entre porta y cubre objetos.

3. Observe al microscopio con objetivo de 40X en busca de filamento de mucina, cristales, cilindros,
leucocitos, eritrocitos, epiteliales y m.o. Saque el promedio de leucocitos observados en un total de
10 campos y reprtelos en No. / Campo.

Tcnica de la protena C reactiva

Prueba cualitativa

1. Todos los reactivos y especmenes deben estar a temperatura ambiente antes de su

uso.
2. Colocar una gota (50 l) del control positivo en el campo uno de la laminilla de fondo
negro. Colocar una gota (50 l) del control negativo en el campo dos.
3. Los campos restantes son usados para las muestras, colocando una gota.
4. Con suavidad resuspender el reactivo PCR, agregando una gota a cada campo.
5. Con un palillo extender cada una de las mezclas.
6. Rotar la lmina durante tres minutos e inmediatamente leer con luz baja.
7. Interpretacin: una reaccin negativa se indica por la suspensin uniforme sin muestras
de aglutinacin en la mezcla de reaccin.
Prueba cuantitativa
1. Todo reactivo y especmenes debe estar a temperatura ambiente antes de su uso.
2. Con el buffer salino de glicina diluido 1:20 realizar diluciones del suero: 1:2, 1:4, 1:8,
1:16, 1:32, segn se requiera.
3. Colocar una gota de control negativo, control positivo en cada dilucin en su lugar
respectivo dentro de la placa de reaccin.
4. Resuspender con suavidad el reactivo PCR y agregar una gota a cada campo.
5. Usar un aplicador para extender cada mezcla.
 6. Rotar la lmina por tres minutos y leer inmediatamente bajo luz directa.
7. Interpretacin: Una reaccin positiva se indica por la aglutinacin de la mezcla de
reaccin.
NOTA: Dependiendo la intensidad de la aglutinacin por mtodo cualitativo se valora la
dilucin mxima.
Tcnica de velocidad de sedimentacin globular
1. Extraer sangre venosa (1-2 ml) y homogenizar con anticoagulante.
2. Llenar con sangre el tubo de Wintrobe hasta donde se indique.
3. Asegurarse que el tubo quede en una posicin de 90 con respecto a la superficie.
4. Tener cuidado con vibraciones o cualquier otro factor que pueda modificar su desarrollo.
5. Dejar transcurrir una hora.
6. Leer la sedimentacin eritrocitaria, se expresa en mm/hrs.

Observaciones

Resultados

a) Interpretacin

Valoracin de los extendidos: Para que los extendidos se consideren representativos, deber
considerarse el nmero de clulas epiteliales, leucocitos y microrganismos presentes.
Criterios: Se considerar que el paciente cursa con un proceso inflamatorio cuando en la
preparacin se encuentre un promedio de 8 a 10 leucocitos por campo de gran aumento, en
por lo menos 10 campos ledos, en este caso la respuesta inflamatoria exudativa (RIE) se
considerar escasa, a partir de esta referencia el analista reportar en trminos relativos:
escaso, moderado abundante.
En el sedimento urinario un nmero de 0-8 leucocitos por campo es considerado como normal
(OMS, 1983).

b) Reporte

El informe de laboratorio deber contener una descripcin detallada de todos los elementos y
microorganismos encontrados e indicar su cantidad (pueden emplearse los trminos de cantidad:
escaso, moderado y abundante). La papeleta de resultados incluir:

Resultados de Laboratorio

Nombre: ____________________________ Edad: ______ Sexo: ____ No. REG: ______________

Examen de laboratorio practicado: ____________________________________________________

Resultados

Clulas: especificar el tipo y nmero de clulas observadas

Microorganismos: Anotar el mayor nmero de caractersticas posibles de los m.o. que logre
detectar en la muestra. (Agrupacin, morfologa y tipo de Gram)

Intensidad de la reaccin inflamatoria No. y tipo de leucocitos por campo, dependiendo de la

muestra analizada.

Valores de referencia por cada tipo de prueba.

____________________________________________

Practic

Lugar y fecha _______________________________________

Anlisis de los resultados

Revise con sus compaeros los resultados obtenidos y analice los posibles errores del
procedimiento.

a) Errores pre-analticos

b) Errores analticos

c) Errores post-analticos

Se pueden mejorar los resultados? Qu sugiere para ello? Tuvo dificultades para identificar las
clulas que se encuentran presentes en la inflamacin? Podra hacerlo con mayor facilidad en
ocasiones futuras en caso de ser no que informacin cree pertinente para mejorar? Contaba usted
con la informacin necesaria para identificar clulas que participan en la inflamacin?

Interpretacin de resultados

Conclusiones

Referencias

1. Goldsby RA., Kindt TJ., Osborne BA., Kuby J. (2014). Inmunologa de Kuby. 7 Edicin. Espaa:
Editorial Mc Graw Hill. pp. 166-173.

2. Ryan KJ., Ray CG. (2011). Microbiologa Mdica. 5 Edicin. EUA: Editorial Mc Graw Hill. pp. 21-
22.
Cuestionario

1. Qu es un exudado?

2. Cules son las clulas caractersticas de una inflamacin aguda?

3. Cules son las protenas de fase aguda de la inflamacin?

4. Cul o cules de ellas tienen utilidad en el diagnstico por el laboratorio?

5. Enlista las citocinas proinflamatorias.

6. Cules son las causas de la inflamacin crnica?

7. Cules son las clulas caractersticas de inflamacin crnica?

8. Menciona los efectos sistmicos de la Inflamacin

Prctica 8. Deteccin de antgenos bacterianos: Reacciones febriles

Introduccin

Durante el curso de una enfermedad infecciosa la respuesta inmune adaptativa es de vital

importancia para el cuerpo humano en la formacin de anticuerpos, que ayudan a combatir al
agente infecciosos eficientemente contra organismos extracelulares, adems de ser utilizados como
biomarcadores contra microrganismos especficos para diagnosticar enfermedades. El aumento de
los ttulos de anticuerpos contra determinado microorganismo en suero de un paciente, indica que
est infectado, estuvo infectado recientemente, o fue vacunado. El ttulo o cantidad de anticuerpos
se forma o aumenta lentamente a partir del sptimo da de evolucin de la enfermedad, alcanza su
mximo al vigsimo da y decae ms tarde. Como regla general, las pruebas de aglutinacin tienen
mayor valor diagnstico si se practican en forma seriada, para observar si el ttulo de la aglutinacin
aumenta progresivamente (Fernndez & Romn, 1998).
Las pruebas de reacciones febriles se mezcla el suero de un paciente con sospecha de enfermedad
febril con los reactivos que contienen bacterias muertas (antgeno) de la misma especie que las
causantes de la infeccin y, al reaccionar los antgenos con los anticuerpos correspondientes del
paciente, se producen complejos antgenos-anticuerpos formando aglutinacin. Las reacciones
febriles, constituyen una serie de pruebas serolgicas, para demostrar la presencia de anticuerpos
aglutinantes contra bacterias productoras de tifoidea, paratifoidea, brucelosis y tifus exantemtico
(Fernndez & Romn, 1998).

Las reacciones febriles son pruebas de aglutinacin que buscan apoyar o descartar el diagnstico de
infecciones causadas por Salmonella typhi, Salmonella paratyphi y Brucella abortus, agentes
etiolgicos de infecciones comnmente conocidas como Fiebre Tifoidea o Fiebre Ondulante,
Paratifoidea y, Fiebre de Malta o Brucelosis respectivamente. Para esto se utilizan antgenos, que
consisten de suspensiones bacterianas de cepas patgenas especficas que han sido muertas por
procesos especiales que dejan ntegros los antgenos contra que reaccionan los anticuerpos
producidos por el sujeto infectado (Zavala, et. al., 1994). Estos antgenos febriles son:

Antgeno O Salmonella typhi

Antgeno H Salmonella typhi

Antgeno Paratfico A

Antgeno Paratfico B

Antgeno Brucella abortus

Antgeno Proteus OX-19

La aglutinacin de clulas bacterianas con antisueros es una de las pruebas serolgicas ms antiguas
de la inmunologa prctica. Se inici como un mtodo para el diagnstico de las infecciones
bacterianas y fue propuesta por Widal en 1896, tabla 1. En las pruebas de aglutinacin bacteriana
las clulas bacterianas desconocidas pueden identificarse por medio de anticuerpos conocidos o
bien, utilizando bacterias conocidas, pueden identificarse los anticuerpos en el suero del paciente
(Pasos, 2002).

Tabla 1. Origen de los antgenos usados en las reacciones febriles, enfermedad ocasionada por las
bacterias y nombre de las pruebas de aglutinacin.
Habilidades

Determina los ttulos de anticuerpos producidos en contra de antgenos bacterianos a travs de

pruebas de aglutinacin en placa.

Material y mtodos

A) Equipo

Centrfuga

Microscopio ptico compuesto

Agitador de placas

B) Material

Aplicadores de madera limpios (palillos)

1 placa de aglutinacin con 6 lugares (crculos)

1 micropipeta de 5 a 20 l

1 micropipeta de 10 a 100 l

4 tubos de ensaye de 13 x 100

1 Jeringa desechable estril de 3 ml

 Puntas para micropipetas

Algodn (torundas en alcohol)

C) Soluciones, biolgicos y reactivos

Alcohol etlico al 70%

Solucin salina fisiolgica (SSF)

Suero lo ms reciente, claro y limpio posible

Antgenos Febriles:

Antgeno O Salmonella typhi

Antgeno H Salmonella typhi

Antgeno Paratfico A

Antgeno Paratfico B

Antgeno Brucella abortus

Antgeno Proteus OX-19

Procedimientos

Aglutinacin en placa

1) Los antgenos deben estar a temperatura ambiente, adems deben homogeneizarse antes de
realizar la prueba.

2) Marcar la placa de aglutinacin anotando el nombre del antgeno que se pondr en cada uno de
los 6 crculos. Antes de usarla debe estar perfectamente limpia.

3) Mida 40 ul de suero (dilucin 1:40) y deposite este volumen en cada uno de los seis crculos.

4) Depositar una gota del antgeno correspondiente a cada volumen de suero colocado y mezclar
con un aplicador limpio.

5) Agitar la placa suavemente ya sea manualmente o con rotador mecnico a 120 rpm, durante 3
minutos, evitando que se mezcle el contenido de los crculos.

6) Haga la primera lectura al microscopio en objetivo de 10X. Decida por el tamao y la cantidad
de grumos con cul de los antgenos hubo aglutinacin.

7) Los antgenos que no den aglutinacin sern inmediatamente reportados como negativos.

8) Para los antgenos que hayan dado aglutinacin, realizar la dilucin 1:80 (20 ul de suero, ms
una gota del antgeno correspondiente).
9) Repetir los pasos 5 y 6.

10) Si cualquiera de los antgenos sigue dando aglutinacin, contine con las diluciones 1:160,
1:320 colocando 10 y 5 l de suero respectivamente, decida cul es la ltima dilucin en la cual su
muestra dio positiva.

Lectura de los resultados.

a) La lectura de los resultados se debe hacer al microscopio observando la aglutinacin y

valorndola en la forma siguiente:

Grado de aglutinacin Valoracin

100% 4+
75% 3+
50% 2+
25% 1+
0% 0

Las muestras que continuarn diluyndose sern slo aqullas que tengan una aglutinacin
aproximada del 50 % o ms para alguno de los antgenos usados en la prueba.

Observaciones

Resultados

Reporte de los resultados

El ttulo del suero se informa como la recproca de la dilucin ms alta en la que todava se
observa aglutinacin o simplemente como el valor de sta. Por ejemplo

Laboratorio de inmunologa

Resultado de pruebas inmunolgicas

NOMBRE______________________EDAD_____________SEXO________REG______

Examen de laboratorio practicado: Reacciones Febriles

Antgenos Tifico O Positivo Dilucin 1:160 (p.ej.)

Tifico H Positivo Dilucin 1:160

Paratifico A Negativo

Paratifico B Negativo

Brucella abortus: Negativo

Proteus OX-19: Negativo

Lugar y fecha____________________________________________

______________________________________________

Nombre y firma del responsable

Nota: Observe que cuando las muestras no presentan aglutinacin con alguno de los antgenos no
se anota el ttulo.

Anlisis de resultados

Revise con sus compaeros los resultados obtenidos y analice los posibles errores del
procedimiento.

a) Errores pre-analticos

b) Errores analticos

c) Errores post-analticos

Se pueden mejorar los resultados? Cules pueden ser las fuentes de error en este
procedimiento? Qu factores pueden afectar una reaccin de aglutinacin?Tuvo dificultades
para identificar la aglutinacin del suero analizado? Podra hacerlo con mayor facilidad en
ocasiones futuras? Contaba usted con la informacin necesaria para el desarrollo de la prctica y
la interpretacin adecuada de los resultados?

Interpretacin de resultados

Conclusiones

Referencias

Fernndez Tilapa G., Romn Romn A. (1998). Manual de laboratorio en Inmunologa Clnica. 1
edicin. Mxico: Lama editores. pp.63-67.

Zavala Trujillo Y, Nava Zavala A, Guerra Cceres J, Quiroz Miranda C. Brucelosis. (1994).
Infectious Disease Clinics of North America, 8 (1), 225-241.

Pasos Salazar NG. (2002). Manual de Laboratorio de Inmunologa. Benemrita Universidad

Autnoma De Puebla, Facultad De Ciencias Qumicas. pp. 17-18.

Cuestionario

1. De qu estn compuestos los grumos que observ al microscopio?

2. Qu contenan los frascos de reactivos?

3. Qu tipo de aglutinacin se da en esta prueba?

4. Esquematiza la reaccin antgeno anticuerpo.

5. Qu es el efecto prozona? y Cmo puede afectar los resultados?

6. Por qu se dice que las reacciones febriles son poco especficas?

7. Cmo podemos determinar si la infeccin est activa o estamos detectando anticuerpos de

memoria?

Prctica 8. Diagnstico serolgico de Hepatitis Viral B

La hepatitis es un trmino clnicopatolgico muy inespecfico que abarca las lesiones en el hgado,
la etiologa ms frecuente son las causadas por infecciones virales que abarca una gran variedad de
grupos conocidos por virus de la hepatitis A, B, C, D y E que tienen como tropismos el hgado
(Snchez y Nogales, 2009).

El Virus de la Hepatitis B (VHB) es un virus de DNA de 40-42 nm perteneciente a la familia

Hepadenaviridae, posee un core central icosahdrico de 27 nm una de las formas ms comunes de
transmisin es por va sangunea, va sexual, perinatal y por el canal de parto. El periodo de
incubacin del virus es altamente variable pero se estima que es de 75 hasta 180 das. La historia
natural de la infeccin por VHB es altamente variada se puede presentar una etapa aguda donde
puede o no presentar sintomatologa, dentro de los sntomas agudos se encuentran cuadros
ictricos de ojos y piel, fatiga extrema, nauseas, vomito, dolor en el hipocondrio superior derecho.
Por otra parte la infeccin crnica no presenta signos ni sntomas, es una enfermedad
necroinflamatoria generando un dao irreversible como la cirrosis o hepatocarcinoma (Mc Mahon,
2009).

La progresin de la enfermedad vara segn la presencia de diversos factores como son, genotipo
viral, subgenotipo, mutaciones especificas del virus, predisposicin gentica del paciente etc. Como
estrategia de prevencin en 1991 la Organizacin Mundial de la Salud recomend la incorporacin
de la vacuna VHB en Mxico, y el 1999 se incorpor en el plan de inmunizacin en nios. Sin embargo
esto no es suficiente para evitar el riesgo de infeccin que se presente en ocasiones futuras (Barrera,
Cabrera, et al., 2009)

Para realizar el diagnostico de hepatitis viral tipo B no basta con la presencia de signos y sntomas
ya que no puede identificar el tipo viral causante. Primero se realiza la identificacin de la
inflamacin heptica en base a los signos y sntomas, posterior se realiza pruebas de laboratorio
para identificar las principales alteraciones bioqumicas. Para el diagnostico serolgico de VHB se
utilizan diferentes marcadores virales (Snchez y Nogales, 2009).

HBs Ag: Protena codificada por el DNA viral, localizada en la superficie de la envoltura del virus.

HBc Ag: Protena de la cpside icosahdrica.

HBe Ag: Protena que ancla el DNA viral a la cpside. Su presencia es indicativo de replicacin viral.

HBV DNA: Material gentico especifico del virus. Su deteccin es mediante qRT PCR.

Anti-HBs: Anticuerpos con especificidad en contra de la envoltura de VHB

Anti-HBc: Anticuerpo con especificidad en contra de la cpside del VHB.

El perfil de marcadores serolgicos en la infeccin aguda se utiliza para dar seguimiento al progreso
de la infeccin. A las 6 semanas de la infeccin se detecta HBsAg y los marcadores de replicacin
viral como son HBeAg y VHB DNA. El diagnstico de la infeccin aguda se establece con la deteccin
de IgM Anti-HBc, en algunos casos se encuentra HBs Ag pero desaparece de la sangre cuando inician
los sntomas. Durante el periodo de ventana suele disminuir la cantidad de HBs Ag y aumenta los
ttulos de Anti-HBs (Snchez y Nogales, 2009).

La Gua de Prctica Clnica de la Secretaria de Salud en Mxico ha determinado diversos estadios en

base a los marcadores serolgicos de la infeccin y el perfil bioqumico heptico.

Fase de portador inactiva: Ausencia de HBe Ag, bajos niveles de VHB DNA (< 14 copias/ml), niveles
normales de ALT.

Fase crnica: Presencia o ausencia de HBe Ag, niveles persistentes o intermitentes de DNA de VHB
(> 104 copias/ml) y de ALT, histolgicamente se observa actividad necroinflamatoria.

Fase de Ventana: Disminucin de HBs Ag y aumento de IgM Anti- Hbs.

Para realizar el diagnostico existen distintas mtodos para la deteccin de los marcadores virales,
ya sea por inmunoensayos cromatogrfico de flujo lateral que contienen anticuerpos Anti-HBs Ag y
reactivo de Oro coloidal activados con anticuerpos Anti-HB, deteccin de anticuerpos especficos de
VHB por el mtodo de ELISA ya sea de clase IgG o IgM e incluso ambos por ELISA recombinante. El
diagnostico de VHB es importante debido que se puede prevenir la infeccin crnica y las futuras
lesiones hepticas (Barrera, Cabrera, et al., 2009).

Habilidades
Prctica 8. Diagnstico serolgico de Hepatitis Viral C

El virus de la hepatitis C (VHC) es un virus de RNA de cadena sencilla, pertenece a la familia

Flavoviridae, del genero Hepacavirus, posee un core icosahdrica y es un virus envuelto. La infeccin
viral de la hepatitis viral tipo C se considera un problema de salud importante debido a que sus
principales consecuencias es la inflamacin necrosante causando cirrosis y carcinoma hepatocelular
teniendo altas tasas de mortalidad. La Organizacin Mundial de la Salud ha estimado que VHC es
responsable del 27% de los casos de cirrosis y del adenocarcinoma heptico (CDC, 2013)

Una de las principales vas de transmisin es por va sangunea, siendo las transfusionales una de las
principales causas de infeccin, el compartir agujas de drogas intravenosas y por va sexual son las
ms comunes. La infeccin VHC es causante de enfermedad aguda y crnica. El periodo posterior al
adquirir la infeccin se denomina fase aguda, comnmente no genera sntomas, en algunos casos
se presentan cuadros de astenia, ictericia en ojos y piel, orina oscura o simplemente ligeros dolores
en hipocondrios superior derecho. Se han presentado en el 10 y 30% de los pacientes que son
infectados con VHC en fase aguda muestran una recuperacin completa o algunas veces no se
percatan que fueron infectados debido a una fuerte respuesta inmune eficiente, pero el 70 al 90%
de los pacientes infectados desarrollan infeccin crnica que generalmente no se percatan que se
padece. La infeccin crnica genera un dao heptico prolongado a esta se le considera como una
enfermedad silenciosa debido a que los sntomas se presentan de 20 a 30 aos de la infeccin. El
riesgo aumenta mientras el paciente no reciba tratamiento (Ministerio de Salud, 2010)

Para realizar el diagnostico de VHC es necesario realizar diversas pruebas principalmente se basa en
la sospecha clnica en base a los signos y sntomas, posterior se analiza las posibles alteraciones
bioqumicas en el funcionamiento hemtico determinando la cantidad de enzimas hepticas,
bilirrubinas, protenas etc. Para el diagnostico se utilizan diversos marcadores virales, siendo los
antgenos virales o los anticuerpos en contra de los antgenos (Ministerio de Salud, 2010).

Principalmente se realiza una prueba serolgica de tamizaje siendo la deteccin de IgG Anti-VHC ya
sea mediante tcnica de ELISA, cuando es confirmada la presencia de anticuerpos es necesario
realizar una prueba ms especfica debido a que puede indicar una infeccin resuelta ya que los
ttulos de anticuerpos van disminuyendo en un rango de 18 a 20 aos. Algunos laboratorios detectan
Ac. IgM Anti-VHC que consta de antgenos del core como son NS3 y NS4 estos antgenos son
detectables incluso en infecciones crnicas. Para determinar la positividad de VHC se realiza prueba
de qRT PCR para determinar la carga y replicacin viral. En algunos casos se determina el genotipo
y subtipo viral, su importancia recae en la aplicacin de un tratamiento debido a la prediccin del
comportamiento viral (OMS, 2014)
Prctica 8. Diagnstico serolgico de Helicobacter pylori

La infeccin por Helicobacter pylori (H. pylori) se ve relacionado con el desarrollo de diversas
patologas gstricas, siendo el desarrollo de gastritis crnica, ulcera gstrica y adenocarcinoma
gstrico. H. pylori es un bacilo Gram negativo, ligeramente curvo, sus principales caractersticas
bioqumicas son catalasa, oxidasa y ureasa positivas. En 1994 la OMS lo clasifico como un
carcingeno de tipo 1 para humanos (WHO/IARC 1994).

Datos epidemiolgicos revelan una prevalencia del 70 al 80% en condiciones precarias. En Mxico
se estima una seroprevalencia del 67%, detectando anticuerpos Anti-H. pylori. A su vez en el estado
de Guerrero se presento una prevalencia del 54% al 85.7%. La diversidad gentica que presenta H.
pylori se ve relacionado con la virulencia de este microrganismo y por consecuencia en la
patogenicidad y el desarrollo de enfermedades gstricas. (Alvarado et al. 2014; Martnez et al. 2010)

Los principales factores de virulencia de este microrganismo son la citotoxina vacuolizante (VacA)
encontrando variantes allicas relacionado con la expresin de dicha protena adems de la
capacidad que tiene generar grandes vacuolas en la clula hospedera. Otro importante factor de
virulencia es la citotoxina asociada al gen A (CagA), est relacionado a un alto potencial oncognico
debido a que la internalizacin de esta protena puede o no fosforilarse e inducir la progresin y
replicacin celular. Por ultimo tenemos a la presencia de la adhesina BabA2 el cual se relaciona con
la adhesin de la bacteria con las clulas epiteliales garantizando la infeccin en el epitelio gstrico
(Palframan et al. 2012; Smolka & Backert 2012).

Para el diagnostico de este microrganismo existen diversas formas la ms comn es parte de la

serologa detectando anticuerpos de clase IgG Anti-H. pylori por mtodo de ELISA, otra es mediante
la deteccin de antgenos de H. pylori en heces fecales por mtodo de inmunoensayos
cromatgraficos, otra forma es el aislamiento microbiolgico a partir de biopsias gstricas, pero la
tcnica estndar de oro es observando de manera directa el bacilo en tcnicas histopatolgicas a
partir de biopsias gstricas.

La importancia del diagnstico de este bacilo radica en el tratamiento prematuro debido a que la
infeccin crnica por este bacilo es causante principal de gastritis crnica debido a que este a largo
plazo puede desarrollar una transformacin celular maligna en el epitelio gstrico. Debido a que la
infeccin generalmente es asintomtica hasta que se causa un dao irreversible (Roesler 2014).
Prctica 8. Determinacin del Factor Reumatoide

La Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria crnica autoinmune, que afecta
principalmente las membranas sinoviales de mltiples articulaciones. La susceptibilidad para
padecer AR se debe que es de etiologa gentica. La principal caracterstica de esta es la
inflamacin de la membrana sinovial generando destruccin del cartlago y erosiones seas y
deformacin articulares. Esta enfermedad suele presentar manifestaciones articulares y extra
articulares, est ampliamente distribuido a nivel mundial y se estima que ocupa el 1% de la
poblacin mundial adems de que se presenta con mayor prevalencia en mujeres y en menor
grado a hombres.

Las principales manifestaciones clnicas son dolores crnicos de baja o intermedia intensidad, siendo
estos de manera persistentes el dolor se asocia a otros sntomas como son rigidez, inflamacin,
perdida de movilidad y funcionalidad. Para el diagnstico previo de este padecimiento no
simplemente est basado en pruebas de laboratorio, ni signos o sntomas, para ello se han
establecido diversos criterios para el diagnstico de AR propuestos por el American College
Rheumatology.

1. Rigidez matutina
2. Dolor al moverse, sensibilidad dolorosa por lo menos en una articulacin.
3. Hinchazn en una articulacin.
4. Afeccin simultnea en la misma articulacin de ambas partes del cuerpo.
5. Ndulos extra articular.
6. Positividad a la prueba de aglutinacin de FR.

El factor reumatoide (FR) es un anticuerpo que reacciona en la regin FC de la inmunoglobulina

propia del organismo. El FR se detecta en pacientes con AR adems de que es importante para el
diagnstico y pronstico de la enfermedad. Esta es una prueba que se utiliza para los criterios de
diagnstico de la AR, adems de que se puede utilizar para el monitoreo de la progresin de la
enfermedad.
Determinacin de la Protena C Reactiva

La protena C reactiva (CRP) ha sido usada por mucho tiempo como un marcador de inflamacin
inespecfico. La CRP es una protena con estructura pentmerica compuesta por 5 subunidades
idnticas con un peso molecular de 120 kDa. sintetizada en el hgado con una vida media de 19 hrs.
Adems puede sintetizarse con algunas citocinas como son Interleucina 1, IL-6 y el Factor de
Necrosis Tumoral (TNF ). Generalmente es uno de los marcadores ms empleados como
reactantes de fase aguda, esta protena la encontramos en bajas concentraciones en sangre
perifrica en condiciones normales, su nombre de la CRP proviene de la capacidad de reaccionar
con el polisacrido C de S. pneumoniae.

Recientemente se ha determinado que la CRP tiene funciones en la adhesin de neutrfilos,

activacin endotelial, produccin de citocinas y de xido ntrico. Adems se ha determinado que
cuando la CRP se liga a una molcula de baja densidad como la fosfatidil colina modifica la
membrana celular y genera complejos con C1q para la activacin del sistema del complemento.

Las concentraciones sricas se utilizan como biomarcadores para el monitoreo de la enfermedades

crnico inflamatorias, infecciosas entre otras. Los hallazgos clnicos muestran que la CRP es
importante en la fisiopatologa de los procesos inflamaciones, as como en la respuesta inmune
innata. La CRP se ve aumentada en las primeras 4-6 hrs y en 8 hrs su valor aumenta el doble ante
un proceso inflamatorio y a las 36 y 5 hrs alcanza su pico mximo, esto lo hace un marcador evolutivo
eficaz.

Para la determinacin de la CRP generalmente es utilizado los mtodos cualitativos y cuantitativos

que incluyen los reactivos de ltex. En el mtodo cualitativo se basa en la aglutinacin positiva o
negativa. En el mtodo cuantitativo se basa en la realizacin de diluciones cuando la aglutinacin
en el mtodo cualitativo es muy marcado. El reactivo de ltex est compuesto por anticuerpos
especficos contra CRP los cuales estn adheridos con partculas que dan la caracterstica grumosa
cuando se forman los complejos antgenos-anticuerpos.