102

Lampiran 1
Jadwal Kegiatan
 103

Lampiran 2
Konversi Perhitungan Dosis untuk Beberapa Jenis Hewan dan Manusia

Mencit Tikus Marmot Kelinci Kucing Kera Anjing Manusia

20 g 200 g 400 g 1,5 kg 2 kg 4 kg 12 kg 70 kg
Mencit 1,0 7,0 2,25 27,8 29,7 64,1 124,2 387,9
20 g
Tikus 0,14 1,0 1,74 3,9 4,2 9,2 17,8 56,0
200 g
Marmot 0,08 0,57 1,0 2,25 2,4 5,2 10,2 31,5
400 g
Kelinci 0,04 0,25 0,44 1,0 1,08 2,4 4,5 14,2
1,5 kg
Kucing 0,03 0,23 0,41 0,92 1,0 2,2 4,1 13,0
2 kg
Kera 4 0,016 0,11 0,19 0,42 0,45 1,0 1,9 6,1
kg
Anjing 0,008 0,06 0,10 0,22 0,24 0,52 1,0 3,1
12 kg
Manusia 0,0026 0,018 0,031 0,07 0,076 0,16 0,32 1,0
70 kg

Sumber: Kusumawati (2016)

 104

Lampiran 3
Rincian Biaya Penelitian

No. Rincian Kegiatan Jumlah Total

1. Pembelian mencit 36 ekor Rp 360.000
2. Sewa tempat laboratorium Rp 1.000.000
3. Biaya Perawatan 36 hari Rp 3.000.000
4. Pembelian siklosporin A 30 ekor Rp 5.480.000
5. Kit TNF- Rp 6.800.000
6. Antibodi MMP-9 Rp 2.500.000
7. Pemeriksaan 25 ekor x Rp 150.000 Rp 3.750.000
immunohistokimia
8. Pemeriksaan histopatologi 25 ekor x Rp 80.000 Rp 2.000.000
9. Pembelian buah naga merah 40 kg x Rp 20.000 Rp 800.000
10. Determinasi tanaman Rp 35.000
11. Ekstraksi kulit buah merah Rp 900.000
12. Penggandaan dan penjilidan Rp 450.000
tesis
TOTAL Rp 27.075.000
 105

Lampiran 4
Pembuatan Sediaan Ekstrak Etanol Kulit Buah Naga Merah
(Hylecereus polyrhizus)

Ekstrak etanol kulit buah naga merah tidak larut dalam air, sehingga harus

disuspensikan dengan larutan Na-CMC 0,5%. Pembuatan sediaan ekstrak etanol

kulit buah naga merah dilakukan dengan perhitungan sebagai berikut:

1. Dosis 1 = 0,25 mg/gram BB

= 6,25 mg/25 gram BB

Ditentukan : 0,2 ml/25 gram BB

Sediaan yang dibuat :

= 6,25 mg dalam 0,2 ml larutan Na-CMC 0,5%

= 625 mg dalam 20 ml Na-CMC 0,5%

2. Dosis 2 = 0,5 mg/gram BB

= 12,5 mg/25 gram BB

Ditentukan : 0,2 ml/25 gram BB

Sediaan yang dibuat :

= 12,5 mg dalam 0,2 ml larutan Na-CMC 0,5%

= 1.250 mg dalam 20 ml Na-CMC 0,5%

3. Dosis 3 = 1 mg/gram BB

= 25 mg/25 gram BB

Ditentukan : 0,2 ml/25 gram BB

Sediaan yang dibuat :

= 25 mg dalam 0,2 ml larutan Na-CMC 0,5%

= 2.500 mg dalam 20 ml Na-CMC 0,5%

 106

Lampiran 5
Teknik ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) TNF-

1. Isi Kit

a. Antimouse TNF- pre-coated 96 well strip microplate

b. Antibodi Mouse TNF-

c. Standard Mouse TNF-

d. Matrix A

e. Avidin-HRP B

f. Assay Buffer A

g. Wash Buffer (20x)

h. Substrate Solution D

i. Stop Solution

j. Plate Sealers

2. Protokol

a. Pembuatan Standar:

Mengencerkan standar dan sampel dengan cara: siapkan standar 500 l

dari 1.000 pg/ml dengan cara pengenceran 25 l larutan stok standar dalam 475

l Tes Buffer A. Dengan perbandingan 2:1 pengenceran serial standar 1.000

pg/ml dalam tabung terpisah menggunakan Tes Buffer A sebagai pengencer.

Dengan demikian, masing-masing konsentrasi standar mouse TNF- dalam

tabung adalah: 1.000 pg/ml, 500 pg/ml. 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml, 31,3

pg/ml, dan 15,6 pg/ml. Tes Buffer A berfungsi sebagai standar nol (0 pg/ml).

b. Cuci 4 kali, 1 kali dengan 300 l Wash Buffer untuk tiap well, kemudian

keringkan dengan tisu.

c. Untuk mengukur sampel:

 107

1) Tambahkan 50 l Matrix A ke masing-masing well yang akan berisi cairan

standar. Tambahkan 50 l Assay Buffer A ke masing-masing well yang akan

berisi sampel.

2) Tambahkan 50 l larutan standar untuk well yang mengandung Matrix A.

Tambahkan 50 l cairan sampel ke well yang mengandung Assay Buffer A.

d. Tutup plate dan inkubasi pada suhu kamar selama 2 jam sambil shaking 200 rpm.

e. Buang cairan ke wastafel, lalu cuci 4 kali, dengan 1 kali Wash Buffer, keringkan

dengan tisu.

f. Tambahkan 100 l cairan antibodi mouse TNF- pada tiap well, tutup plate dan

inkubasi pada suhu kamar selama 1 jam dengan shaking.

g. Buang cairan ke wastafel, lalu cuci 4 kali dengan 1 kali Wash Buffer, keringkan

dengan tisu.

h. Tambahkan 100 l cairan Avidin-HRP B pada tiap well, tutup plate dan inkubasi

pada suhu kamar selama 30 menit dengan shaking.

i. Buang cairan ke wastafel, lalu cuci 5 kali dengan 1 kali Wash Buffer. Setelah

pencucian terakhir, balikkan plate untuk mengeringkan sisa cairan dengan

menggunakan tisu.

j. Tambahkan 100 l cairan Substrat D untuk masing-masing well dan inkubasi

pada suhu ruang untuk pengembangan warna yang tepat (selama 15 menit). Well

yang mengandung Mouse TNF- akan berubah warna dengan intensitas warna

sebanding dengan konsentrasi. Selama langkah ini, tidak perlu untuk menutup

plate.

k. Untuk menghentikan reaksi warna, tambahkan 100 l Stop Solution untuk setiap

well. Warna solusio akan berubah dari biru menjadi kuning.

 108

l. Dengan menggunakan microtiter plate reader, well dibaca dengan panjang

gelombang 450 nm.

m. Kadar TNF- selanjutnya dihitung menggunakan kurva standar, yang

menunjukkan antara nilai OD dengan kadar TNF-. Nilai OD diperoleh dari

masing-masing sampel, ditempatkan pada sumbu Y dari kurva standar dan

selanjutnya ditarik garis lurus dari sumbu Y ke garis regresi, dari titik potong

pada garis regresi tersebut, selanjutnya diproyeksikan ke sumbu X untuk

mendapatkan kadar TNF- dalam pg/ml.

 109

Lampiran 6
Hasil Analisis Statistik
Kadar Tumor Necrosis Factor-

Descriptive Statistics

N Range Minimum Maximum Mean Std. Deviation

Statistic Statistic Statistic Statistic Statistic Std. Error Statistic

K1 5 .775 17.661 18.436 1.80633E1 .137353 .307130

Valid N (listwise) 5

Descriptive Statistics

N Range Minimum Maximum Mean Std. Deviation

Statistic Statistic Statistic Statistic Statistic Std. Error Statistic

K2 5 .694 19.209 19.903 1.96308E1 .114463 .255946

Valid N (listwise) 5

Descriptive Statistics

N Range Minimum Maximum Mean Std. Deviation

Statistic Statistic Statistic Statistic Statistic Std. Error Statistic

K3 5 2.971 17.960 20.931 2.00460E1 .551067 1.232223

Valid N (listwise) 5

Descriptive Statistics

N Range Minimum Maximum Mean Std. Deviation

Statistic Statistic Statistic Statistic Statistic Std. Error Statistic

K4 5 4.734 18.854 23.588 2.04849E1 .824591 1.843841

Valid N (listwise) 5

Descriptive Statistics

N Range Minimum Maximum Mean Std. Deviation

Statistic Statistic Statistic Statistic Statistic Std. Error Statistic

K5 5 1.794 18.333 20.127 1.95461E1 .334967 .749009

Valid N (listwise) 5
 110

Tests of Normality

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
KELOM
POK Statistic Df Sig. Statistic df Sig.

TNFalfa K1 .231 5 .200* .944 5 .692

K2 .321 5 .102 .875 5 .286

K3 .266 5 .200* .800 5 .082

K4 .287 5 .200* .854 5 .208

K5 .283 5 .200* .836 5 .154

a. Lilliefors Significance Correction

*. This is a lower bound of the true significance.

Test of Homogeneity of Variances

TNFalfa

Levene Statistic df1 df2 Sig.

2.408 4 20 .083

ANOVA

TNFalfa

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 16.684 4 4.171 3.698 .021

Within Groups 22.556 20 1.128

Total 39.240 24
 111

Multiple Comparisons

TNFalfa
Bonferroni

(I) (J) 95% Confidence Interval

KELOM KELOM Mean Difference
POK POK (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound

K1 K2 -1.567518 .671653 .302 -3.68551 .55047

K3 -1.982708 .671653 .079 -4.10070 .13528

K4 -2.421626* .671653 .018 -4.53962 -.30363

K5 -1.482865 .671653 .391 -3.60086 .63513

K2 K1 1.567518 .671653 .302 -.55047 3.68551

K3 -.415191 .671653 1.000 -2.53318 1.70280

K4 -.854108 .671653 1.000 -2.97210 1.26388

K5 .084653 .671653 1.000 -2.03334 2.20264

K3 K1 1.982708 .671653 .079 -.13528 4.10070

K2 .415191 .671653 1.000 -1.70280 2.53318

K4 -.438917 .671653 1.000 -2.55691 1.67907

K5 .499844 .671653 1.000 -1.61815 2.61784

K4 K1 2.421626* .671653 .018 .30363 4.53962

K2 .854108 .671653 1.000 -1.26388 2.97210

K3 .438917 .671653 1.000 -1.67907 2.55691

K5 .938761 .671653 1.000 -1.17923 3.05675

K5 K1 1.482865 .671653 .391 -.63513 3.60086

K2 -.084653 .671653 1.000 -2.20264 2.03334

K3 -.499844 .671653 1.000 -2.61784 1.61815

K4 -.938761 .671653 1.000 -3.05675 1.17923

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

 112

Jumlah Makrofag

Descriptive Statistics

N Range Minimum Maximum Mean Std. Deviation

Statistic Statistic Statistic Statistic Statistic Std. Error Statistic

K1 5 1.000 .000 1.000 .20000 .200000 .447214

Valid N (listwise) 5

Descriptive Statistics

N Range Minimum Maximum Mean Std. Deviation

Statistic Statistic Statistic Statistic Statistic Std. Error Statistic

K2 5 .000 4.000 4.000 4.00000 .000000 .000000

Valid N (listwise) 5

Descriptive Statistics

N Range Minimum Maximum Mean Std. Deviation

Statistic Statistic Statistic Statistic Statistic Std. Error Statistic

K3 5 1.000 3.000 4.000 3.20000 .200000 .447214

Valid N (listwise) 5

Descriptive Statistics

N Range Minimum Maximum Mean Std. Deviation

Statistic Statistic Statistic Statistic Statistic Std. Error Statistic

K4 5 .000 3.000 3.000 3.00000 .000000 .000000

Valid N (listwise) 5

Descriptive Statistics

N Range Minimum Maximum Mean Std. Deviation

Statistic Statistic Statistic Statistic Statistic Std. Error Statistic

K5 5 3.000 .000 3.000 1.80000 .489898 1.095445

Valid N (listwise) 5
 113

Tests of Normalityb,c

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
KELOM
POK Statistic df Sig. Statistic df Sig.

MAKROFAG K1 .473 5 .001 .552 5 .000

K3 .473 5 .001 .552 5 .000

K5 .372 5 .022 .828 5 .135

a. Lilliefors Significance Correction

b. MAKROFAG is constant when KELOMPOK = K2. It has been omitted.

c. MAKROFAG is constant when KELOMPOK = K4. It has been omitted.

Test of Homogeneity of Variances

MAKROFAG

Levene Statistic df1 df2 Sig.

3.172 4 20 .036

Kruskall-Wallis

Ranks Test Statisticsa,b

KELOMPOK N Mean Rank MAKROFAG

MAKROFAG K1 5 3.60 Chi-Square 21.471

K2 5 22.50 df 4

K3 5 16.10 Asymp. Sig. .000

a. Kruskal Wallis Test

K4 5 14.50
b. Grouping Variable:
K5 5 8.30
KELOMPOK
Total 25