Anda di halaman 1dari 31

MAKALAH PEWARNAAN JARINGAN

DISUSUN OLEH :

Maria Theresa Diana

UNIVERSITAS MOHAMMAD HUSNI THAMRIN

1
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang

Histoteknik adalah metoda membuat sajian dari spesimen tertentu melalui suatu
rangkaian proses hingga menjadi preparat histologi yang baik dan siap untuk
dianalisis. Spesimen dapat berasal dari manusia dan hewan. Preparat yang baik
dapat digunakan untuk mempelajari peran sel/jaringan dalam keadaan fisiologis atau
patologis, mempelajari perubahan sel/jaringan akibat suatu perlakuan pada
penelitian, dan alat bantu diagnosis penyakit. Preparat yang baik dapat memberikan
hasil yang akurat untuk menjawab pertanyaan riset. Untuk mencapai tujuan tersebut,
preparat harus dapat memberikan gambaran tentang bentuk, besar, dan susunan
sebagaimana sel/jaringan itu hidup.
Kebanyakan jaringan didapati tidak berwarna, sehingga tidak banyak yang dapat
dilihat di bawah mikroskop. Agar dapat dilihat dibawah mikroskop, kebanyakan
sediaan harus diwarnai. Oleh sebab itu, telah dirancang pewarnaan jaringan agar
berbagai unsur jaringan jelas terlihat dan dapat dibedakan. Bahan warna mewarna
berbagai jaringan, kurang lebih secara selektif.
Hematoksilin dan Eosin adalah metode pewarnaan yang banyak digunakan
dalam dalam pewarnaan jaringan sehingga ia di perlukan dalam diagnosa medis dan
penelitian. Hematoksilin adalah bahan pewarna yang sering digunakan pada
pewarnaan histoteknik, ia merupakan ekstrak dari pohon yang diberi nama logwood
tree. Hematoksilin bekerja sebagai pewarna basa, artinya zat ini mewarnai unsur
basofilik jaringan. Hematoksilin memulas inti dan strukutur asam lainnya dari sel
(seperti bagian sitoplasma yang kaya RNA dan matriks tulang rawan) menjadi biru.
Eosin bersifat asam. Ia akan memulas komponen asidofilik jaringan seperti
mitokondria, granula sekretoris dan kolagen. Tidak seperti hematoksilin, eosin
mewarnai sitoplasma dan kolagen menjadi warna merah muda (Junquera, 2007).

B. Tujuan

Makalah ini di buat penulis dengan tujuan agar mahasiswa/i, tenaga kesehatan
atau tenaga medis dapat memahami berkaitan tentang pewarnaan jaringan.

C. Rumusan Masalah

Bagaimana cara pelaksanaan pewarnaan jaringan sitohistoteknologi?

2
BAB II
PEMBAHASAN

A. PENGERTIAN

Kebanyakan jaringan didapati tidak berwarna, sehingga tidak banyak yang dapat
dilihat di bawah mikroskop. Agar dapat dilihat dibawah mikroskop, kebanyakan
sediaan harus diwarnai. Oleh sebab itu, telah dirancang pewarnaan jaringan agar
berbagai unsur jaringan jelas terlihat dan dapat dibedakan. Bahan warna untuk
mewarnai berbagai jaringan, kurang lebih secara selektif

Jaringan dibentuk oleh dua komponen yang saling berinteraksi yaitu sel dan
matriks ekstrasel. Matriks ekstrasel terdiri atas banyak jenis molekul, dan
kebanyakan diantaranya sangat rumit dan membentuk struktur kompleks, seperti
serabut dan membrane basal. Fungsi matriks ekstrasel ini adalah sebagai
penunjang mekanis bagi sel-sel, mengangkut nutrient ke sel-sel, dan membawa
katabolit dan produk sekresi. Walaupun menghasilkan matriks ekstrasel, sel tersebut
di pengaruhi dan kadang di atur oleh molekul-molekul matriks. Sehingga terdapat
semacam interaksi intensif antara sel-sel dan matriks.

Setiap jaringan dibentuk oleh beberapa jenis sel dan secara khas oleh asosiasi
sel dan matriks ekstrasel yang spesifik. Asosiasi yang khas ini akan mempermudah
pengenalan sejumlah besar subtype jaringan. Kebanyakan organ dibentuk oleh
kombinasi beberapa jenis jaringan, kecuali susunan saraf pusat, yang hampir
seluruhnya terdiri atas jaringan saraf. Kombinasi yang tepat dari jaringan-jaringan
tersebut memungkinkan berfungsinya setiap organ dan organisme secara
keseluruhan.
Ukuran sel dan matriksnya yang kecil menyebabkan histology bergantung pada
penggunaan mikroskop. Kemajuan di bidang kima, biologi molecular, fisiologi,
imunologi dan patologi serta interaksi di antara bidang-bidang tersebut sangat
penting untuk memperoleh pengetahuan yang lebih baik dibidang bilogi jaringan.
Pembiasaan dengan alat dan metode setiap cabang ilmu sangat penting untuk
memahami topic pembelajaran dengan baik, sehingga makalah ini akan membahas
beberapa metode yang di pakai dalam mempelajari sel dan jaringan.

3
B. KOMPONEN HISTOTEKNIK

Larutan pengawet
Pengawetan (fiksasi) adalah stabilisasi unsur penting pada jaringan sehingga
unsur tersebut tidak terlarut, berpindah, atau terdistorsi selama prosedur
selanjutnya. Fiksasi yang benar adalah dasar dari semua preparat yang baik. Efek
fiksasi terhadap jaringan yang diproses adalah menghambat proses pembusukan
dan autolysis, pengawetan jaringan, pengerasan jaringan, pemadatan koloid,
diferensiasi optik, dan berpengaruh terhadap pewarnaan. Sejumlah faktor akan
mempengaruhi proses pengawetan yaitu dapar, penetrasi, volume pengawet,
konsentrasi, interval waktu, suhu, dan jenis larutan pengawet.
Cara melakukan pengawetan jaringan ada 2 macam, yaitu supravital/intravital
atau merendam dalam larutan pengawet. Merendam dalam larutan pengawet adalah
yang paling sederhana dan sering dilakukan.

Pemrosesan jaringan
Setelah jaringan diawetkan, jaringan harus diproses menjadi bentuk yang dapat diiris
dengan mikrotom. Biasanya pengirisan dikerjakan dengan parafin (suatu jenis lilin).
Langkah utama pemrosesan jaringan adalah dehidrasi dan pembeningan. Jaringan
tertentu memiliki struktur yang berbeda dengan kebanyakan jaringan lainnya.
Jaringan yang mengandung kalsium (tulang) atau jaringan yang keras (kulit) akan
menjalani proses tertentu sebelum proses dehidrasi.
Adapun pemrosesan jaringan terdiri atas:
Pemotongan dan persiapan jaringan untuk pemulasan
untuk mempelajari struktur sel dan organisasinya dalam jaringan maka
jaringan harus difiksasi dan dibuat potongan, dipulas dengan zat pewarna dan
kemudian diobservasi dengan mikroskop cahaya. Hal ini dilakukan dengan tahapan-
tahapan berikut:

1. Mendapatkan Jaringan

Jaringan harus diduga tumor atau kelainan

Jaringan harus sudah difikasasi sebelum 6 jam setelah kematian, bisa


terjadi maserasi

Pemotongan menggunakan pisau tajam ukuran biasanya (1,5x1x0,5) cm 3

Mendapatkan Jaringan

Harus segera dimasukkan ke dlm larutan fiksasi (Volume 40x) selama 1


malam

Tidak boleh dicuci dengan air (terjadi perubahan tekanan osmotik


Tidak boleh disimpan dalam NaCl 0,9 % -maserasi

4
Tidak boleh dibekukan-pembentukan kristal es dlm sitoplas
Jaringan berbentuk tulang harus didekalsifikasi agar lunak dg HCl 0,5 %

2. Fiksasi
Organ sediaan dicuci dengan larutan NaCl 0,9% Suatu bahan kimia yang
mengandung bahan fiksatif pada pH 7,0 ditambahkan kejaringan. Bahan
fiksatif yang paling umum digunakan adalah formaldehida dengan kosentrasi
4%. (umumnya, pengenceran dibuat dari larutan stok formalin. Yaitu
formaldehida 37% atau 40%). Formaldehida berikatan dengan beberapa
protein dan membentuk ikatan silang. Kemudian mendenaturisi protein
lainnya, namun tidak berinteraksi dengan lipid. Efek keseluruhan adalah untuk
mempekeras jaringan dan menginaktvikasi enzim, yang mencegah degradasi
jaringan.
Manfaat Fiksasi :
Sel & jar keadaannya seperti hidup
Membunuh Bakteri
Mematikan sel secara serentak
Mengeraskan jaringan
Melindungi sel dari prosesselanjutnya
Mempermudah pengecatan
Melindungi sel/jar dari autolysis dan putrefaction

3. Pencucian (washing)
Setelah difiksasi, dilakukan pencucian dengan menggunakan alkohol 70%
yang berguna untuk menghilangkan larutan fiksasi dari jaringan.

4. Dehidrasi
Langkah ini dilakukan setelah proses pencucian selesai, dengan
menggunakan alkohol bertingkat dimulai dari alkohol 70%, 80%, 96%. dan
berakhir pada kosentrasi 100%. Proses ini dilakukan secara bertahap dengan
tujuan meminimalkan kerusakan jaringan.
Proses penarikan air secara aktif dari dalam jaringan
Proses Dehidrasi
Untuk memudahkan proses infiltrasi parafin ke dalam jaringan menggunakan
alkohol dari konsentrasi rendah-tinggi

5
Lamanya waktu tergantung pada :
Besar kecilnya jaringan
Konsentrasi jaringan
Macam zat fiksasi yang dipakai
Sifat clearing agent yang dipakai

Contoh Proses Dehidrasi


alkohol 70%.......... 1 hari
alkohol 80%........... 1 hari
alkohol 90%........... 1 hari
alkohol 95% .......... 1 hari
alkohol 95% .......... 1 hari
alkohol 100% ........ 1 hari
alkohol 100% ........ .1 hari

Alkohol dapat dimurnikan kembali dengan cuprisulfat (CuSO4) Cuprisulfat-putih (tak


mengandung air) akan berubah menjadi biru (mengandung air). Ganti cuprisulfat
beberapa kali hingga warnanya tetap putih walaupun telah disimpan beberapa hari.
Cuprisulfat yang telah bewarna biru karena mengandung air dapat di hilangkan
airnya dengan cara memanaskan.

5. Penjernihan (clearing)
Penjernihan dilakukan dengan menggunakan xylol 1, dan xylol 2
Selanjutnya potongn ditepatkan dalam pelarut organic seperti xlena atau
toluena, yang menggantikan alcohol. Lilin tidak larut dalam alcohol. pelarut
tersebut disebut bahan penjernih karena jaringan sering kali terlihat tampak
sangat jelas saat dipendam dalam bahan penjernih, akhirnya jaringan
diimpregnasi dengan lilin panas yang larut dalam jenis pelarut ini.

6. Infiltrasi
Proses infiltrasi dilakukan di dalam oven dengan suhu 56oC, menggunakan
perbandingan parafin 1, 2, dan 3 masing-masing selama 2 menit. Proses ini
dimaksudkan untuk menghindari perubahan lingkungan yang sangat
mendadak terhadap jaringan tersebut.
7. Penanaman (embedding)

6
Jaringan ditempatkan dalam lilin parafin hangat pada suatu cetakan.
Embedding dilakukan dlm oven dgn suhu 58-60C.
Pada pendinginan selanjutnya lilin akan mengeras dan lembaran jaringan
dapat dipotong.
Proses Embedding
Impregnation.
proses penggantian larutan toluen dengan parafin cair
Blocking.
Memasukkan jaringan ke dalam parafin cair - dipadatkan (menurunkan
suhu parafin)-dicetak
Trimming.
Meratakan/merapikan jaringan yg telah diblock parafin dengan
menggunakan pisau atau langsung dengan mikrotome, sehingga pada
saat pemotongan didapatkan potongan bentuk jaringan yang baik.

8. Pemotongan (sectioning)

Penyayatan atau pemotongan dilakukan dengan memotong blok parafin yang


telah ditempelkan pada holder kemudian dipasang pada mikrotom, lalu
mikrotom diputar sampai blok parafin yang berisi organ tadi terpotong menjadi
pita-pita parafin dengan ukuran ketebalan 10-20 m.
Sectioning adalah proses pemotongan jar dengan mikrotom-ukuran sangat
tipis 4-10 -tembus cahaya saat diperiksa dg mikroskop
Diperhatikan :
Pisau harus tajam
Blok jaringan harus dingin
Ketebalan pemotongan harus disesuaikan dengan jenis jaringan
Proses Sectioning

7
Dinginkan pada lemari es / cold plate - akan terlepas dari cetakan bloknya
dan tempatkan pada hold mikrotome untuk dipotong (ketebalan 3 5 )
-membentuk lembaran pita

9. Perekatan (mounting)

Potongan lilin diletakkan pada kaca objek mikroskop


Proses Mounting

Obyek glass diberi albumin agar Jar menempel dg baik


Dimasukkan ke dalam water bath suhu 30 0C - lembaran pita tidak melipat
Bila sudah menempel dikeringkan/ diriskan (Bisa dg Hot Plate)
Stretching tissue in warm water.

10. Penempelan (affiksing)


Penempelan dilakukan dengan mengambil beberapa pita paraffin yang telah
terpotong dengan menggunakan skapel, kemudian dimasukkan ke dalam
water bath ( 40-50 oC) 2 menit, hal ini bertujuan agar jaringan tidak
berlipat, lalu di tempelkan pada objek glass yang telah diolesi albumin
secukupnya
11. Dimasukkan kembali ke dalam xylol 1 dan xylol 2 hal ini bertujuan untuk
meghilangkan paraffin yang masih ada pada jaringan
12. Redehidrasi
Langkah ini dilakukan dengan menggunakan alkohol dimulai dari alkohol
absolute hingga 70 %.
13. Pewarnaan (staining)
Pewarna yg digunakan semua berbahan dasar air, sayatan jaringan masih
penuh dengan parafin yang tidak dapat menerima lar. Pewarna, sehingga lilin

8
harus dilarutkan dan diganti dgn air agar zat warna mampu menembus
potongan jaringan. Dengan cara Potongan ditempatkan dalam alkohol
dengan konsentrasi yg semakin menurun dan terakhir hanya air. Sehingga
sediaan diatas kaca objek dpt diwarnai, sedian yang sudah diwarnai
dikeringkan dan ditutup dengan kaca penutup.
Tujuan :
Jaringan terlihat tampak nyata
Dapat membedakan bagian-bagian jaringan

Berdasarkan waktu :

Direct Staining, molekul zat warna langsung ditangkap oleh jaringan,


misalnya Eosin

Indirect Staining, molekul zat warna baru bisa ditangkap oleh jaringan
jika menggunakan zat perantara yang disebut Mordant, misalnya
Haematoxyline menggunakan Potasium Alum sebagai mordantnya.

14. Penutupan (mounting)


Dari xylol jaringan kemudian ditutup dengan cover glass setelah ditetesi
dengan Canada balsam terlebih dahulu.
15. Diiberi label dan di amati di bawah mikroskop.

Alat dan Bahan


1. Jaringan yang akan dibuat menjadi preparat
2. Formalin 10%
3. Alkohol 70%, 80%, 95%, 100%
4. Xylol
5. Parafin
6. Wadah cetakan (kayu segi empat)
7. Microtome knife
8. Waterbath (suhu diatur 45-500C)
9. Kaca Objek
10. Albumin (putih telur + gliserin)
11. Larutan Hematoxylin
12. Larutan Eosin
13. Deck Glass
14. Label

Cara Kerja
1. Persiapan Jaringan
- Persiapkan jaringan yang akan dijadikan preparat

9
- Potong jaringan sekitar 1cm x 1cm untuk memudahkan fiksasi, sehingga
cairan fiksasi dapat menyerap sampai ke seluruh jaringan.
2. Tahap Fiksasi/Pengawetan
- Rendam jaringan yang sudah dipersiapkan tadi ke dalam cairan Formalin
10% selama 24 jam
- Hal yang harus diperhatikan dalam proses fiksasi jaringan histologi:
a. Tebal irisan : jangan terlalu tebal (1cm x 1cm) supaya mempermudah
penyerapan cairan fiksatif merata ke seluruh jaringan.
b. Volume cairan fiksatif : harus sampai dapat merendam seluruh bagian
jaringan
c. Jenis cairan fiksatif yang digunakan.
- Pasca fiksasi, jaringan yang keras mendapat perlakuan khusus, yaitu :
a. Tulang: dekalsifikasi dengan formic acid 8%.
b. Kulit: teknik lendrum cuci dengan air kran mengalir atau alkohol 90% atau
Fenol 4% dalam akuades selama 1 -3 hari. Jenis cairan fiksatif :
c. Formalin
- Yang digunakan adalah bentuk monomer: dibuat dengan
menetralkan/alkalis larutan
- Mengakibatkan crosslink protein
- Dapat berupa: Formal saline, formal calcium, 10% neutral buffered
formalin, buffer formalin sukrosa
d. Bouin
- Mengandung asam pikrat, meledak kalau kering
- Mudah dikenali saat pemotongan warna kuning
- Mempunyai daya penetrasi yang cepat dan merata
- Jaringan mengalami pengerutan
e. Zenker Formol (Cairan Helly)
- Mengandung merkuri klorida
- Daya fiksasinya cepat dan kuat, tetapi kecepatan penetrasinya
berkurang setelah meresap sejauh beberapa milimeter pertama dan
potongan jaringan yang melebihi ketebalan 5 mm pada umumnya
cenderung untuk menjadi keras (rapuh), overfixed di bagian pinggir
sementara di bagian tengah menjadi lunak karena underfixed
- Fiksatif ini sangat baik untuk fiksasi sumsum tulang dan limpa,
mitokondria.
f. Etanol
- Untuk Cytological fixatives
- Yang biasa digunakan: Etanol 95%
- Digunakan untuk Pap test, swab
- Mempertahankan antigenisitas cocok IHC
g. Larutan Carnoy
- Mengawetkan substansia Nissl dan glikogen
- Daya penetrasi yang cepat

10
- Fiksasi ini sering digunakan apabila suatu diagnosis perlu ditegakkan
dengan cepat, misalnya untuk diagnosis kanker pada saat
pembedahan. Fiksasi umumnya selesai setelah 1-2 jam,sedangkan
potongan kecil selesai difiksasi dalam 15 menit.
- Efek pengerutan: kuat
3. Tahap Dehidrasi
- Rendam Jaringan yang sudah difiksasi ke dalam larutan Alkohol secara
bertahap :
Larutan Alkohol 70 % Larutan Alkohol 80% Larutan Alkohol 90%
masing-masing 1 hari
Larutan Alkohol 95% 2 hari (2xganti)
Larutan Alkohol 100% 2 hari (2xganti)
- Dilakukan bertahap dari konsentarsi Alkohol yang rendah ke
konsentrasi Alkohol yang tinggi agar stroma tidak terlepas dari jaringan,
dimana stroma yang lepas dapat menjadi artefact pada saat kita
mengamati preparat bila telah jadi.
- Efek minimal dehidrasi sudah mulai terjadi setelah 10 menit jaringan
terendam dalam Larutan Alkohol.

4. Tahap Pembeningan/Clearing
- Rendam Jaringan yang sudah melalui tahap dehidrasi ke dalam cairan
Xylol yang diletakkan dalam wadah kaca (karena wadah plastik bisa
larut bila terkena Xylol)
- Dilakukan 2 kali (Xylol I dan Xylol II) masing-masing selama 15 menit.
- Tujuan dilakukan clearing adalah untuk menarik sisa alkohol dari
jaringan sebagai persiapan jaringan memasuki tahap pembenaman.
- Xylol menyebabkan sitoplasma menjadi kosong (menjadi jaringan
murni)

Bahan yang digunakan :


a. Cedar wood oil
- Sifat clearing-nya paling baik.
- Tidak mengeraskan jaringan Jaringan yang halus sangat baik. Kadang
digunakan untuk jaringan keras (kulit dan jaringan ikat padat)
- Dapat disimpan dalam waktu lama (berbulan-bulan)
- Mahal
b. Chloroform Keuntungan :
- Paling sering dipakai
- Bersifat toleran (dapat disimpan semalaman tanpa menjadi keras) Kerugian
- Titik akhir tak dapat dilihat dengan mata - Saat menjadi bening dan
transparan tak jelas
- Cara mengatasi : waktu pembeningan diperpanjang

11
- Lebih mahal dari xylene dan benzene tetapi lebih murah dari cedar wood oil.
c. Benzyl benzoat Metode :
- Benzyl benzoat I selama 24 jam hingga jaringan tenggelam. Jaringan menjadi
bening dan transparan.
- Benzyl benzoat II selama 2-3 jam.
- Benzol-Paraffin selama - 1 jam. Campuran benzol dan paraffin cair dengan
perbandingan sama.
- Masukkan ke dalam paraffin cair.
d. Methyl benzoat Metode :
- Methyl benzoat I sampai jaringan tenggelam.
- Daya penetrasi lebih cepat dari benzol benzoat
- Jaringan mudah rapuh - Methyl benzoat II selama 1-2 jam.
- Benzol-Paraffin. Campuran benzol dan paraffin dengan perbandingan sama.
- Masukkan ke dalam paraffin cair.
e. Benzene dan Xylene/Xylol
Keuntungan:
- Waktu clearing cepat : - 1 jam.
- Benzene lebih lambat dari xylene tetapi kerapuhan jaringan lebih berkurang
dibanding xylene
Kerugian: Karsinogenik
Metode:
- Direndam dalam xylol 2 x 15 menit hingga bening dan transparan
- Volume 50 1000 kali volume jaringan
- Setelah itu masukkan ke dalam paraffin cair
f. Toluene
- Sama dgn xylene tetapi lebih lambat
- Menimbulkan sedikit pengerasan dan distorsi jaringan
- Mudah menguap
5. Tahap Pembenaman/Pregnation
- Agar jaringan mudah dipotong maka jaringan harus dipadatkan
menggunakan paraffin
- Impregnasi adalah proses pengeluaran cairan pembening (clearing agent)
dari jaringan dan menggantikannya dengan paraffin.
- Dilakukan dengan menggunakan paraffin oven
- Clearing agent yang tersisa dapat mengkristal dalam jaringan sehingga
saat dipotong dengan mikrotom jaringan akan robek.
Teknik Pembenaman:
- Paraffin/ paraplast I selama 1 jam;
- Paraffin/ paraplast II selama 1 jam;
- Paraffin/ paraplast III selama 1 jam.
- Setelah pembenaman, proses dilanjutkan dengan pengecoran (blocking).
6. Tahap Pengecoran/Blocking

12
Alat Cetak :
- Kayu/ besi potongan berbentuk L (Leuckhart). Susun 2 buah potongan
kayu/ besi di atas lembaran logam sehingga membentuk ruang kubus
- Histoplate dari plastik (casette) dan piringan logam (mold).
Teknik Pengecoran:
- Tuangkan sedikit paraffin cair di bagian pinggir agar tidak bocor
- Letakkan jaringan sesuai dengan keinginan saat jaringan diiris (potongan
jaringan yang ingin diamati di bawah mikroskop diletakkan di dasar agar
permukaannya rata)
- Tuangkan paraffin secukupnya agar menutupi jaringan seluruhnya
- Hindarkan terbentuknya air bubble
- Diamkan semalaman (12 jam)
7. Tahap Pemotongan Jaringan
Jenis pemotongan
Potongan beku

Jaringan dibekukan, difiksasi dan dibuat potongan dengan menggunakan


karisot sebelum dipulas

Potongan semi-tipis

Jaringan dipendam dalam resin epoksi atau akrilik, yang memiliki sifat
berbedadengan lilin dan memungkinkan dibuat potongan yang lebih tipis
(kurang dari 2 mikron)

- Letakkan pisau pada mikrotom dengan sudut tertentu.


- Rekatkan blok paraffin yang akan dipotong pada holder dengan
menggunakan spatula atau scalpel blade yang panas.
- Letakkan holder berikut blok preparat pada tempatnya di mikrotom.
- Ketebalan irisan + 5 10 m (disesuaikan kebutuhan)
- Atur jarak preparat yang dipegang oleh holder ke arah pisau sedekat mungkin
- Gerakkan rotor (putaran) pada mikrotom secara ritmis
- Buang pita-pita paraffin awal yang tanpa jaringan,
- Setelah potongan mengenai jaringan, potong blok preparat secara hati-hati,
- Pindahkan secara hati-hati dengan sengkelit ke atas air di dalam waterbath
yang diatur pada suhu 55oC, tujuannya agar lembaran/ pita paraffin
terkembang dengan baik.
- Setelah pita paraffin terkembang dengan baik, tempelkan paraffin ke kaca
objek yang telah terlebih dahulu diolesi dengan albumin, dengan cara
mencelupkan kaca objek tegak lurus ke dalam waterbath, perkirakan agar
potongan jaringan yang akan diamati menempel di tengah kaca objek.

13
- Simpan kaca objek berisi potongan paraffin dan jaringan selama semalaman
(12 jam) agar benar-benar kering.
8. Tahap Pewarnaan
Jenis-jenis pewarnaan:
- Hematoxylin & Eosin (Rutin) Paling banyak digunakan rutin HE dapat
menunjukkan sebagian besar struktur histologi
- Khusus : a. PAS, PTAH, Impregnasi perak
b. Sudan lipid
- Sitologik : a. Pap test
b. Blood smear
c. Swab mukosa - Imunohistokimia
- Metode:
1. Deparafinisasi dengan Xylol 2 x 2 menit
2. Rehidrasi dengan alkohol 100% (2x2 menit) 95% (2 menit) - 90%(2
menit) 80% (2 menit) 70% (2 menit) air kran 3 menit
3. Rendam dalam larutan Hematoxylin Mayer selama 5-10 menit
4. Bilas dalam air mengalir selama 15-20 menit
5. Observasi di bawah mikroskop: Hematoxylin mewarnai sitoplasma
menjadi berwarna pink (eosinofilik)
6. Bila warna preparat terlalu biru, untuk mengurangi warna biru
hematoxyllin (to differentiate nuclear staining) lakukan Acid Alkohol
Rinse menggunakan 0.25 % acid rinse: Akuades 975 ml + HCl 25 ml
7. Bila warna preparat kurang biru lakukan Blueing menggunakan air
kran (yang alkalis) dengan pH 7,8 atau Lithium carbonate (Lithium
carbonate 0,5 gr + Akuades 1000 ml campurkan dengan baik)
8. Lalu counterstaining dengan eosin working solution selama 3 menit.
9. Dehidrasi dalam serial alkohol dengan gradasi meningkat: 70% (2x2
menit) 80% (2x2menit) 90% (2x2menit) 100% (2x2 menit)
10. Rendam kembali dalam Xylol 2 x 2 menit.
9. Tahap Perekatan/Mounting
- Perekatan/ mounting menggunakan Canada Balsem
- Letakkan 1 tetes Canada balsam diatas deck glass, lalu tutupkan ke atas
kaca objek jangan sampai ada gelembung udara
- Observasi di bawah mikroskop
10. Tahap Labeling
Tahap akhir dengan memberikan label nama pada preparat jaringan yang telah
selesai dibuat.

Pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE)


Menggunakan 2 macam zat warna yaitu
Hematoksilin -memulas inti sel dan memberikan warna biru (basofilik)

14
Eosin yang merupakan counterstaining hematoksilin, memulas sitoplasma sel
dan jaringan penyambung dan memberikan warna merah muda dengan
nuansa yang berbeda.

Persiapan reagen :
Komposisi hematoksilin

Kristal haematoxylin. 1 gr
Akuades... 1000 ml
Sodium iodate... 0,2 gr
Ammonium/potassium alum...... 50 gr
Citric acid...... 1 gr
Chloralhydrate... 50 gr

Cara pembuatan Hematoksilin


Larutkan Ammonium/Potassium alum di dalam aquades.
Tambahkan Haematoxylin dan campurkan secara baik.
Tambahkan Sodium Iodate, Citric Acid, dan Chloralhydrate.
Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik.
Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya.

Komposisi Eosin
Eosin-alkohol Stock 1%
Eosin y ws... 1 gr
aquades 20 ml
Larutkan dan tambahkan alkohol 95% .. 80 ml

Cara pembuatan Eosin


Eosin-alkohol stock 1 bagian
Alkohol 80% 3 bagian
Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan Asam Asetat glasial 0,5 ml
untuk setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik.

Pewarnaan Hematoksilin & Eosin


Xylol 1 dan 2 masing masing 2 menit, Alkohol 100% 2 menit (2x), Alkohol 95%
2 menit (2x)
1. masukkan ke dalam larutan hematoksilin selama 10-15menit
2. cuci dengan air mengalir sampai tidak luntur
3. celupkan dalam HCL 0,4 % 2x celup untuk decolorisasi
4. cuci dengan air mengalir
5. Masukkan ke Lithium karbonat 5% selama 3X celup
6. Cuci dengan air mengalir
7. masukkan ke dalam larutan eosin 1% 2menit
8. Masukkan ke dalam larutan Etanol 1 3x celup
9. Masukkan ke dalam larutan Etanol 2 3x celup
10. Masukkan ke dalam larutan Etanol 3 3x celup
11. Masukkan ke dalam larutan Xylol 1 5menit
12. Masukkan ke dalam larutan Xylol 2 5menit
13. Masukkan ke dalam larutan Xylol 3 5menit

15
14. Di mounting dan diberi label

Interpretasi hasil :
Inti sel bewarna biru
Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna
pada komponen tertentu

Contoh :
Sumsum Tulang

Teknik pewarnaan : HE

Perhatikan :

- Textus connectivus reticularis sebagai jaringan dasar yang dengan pewarnaan


HE serabutnya tidak tampak.
- Megakariosit merupakan sel raksasa dengan nucleus relatif besar, dan
sitoplasma berwama merah
- Normoblas memiliki sitoplasma berwarna kemerah-merahan, nucleus biru letak di
tengah.
- Haemocytoblastus, adipocytus.

JENIS-JENIS PULASAN HISTOLOGI

1. Pulasan jaringan ikat

16
Metode Masson trikrom menggunakan tiga pewarnaan berbeda (hematoksilin,
acid fuchsin, dan methyl blue), menghasilkan tiga warna dalam potongan
yang dipulas.
Pewarnaan Masson Trikrom
1. Dilakukan deparafinisasi menggunakan larutan cleaning dimasukkan ke
dalam xylol dalam 3 wadah masing-masing 3 menit.
2. Kemudian dehidrasi ke dalam alkohol bertingkat (100%,100%,96%,96%)
masing-masing 3 menit dicuci dengan air
3. Obyek glass direndam ke dalam larutan mallory I yang berisi acid fuchsine
0,5 gr dan aquades 100cc selama 5 menit kemudian dicuci dengan
aquades
4. Obyek glass direndam ke dalam larutan mallory II yang berisi
phosphomolibdic acid 1gr dan aquades 100cc selama 5 menit kemudian di
drainasi
5. Obyek glass direndam ke dalam larutan mallory III yang berisi aniline blue
0,5 gr, orange G 2,0 gr, oxalic acid 1gr dan aquades 100 cc selama 2
menit kemudian dicuci dengan aquades
6. Obyek glass kemudian direndam ke dalam larutan asam asetat 1%
selama 2 menit
7. Dilakukan dehidrasi alkohol bertingkat (96%,96%,100%,100%)
8. Dilakukan cleaning direndam dalam xylene 3 kali dalam wadah berbeda
masing-masing selama 3 menit
9. Dilakukan mounting
Hasil pewarnaan :

Otot bewarna merah

Nucleus terpulas menjadi biru

Sitoplasma sel darah merah (eritrosit) dan keratin terpulas menjadi merah
cerah

Kolagen dalam membrane basal, jaringan ikat, dan kartilago terpulas


menjadi hijau.

Pulasan yang juga digunakan untuk mewarna jaringan ikat adalah Van
Gieson.

17
2. Pulasan giemsa

Jenis pulasan ini digunakan untuk sumsum tulang dan apus darah.
Pewarnaan Giemsa :
1. Sediaan apus telah benar-benar kering di udara
2. Fiksasi dengan methanol minimal 5 menit
3. Cuci dengan aquadest, biarkan kering di udara
4. Tetesi dengan pewarna Giemsa dengan perbandingan (GZ : Bufer phosfat
= 1:4)
5. Cuci dengan aquadest, kering diudara
6. Tutup lalu lakukan mounting
Hasil Pewarnaan :

Sel darah merah terpulas menjadi merah muda (tidak memiliki nucleus)

Sel darah putih : sitioplasma terpulas menjadi biru pucatdan nucleus


terpulas menjadi biru tua/ungu

Sitoplasma eritrosit bewarna merah muda


Nucleus limfosit bewarna ungu tua-biru dengan sitoplasma biru pucat
Sitoplasma monosit bewarna biru pucat dan nucleus bewarna biru sedang
Nucleus neutrophil bewarna biru tua
Nucleus eosinofil bewarna biru tuadan granula bewarna merah muda
terang
Nukleus basofil basofil bewarna biru tua atu ungu , sotoplasmanya
bewarna biru pucat dan granula bewarna ungu tua
Trombosit bewarna biru muda

18
3. Pulasan perak untuk neuron

Pulasan histologi standar tidak dapat digunakan pada neuron. Terutama


karena membrane plasmanya kaya akan lipid. Lebih jauh lagi nucleus tidak
terdeteksi kecuali jika potongan meliputi bagian sistem saraf pusat yang
merupakan tempat dari mayoritas nucleus. Pulasan perak dapat digunakan
dengan baik. Pulasan perak memulas saraf dan terminal akson (terminal
bouton) menjadi warna hitam. Metode alternatifnya adalah Golgi-Cox (merkuri
klorida, kalium kromat dan dikromat)
Pewarnaan Perak :
1. Lakukan deparafinasi preparat (blok parafin) dengan xylene sebanyak 3
kali masing-masing 3 menit.
2. Rehidrasi preparat dengan menggunakan etanol 100%, etanol 95 % dan
etanol 70% masingmasing selama dua menit, dua menit, satu menit dan
terakhir dengan air selama satu menit.
3. Imersikan preparat dalam bufer natrium sitrat (pH 6,0).
4. Inkubasi preparat di dalam autoklaf pada suhu 120C (tekanan 1,1-1,2
bar) selama 20 menit.
5. Dinginkan preparat sampai suhu 37C.
6. Imersikan preparat ke dalam larutan pengecatan perak yang terdiri dari :
1 bagian volume gelatin 2% dalam asam formiat 1% 2 bagian larutan
perak nitrat 25% dalam suhu 37C, selama 11 menit.
7. Hentikan reaksi pengecatan dengan mencuci slide preparat menggunakan
aqua bidestilata untuk menghilangkan presipitat perak nonspesifik.
8. Dehidrasi preparat menggunakan etanol dengan konsentrasi yang
dinaikkan secara bertingkat (50%, 70%, 95%)
9. Bersihkan preparat dengan xylene
10. Tutup preparat dengan coverslip
11. Amati jumlah blackdots tiap sel menggunakan mikroskop cahaya dengan
perbesaran 1000x. Parameter kuantitatif AgNOR : mAgNOR : hitung
rata-rata blackdots pada minimal 100 sel yang diamati. pAgNOR : hitung

19
jumlah sel yang memiliki blackdots kurang dari 5 dan yang memiliki
blackdots lebih dari 5 pada minimal 100 sel yang diamati.
12. Dokumentasi setiap pengamatan

4. Cresyl violet

Pulasan ini digunakan untuk mewarnai subtansi nissl (reticulum endoplasma


kasar) dalam badan sel neuron
Pewarnaan Cresyl Violet :
1. Slide jaringan dalam parafin yang akan diwarnai dengan cresyl echt
violet diatur dalam rak pewarnaan, kemudian diinkubasi pada suhu 60 C
selama 2 jam. Tujuan inkubasi ini adalah menguatkan lagi perlekatan atau
adhesi jaringan dengan slide
2. Slide dikeluarkan dari inkubator dan disimpan pada suhu ruang untuk
diwarnai pada hari berikutnya atau minimal 90 menit pada suhu ruang.
Tujuannya agar suhu slde jaringan kembali pada suhu ruang sebelum
dilakukan proses selanjutnya.
3. Selanjutnya dilakukan deparafinisasi dengan xilol sebanyak tiga kali
masing-masing selama lima menit
4. Kemudian slide rehidrasi dengan memasukkan slide jaringan ke dalam
alkohol bertingkat dari alkohol absolut dua kali, alkohol 95% dua kali,
alkohol 80 %, alkohol 70% masing-masing lima menit, dan dicelup dalam
aquades hingga alkohol hilang.
5. Setelah proses rehidrasi, slide jaringan dimasukkan dalam cresyl
violet (Chroma, 1A 396) selama 30 menit pada suhu 37 C,
6. Kemudian didehidrasi dengan alkohol 70% sampai dengan alkohol
absolut masing-masing lima celup,
7. Selanjutnya dilakukan clearing dalam xilol sebanyak tiga kali masing-
masing dua menit. Slide yang telah diwarnai ditutup dengan kaca penutup
(mounting) yang sebelumnya telah ditetesi dengan xilol dan mounting
medium Canada balsam

20
5. Pulasan karbohidrat dan musin

Dalam reaksi periodic acid-schiff (PAS), asam periodat mengoksidasi


karbohidrat dan molekul yang kaya karbohidrat seperti glikosaminoglikan dan
reagen Schiff memulas molekul teroksidasi yang dihasilkan menjadi warna
ungu gelap kemerahan. PAS telah dikombinasikan dengan pewarna alcian
blue yang memulas sejumlah musin (protein terglikosilasi) menjadi warna biru
gelap. Sel goblet yang kaya akan karbohidrat dan musin terpulas menjadi
ungu kemerahan. Kelenjar yang kaya musin pada bagian bawah gambar
yang ditunjukkan disini, terpulas menjadi biru gelap.
Persiapan Reagen periodic acid-schiff (PAS) :
Asam Periodat 0,5% dan Schiff (100 ml)

Reagen Schiff :
1 gr Basic Fuchsin dilarutkan dalam 200 cc aquades panas, dinginkan
50OC. Tambah bubuk padat sodium metabisulfid 2 gr, kocok sampai rata.
Tambahkan HCl 10 cc, diamkan pada suhu kamar yang gelap 24 jam.
Setelah itu tambah norit 0,5 gr kocok sampai rata (merah jadi hitam), pada
pemakaian disaring hingga jernih.
Pewarnaan periodic acid-schiff (PAS) :
1. Deparafinisasi dan rehidrasi sediaan dalam larutan Xylol dan alkohol
bertingkat masing masing selama 3-5menit
2. Cuci dengan air mengalir selama 10menit
3. Dioksidasi dalam asam periodat 1% selama 5-10menit
4. Pencucian dengan aquades 3x, masing masing selama 5 menit
5. Pewarnaan digunakan larutan Reagent Schiff selama 15-30menit
6. Pencucian dengan air sulfit yang selalu fresh (dibuat baru) 3 x 3menit
7. Pencucian dengan aquades selama 5menit sebanyak 3x
8. Counterstain dengan hematoksilin, cek dengan mikroskop
9. Pencucian dengan air mengalir 10-60 menit
10. Pencucian dengan aquades selama 5menit sebanyak 2x

21
11. Dehidrasi dan penjernihan dalam larutan Xylol dan penutupan sediaan
dengan gelas penutup
Hasil Pewarnaan :

Glikogen bewarna merah muda atau magenta


Isi sel goblet diorgan pencernaan dan epitel pernapasan berwarna
merah magenta
Membrana basilis dan limbus penicillatus (brush border) ditubulus
ginjal bewarna positif atau merah muda

6. Pulasan untuk lipid

Pulasan lipid meliputi Oil Red O, sudan black dan Nite blue, dan memulas
selubung myelin neuron menjadi hitam kecoklatan.

7. Pulasan Verhoeff untuk Jaringan Elastik


Serat elastic bewarna hitam pekat
Nucleus bewarna abu-abu
Struktut lainnya bewarna merah muda
8. Pulasan wreight atau giemsa
Sitoplasma eritrosit bewarna merah muda
Nucleus limfosit bewarna ungu tua-biru dengan sitoplasma biru pucat
Sitoplasma monosit bewarna biru pucat dan nucleus bewarna biru sedang
Nucleus neutrophil bewarna biru tua
Nucleus eosinofil bewarna biru tuadan granula bewarna merah muda
terang

22
Nukleus basofil basofil bewarna biru tua atu ungu , sotoplasmanya
bewarna biru pucat dan granula bewarna ungu tua
Trombosit bewarna biru muda

9. Metode Cajal dan Del Rio Hortega (metode perak dan emas)
Serat bermielin dan tidak bermielin dan neurofibril bewarna biru hitam
Latar belakang umumnya hamper tidak bewarna
Astrosit bewarna hitam
Ber4gantung pada metode yang digunakan produk akhir dapat
bewarna hitam,coklat atau emas

PEMOTONGAN DAN TAMPILAN POTONGAN PADA MIKROSKOP CAHAYA

Jaringan memiliki ketebebalan yang cukup besar, oleh sebab itu organanisasi
sel didalam jaringan tidak dapat dengan mudah divisualisasikan dalam
mikroskop. Untuk melihat struktur secara mendetail, potongan-potongan haru
dibuat dan dipulas kemudiaan diamati dengan mikroskop. Tampilan potongan
tergantung dari bagaimana potongan-potongan tersebut dibuat.

POTONGAN LONGITUDINAL DAN TRANSVERSAL

Jaringan yang dipotong secara longitudinal tampak berbeda dengan jaringan


yang dipotong secara transversal. Potongan longitudinal melalui tubulus ginjal
menunjukan struktur linear panjang dengan lumen sentral. Sedangkan potongan
transveral atau potongan melintang melalui tubulus yang sama menunjukan
struktur bulat dengan lumen sentral. Potongan longitudinal melalui jaringan otot
dengan serabut otot yang panjang dan tipis, menunjukan pola lurik otot.berulang
diseluruh panjang serabut otot.
Potongan tranveral melalui jaringan otot menunjukkan bentuk poligonaldan
serabut dengan nucleus pada tepinya tidak ada pola lurik yang terlihat. Potongan

23
juga dapat dibuat oblik, yang pada kasus tersebut tampilannya menjadi diantara
potongan longitudinal dan potongan melintang

POTONGAN SERIAL

Potongan dibuat serial melalui jaringan. Tampilan sel dan jaringan akan
tergantung dari manakah potongan dibuat. Potongan yang dibuat melalui
pertengahan sel tampak berbeda melalui potongan yang dibuat melalui tepi.

PEMBESARAN

Setelah jaringan dipotong, dipulas dan direkatkan, potongan jaringan tersebut


diperiksa dibawah mikroskop cahaya menggunakan berbagai lensa yang
berbeda dengan pembesaran yang berbeda. Melihat kaca objek dengan mata
telanjang tidak menunjukan bagaimana sel teorganisasi didalam jaringan namun

24
memberikan kesan menyeluruh terhadap jaringan itu sendiri. Memeriksa
morfologi potongan secara keseluruhan pada kaca objek dengan mata telanjang
biasanya memberikan gambaran yang baik tentang asal jaringan apakah
potongan tersebut dibuat. Untuk memeriksa organisasi jaringan yang dipotong
secara lebih detail kaca objek biasanya dilihat secara bertahap dimulai dengan
lensa objektif berukuran rendah seperti x1,6, x5, atau x10 untuk mendapatkan
kesan menyeluruh dari susunan jaringan. Pada akhirnya digunakkan lensa
objektifberkekuatan tinggi x20, x40, x63 atau x100 untuk memeriksa sel secara
detail.
PENYEDIAAN JARINGAN UNTUK PENGAMATAN MIKROSKOPOIK
Prosedur yang paling umum digunakan dalam pengkajian jaringan yaitu
menggunakan sediaan sayatan yang telah mengalami proses agar dapat diamati
dengan mikroskop cahaya. Selain sediaan sayatan terdapat cara lain dalam
penyediaan nya, yaitu sediaan rentang dan sediaan gosok. Untuk pengamatan
dengan mikroskop cahaya biasa, obyek yang diamati harus dapat ditembus
cahaya. Karena jaringan atau organ terlalu tebal untuk dapat diamati dengan
mikroskop cahaya, jaringan harus disayat sangat tipis, di tentang atau digosok
sampai tipis. Untuk dapat mengamati jaringan hidup, beberapa jenis jaringan
dapat dibuat tipis tanpa disayat, misalnya mesenterium, ekor berudu katak dapat
langsung diamati dengan mikroskop dengan cara direntangkan diatas pada objek
sampai tipis dibawah mikroskop. Sediaan tersebut dinamakan atau disayat
karena sangat keras dan padat. Tulang dan giginya misalnya, tidak mungkin
disayat. Untuk pengamatan jaringan tulangsediaan yang sangat tipis diperoleh
secara khusus. Awalnya tulang dipotong dalam keping-krping tipis dengan
menggunakan gergaji halus yang biasa digunakan dalam kerajinan tangan.
Namun keping-krping yang diperoleh masih terlalu tebal untuk dapat ditembus
berkas cahaya. Untuk membuat lebih tipis, keping-krping tulang digosok dengan
gurindra dan diperhalus dengan hampelas. Sediaan yang diperoleh dengan cara
demikian dinamakan sediaan gosok. Tulang atau gigi dapat juga diperlakukan
seperti jaringan lunak lainnya, asal sebelumnya dikeluarkan kandungan garam
kapurnya dengan menggunakan asam.

FIKSASI

25
Jika diinginkan sediaan disimpan lama, maka jaringn lunak perlu diawetkan.
Pengawetan jaringan bertujuan agar struktur jaringan tisak berubah. Perubah
tersebut dicegah melalui:
Penghentian metabolisme dalam sel
Pencegahan degradasi jaringan enzim
Pembunuhan mikroorganisme patogen, seperti bakteri,jamur dan virus
Pengerasan jaringan sebagai akibat ikatan silang antarprotein.
Perubahan struktur dapat disebabkan oleh enzim yang ada dalam jaringan
sehingga terjadi proses autolis. Jaringan dapat juga berubah strukturnya oleh
pengaruh mikroba dan jamur. Untuk mencegah perubahan tersebut, jaringan segar
dari tubuh yang dipotong-potong berbentuk kubus kurang lebih 1cm segera
diawetkan baik secara kimiawi atau yang kurang umum secara fisikawi (dibekukan).
Dalam dikaasinsecra kimiawi, sebelumnya disayat tipis, potongan kecil jaringan
durendam dalam larutan fiksasi uang cocok selama beberapa saat untuk memberi
kesempatan larutan meresap dalam semua bagian. Selain dengan cara merendam,
jaringan dapat difiksasi in situ, dengan memasukan larutan fiksasi melaui penbulu
darah (infus). Cara pengawetan terakhir tersebut memberikan hasil yang baik.
Tujuan fiksasi selain mengawetkan jaringan, juga diperlukan mempertahankan
struktur jaringan agar tidak berubah oleh bahan fiksasinya sendiri. Salah satu larutan
fiksasi yang terbaik untuk pengamatan rutin dengan mikroskop cahaya, adalah
larutan formaldehid 49% (formalin adalah larutan formaldehid dengan kadar 37%)
yang insotonis dengan memumbuhkan larutan buffer (pH7). Penjelasan proses kimia
yang terlibat dalam fiksasi sanat rumit, dan selalu dimengerti. Formaldehid dan
glutaraldehid diketahui bereaksi dengan gugusan amin (-NH2) dari protein jaringan.
Larutan glutaraldehid bekerja lebih kuat, karena merupakan dialdehid yang mampu
menyambungsulangkan protein jaringan. Formaldehid tidak bereaksi dengan lipid
sehingga fiksasi untuk membran sel kurang memuaskan.
Dalam pengamatan sediaan yang disiapkan untuk mikroskop electron (ME) yang
mempunyai resolusi (daya urai) tinggi, penggunaan fiksasi perlu dilakukan lebih hati-
hati karena dapat berpengaruh pada struktur ultra. Maka untuk menghindari hal
tersebut, dilakukan prosedur fiksasi ganda, dengan menggunakan larutan
glutaraldehid dengan buffer, yang kemudian diikuti dengan fiksasi kedua

26
menggunakan larutan buffer osmium tetroksida. Cara ini sudah merupakan standar
bagi penyiapan sediaan ME. Dampak larutan osmium tetroksida selain pengawetan.

PENYAYATAN

Sebelum jaringan disayat tipis, pertu disiapkan proses untuk mempermudah


jalannya penyayatan tersebut. Potongan jaringan kecil yang telah difiksasi, hamper
tidak mungkin langsung disayat,karena jaringan masih sangat lembek. Penyayatn
dipermudah jika jaringan menjadi lebih keras. Jaringan yang keras selain lebih
mudah disayat tipis, juga mudah dipegang. Untuk maksud tersebut, jaringan
dipenetrasi oleh perafin cair. Dengan membekunya perafin dalam celah-celah
jaringan, potongan jaringan menjadi keras. Proses ini dinamakan embedding.
Embedding dengan perafin cair tidak mungkin dilakukan secara langsung
dengan merendam potongan jaringan. Jaringan yang telah terfiksasi masih penuh
mengandung air, sehingga akan mempersulit penetrasi parafin dalam jaringan.
Untuk mengatasi kesulitan tersebut, potongan jaringan terfiksasi dibilas dahulu yang
diikuti dengan pengeluaran air dari jaringan. Pengeluaran air atau dehidrasi
dilakukan secara brtahapagar tidak mengganggu struktur jaringan. Cara dehidrasi
yang umum dipakai dengan memasukkan selama beberapa saat potongan jaringan
dalam rangkaian larutan alcohol (etanol) yang semakin pekat kndungannya sampai
akhirnya dimasukkan dalam alcohol absolut (100%). Denagan cara ini, secara
bertahap air dalam jaringan ditarik oleh larutan alcohol. Dehidrasi ini menghasilkan
jaringan yang tidak mengandung air sama sekali. Namun potongan jaringan ini juga
belum siap dipenetrasi oleh parifin. Masih terdapat satu tahap lagi untuk penyiapan
embedding. Untuk mempermudah embedding dengan parifin, celah-celah jaringan
yang tadinya berisi air perlu dibersihkan dari sisa-sisa alcohol dengan
menggunakkan pelarut parafin. Tahap ini dinamakan clearing dengan
menggunakkan xlolatau tuluol. Berkat clearing, potongsn jaringan tampak jernih
(clear). Jdi dalam persiapan untuk embedding dilakukan dehidrasi dengan alcohol
yang diikuti dengan clearing dengan xylol.
Embedding dilakukan dalam oven dengan suhu 58-60c dengan cara
merendam potongan jaringan dalam parafin cair. Dalam suhu tersebut, xylol yang
masih mengisi celah jaringan akan menguap dan secara perlahan isi celah diganti
dengan parafin cair. Jaringan yang menggunakan bahan plastic resin sebagai bahan

27
embedding didehidrasi juga dengan etanol dengan menggunakkan pelarut plastic
sebagai pganti xylol. Penggunaan resin dapat mencegah pengkerutan jaringan yang
disebabkan oleh parafin. Untuk mejamin infiltrasi parafin yang sempurna, jaringan
dipindahkan dalam cairan parifin baru. Apabila parafin telah cukup menginfiltrasi
jaringan, disiapkan cetakan untuk membuat blok parafin yang membungkus jaringan
yang akan disayat. Pembuatan blok parafin-jaringan dilakukan diluar oven dengan
menuangkan parafin cair dalam cetakkan berbentuk kubus dengan mengupayakan
jaringan terdapat didalamnya. Setelah suhunya menurun, parafin akan membeku
dan terbentuklah blok jaringan. Blok parafin yang mengandung jaringan sudah siap
untuk disayat tipis.

PEWRNAAN

Pada dasarnya jaringan tubuh hewan bening tidak menunjukkan kontras antara
bagian-bagiannya. Agar sayatan jaringan dapat dipilajari strukturnya dengan
mikroskop cahaya biasa, perlu diberikan kontras melalui pewarnaan. Metode
oewarnaan jaringan bertujuan selain agar tampak nyata, juga agar bagian-bagian
jaringan dapat dibedakan. Bahan pewarna secara selektif akan mewarnai bagian-
bagian jaringan. Sebagian bagian bahan pewarna bersifat sebagai senyawa asam
atau basa dan mempunyai kecendrungan mengikat jaringan membentuk garan.
Komponen jaringan yang bewarna lebih oleh bahan pewarna basa disebut basofilik
(Bahasa yunani:senang basa0, dan yang terwarna oleh bahan pewarna asam
disebut asidofilik.
Contoh bahan pewarna basa adalah: toluidine blue dan methylene blue.
Hematoxylin yang umum dipakai secara rutin termasuk pewarna basa akan
mewarnai komponen jaringan basofilik (mengandung bahan asam pewarna asam
disebut asidofilik contoh bahan pewarna asam: orange G, eosin, acid fuchsin,
mewarnai komponen asidofilik seperti mitochondria, butir-butir sekresi dan kolagen.
Diantara bahan pewarna yang sering dipakai adalah kombinasi antara hematoxylin
dan eosin (pewarnaan HE). Bahan pewarnaan HE akan mewarnai inti sel dan
struktur asidokfilik lain (seperti bagian sitoplasma yang banyak RNA,dan matriks
kartilago) dengan warna biru. Sebaliknya eosin akan mewarnai sitoplasma dan
kolagen merah muda.

28
Banyak pewarna lain, seperti trichrome (misalnya: metode mallorydan
masson) digunakan dalam prosedur histologi yang berbeda. Bahan pewarna
tersebut khisus untuk menunjukan inti dan sitoplasma secara bagus, dan membantu
pembedaan serabut kolagen dengan serabut otot.
Film parafin dengan sayatan jaringan yang telah diletakkan secara rapih
tanpa melipat, siap mengalami proses pewarnaan. Proses mewarnai memerlikan
penyiapan secara cermat , dengan mengingat bahwa zat pewarna merupakan
bahan yang larut dalam air.sayatan jaringan masih penuh dengan parafin yang tidak
dapat menerima larutan pewarna. Pada dasarnya peroses penyiapan merupakan
peroses agar jaringan kembali seperti sebuah disayat. Sehingga tahap-tahap
pemrosesan kebalikan dari tahap untuk penyiapan penyayatan. Secara singkat
tahap penyiapan pewarnaan dilakukan untuk menghilangkan parafin dengan xylol,
kemudian membilas xylol dengan alcohol dimulai dengan kosentrasi tinggi (100%)
dan secara bertahap semakin rendah dan terakhir hanya air. Barulah sediaan diatas
kaca objek dengan diwarnai. Sediaan yang telah selesai diwarnai dikeringkan dan
ditutup dengan kaca penutup.

29
PROPSEDUR PEWARNAAN LAIN

Disamping sebagai unggulai pewarnaan HE, terdapat kelemahan prosedur


pewarnaan HE yang tidak secara edakuat mengungkap komponen structural pada
sayatan jaringan, termasuk misalnya bahan elastic, serabut retikuler,membrane
basalis, dan lipid. Apabila dibutuhkan pengamatan komponen structural tersebut,
harus ditempuh prosedur pewarnaaan lain yang umumnyan sangat selektif.
Prosedur lain tersebut mencakup pewarnaan orcein dan resorcin-fuchsin
untuk bahan elastic dan pemaikaian impregnasi perak untuk serabut retikuler dan
bahan membrane basalis. Walaupun dasar kimiawi bahan tersebut tidak dimengerti,
prosedur tersebut berjalan dengan baik. Memahami komponen yang diungkapkan
oleh prosedur pewarnaan, lebih penting daripada memahami secara tepat cara
prosedur tersebut.
Prosedur kimiawi khusus dapat memberikan berbagai informasi tentang
fungsi sel dan komponen ekstraseluler jaringan . untuk mengungkapkan fungsi
khusus jaringan dilsku7ksn proses berdasarkan dasar prosedur histokimiawi dan
sitokimiawi. Berbag ai prosedur tersebut msing-m,asing didasarkan: pada ikatan
spesifik bashan pewarna yang digunakan , penggunaan bahan pewarna yang
dilabel bahan perpendar (fluoresen), ikatan antibodi dengan komponen jaringan
tertentu, aktivitas enzim yang ada dalam komponen sel, penggunaan aktivitas unsur
yang disisipkan kedalam jaringan sebelum difiksasi (autoradiography) dan
sebagainya.

30
31