La microscopa electrnica de criofractura y la de grabado por congelacin proporcionan una

nueva visin del interior celular

Otros dos mtodos que utilizan rplicas metlicas han sido particularmente tiles en la biologa celular.
Uno de ellos, el de la microscopa electrnica de criofractura, constituye un sistema de visualizar el
interior de las membranas celulares. Las clulas se congelan a la temperatura del nitrgeno lquido (-
196 C) en presencia de un crioprotector (un anticongelante) para impedir la distorsin provocada por la
formacin de cristales de hielo, y el bloque se fracciona con la hoja de una cuchilla. A menudo, el plano
de fractura pasa a travs del centro hidrofbico de las bicapas lipdicas, exponiendo as el interior de las
membranas celulares. Las caras de fractura resultantes se metalizan con platino, y las rplicas se
observan al microscopio electrnico (como en la figura 4-25).

Figura 4-25 Preparacin de una rplica metalizada de la superficie de una

muestra. Obsrvese que el grosor del metal refleja los contornos de la superficie
de la muestra original.
Estas rplicas estn llenas de pequeas protuberancias, llamadas partculas intramembrana, que
corresponden a grandes protenas de la membrana. Esta tcnica proporciona una va adecuada y
espectacular para visualizar la distribucin de este tipo de protenas en el plano de la membrana (Figura
4-26).

Figura 4-26 Electronmicrografa de una criofractura de la membrana

del tilacoide de un cloroplasto de una clula vegetal. Las membranas
del tilacoide, que llevan a cabo la fotosntesis, se encuentran apiladas. El
plano de fractura se ha desplazado de capa a capa, pasando a travs de
cada bicapa lipdica y exponiendo las protenas transmembrana que
tienen un tamao en el interior de la bicapa suficiente para hacer sombra
y aparecer como partculas intramembrana en esta rplica de platino. Las
partculas mayores que se aprecian en la membrana son el fotosistema II
completo un complejo de mltiples protenas (Por cortesa de L.A.
Staehelin).

Otro mtodo importante de rplica es la microscopa de

grabado por congelacin (freeze-etch), que puede ser utilizado para examinar tanto el interior como el
exterior de las clulas. En esta tcnica las clulas tambin se congelan muy rpidamente utilizando
por ejemplo un dispositivo especial para colocar la muestra contra un bloque de cobre congelado por
ejemplo con helio lquido y el bloque congelado se fragmenta con la hoja de una cuchilla, como
acabamos de describir. Pero en este caso el nivel de hielo disminuye alrededor e las clulas (y n menor
medida dentro de las clulas) mediante la sublimacin del agua en el vaci a medida que aumenta la
temperatura (un proceso denominado deshidratacin por congelacin) (Figura 4-27).
Figura 4-27 La microscopa electrnica por criofractura. La muestra es rpidamente congelada y
el bloque de hielo es fracturado con una cuchilla (A). Entonces, el nivel de hielo se reduce por
sublimacin del agua en el vaco, de forma que las estructuras de la clula que se encuentran cerca
del plano de fractura quedan al descubierto (B). A continuacin, se prepara una rplica de la
superficie todava congelada (tal como se describe en la Figura 4-25) y se examina al microscopio
electrnico de transmisin.
Las zonas de la clula expuestas a ese proceso de grabado son sombreadas como antes, para
conseguir una rplica de platino. Esta tcnica expone estructuras del interior de la clula y puede revelar
su organizacin tridimensional con una claridad excepcional (Figura 4-28).

Figura 4-28 Ordenacin regular de los

filamentos proteicos de un msculo
de insecto. Para obtener esta imagen,
las clulas musculares fueron
rpidamente congeladas en helio lquido,
fracturadas a travs del citoplasma y
sometidas a grabado profundo. Lugo se
prepar una rplica metalizada que se
examin a gran aumento. (Por cortesa
de Roger Cooke y John Heuser)

Puesto que lo que se observa al microscopio son las rplicas metlicas sombreadas y no las propias
muestras, ambos mtodos, la criofractura y el sombreado por congelacin, pueden utilizarse para
estudiar clulas congeladas sin fijar, evitndose pues el riesgo de obtener artefactos producidos por el
proceso de fijacin.

Alberts, B. et al., Biologa Molecular de LA CLULA, Ed. Omega, S.A. Barcelona, 1996