Anda di halaman 1dari 10

BAB II.

TINJAUAN PUSTAKA

Protein berasal dari kata protos atau proteus yang berarti pertama atau utama. Hal ini
dikarenakan protein merupakan komponen penting atau komponen utama bagi sel hewan atau
manusia. Protein merupakan salah satu zat makanan yang penting bagi tubuh dan memiliki ba
nyak fungsi. Protein berfungsi sebagai bahanbakar tubuh dan juga zat pembangun tubuh. Sela
in itu protein dapat berguna sebagai bahan bakar. Protein dapat berupa enzim yang berfungsi
sebagai biokatalisator. Selain itu protein terdapat dalam bentuk hemoglobin yang berfungsi m
engangkut darah dari paru-paru ke seluruh tubuh dan juga dalam bentuk antigen yang berpera
n melawan virus atau bakteri penyebab penyakit. (Lehninger, 1994)

Protein tersusun dari peptida-peptida sehingga membentuk suatu polimer yang diseb
ut polipeptida. Setiap monomerya tersusun atas suatu asam amino. Asam amino adalah molek
ul organik yang memiliki gugus karboksil dan gugus amino yang mana pada bagian pusat as
am amino terdapat suatu atom karbon asimetrik (Gambar 1). Pada keempat pasangannya yan
g berbeda itu adalah gugus amino, gugus karboksil, atom hidrogen, dan berbagai gugus yang
disimbolkan dengan huruf K Gugus R disebut juga sebagai Rantai samping yang berbeda den
gan gugus amino(Davis I994)

Gambar 1. Struktur umum asam amino (Lehninger et al., 2004).

Asam amino dalam suatu protein memiliki bentuk L, terionisir dalam larutan, dan
memiliki bentuk C asimetris kecuali asam amino jenis glisin Asam amino standarmemiliki
jumlah sebanyak 20 macam. Dari 20 macam asam amino tersebut terbentuklah suatu rantai
polipeptida. Rantai asam amino akan dilipat menjadi bentuk 3 dimensidan menjadi bentuk
protein spesifik yang diperlukan oleh berbagai aktivitas metabolisme atau menjadi komponen
suatu sel (Lehningerer al., 2004).
Protein tersusun atas 20 macam asam amino yang memiliki karakteristik yang
bebeda-beda sehingga dapat dikelompokkan berdasarkan sifat dan ciri rantai sampingnya
(gugusR). Pengelompokan tersebut antara lain asam amino bersifat polar (serin, treonin,
sistein, asparagin, dan glutamat); non-polar (glisin,alanin, prolin, valin, leusin, isoleusin, dan
metionin); gugus aromatik (fenilalanin, tirosin,triptofan)', bermuatan positif (lisin, histidin,
arginin); dan bermuatan negatif (aspanat danglutamat). Pengelompokan tersebut didasarkan
pada polaritas, ukuran, dan bentuk dari suatu asam amino (Lehninger et al., 2004).
Protein yang tersusun dari rantai asam amino akan memiliki berbagai macam struktur
yang khas pada masing-masing protein. Karena protein disusun oleh asam amino yang
berbeda secara kimiawinya, maka suatu protein akan terangkai melalui ikatanpeptida dan
bahkan terkadang dihubungkan oleh ikatan sulfide. Selanjutnya protein bisa mengalami
pelipatan-pelipatan membentuk struktur yang bennacam-macam. Adapun struktur protein
meliputi struktur primer, struktur sekunder, struktur tersier, dan strukturkuartener
(Harvey, 2000).
Protein dapat dianalisis dengan beberapa cara,salah satunya yaitu dengan cara
elektroforesis dan cara kjehdal. Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan yang
memisahkan analit berdasarkan kemampuannya bergerak dalam medium konduksi yang
biasanya berupa larutan buffer dan akan memberikan respons setelah diberikan medan listrik.
Jika suatu zat bermuatan diberi potensial, maka zat tersebut akan berpindah sepanjang
medium yang kontinu ke arah katode atau anode sesuai dengan muatan yang
dibawanyaElektroforesis SDS-PAGE termasuk ke dalam kelompok elektroforesis zonal
wilayah, yaitu kelompok elektroforesis yang dibedakan berdasarkan medium
penyangganya(Harvey, 2000).
Elektroforesis SDS-PAGE menggunakan gel buatan sebagai medium penyangga.Gel
yang digunakan terbentukdari polimerisasi akliramida dengan N,N'- metilena bisa krilamida s
ehingga terbentuk ikatan silang karena polimerisasi akrilamida sendiri hanyamenghasilkan ik
atan linear yang tidak membentuk gel kaku (Girindra, 1993). Sodium Dodecyl Sulphate Polya
crilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) adalah suatu teknikpemisahan molekul-molekul
protein berdasarkan perbedaan berat masing masing.Prinsipdari SDS PAGE adalah dengan m
emanfaatkan perbedaan kemampuan migrasi masing-masing molekul protein. Kemampuan m
igrasi tiap molekul akan berbeda disebabkan perbedaan berat molekul protein (Davis I994).

Terdapat perbedaan metode elektroforesis dengan metode SDS-PAGE Elektroforesis


menggunakan gel agarosa sebagai medium. SDS-PAGE menggunakan gel berupa gel poliakri
lamid. Sifat dari gel agarosa non-toxic sementara pada gel poliakrilamid adalah neuro toxic at
au bersifat racun syaraf. Gel agarosa memiliki pori yang lebih besar daripada gel poliakrilam
id. Selain gel, komponen yang digunakan dalam metode SDS-PAGE dan elektroforesis juga b
erbeda. SDS-PAGE merupakan teknik purifikasi skala kecil yang menghasilkan pemisahan s
uatu protein berdasarkan berat molekulnya dalam band (pita) spesifik yang tampak pada gel p
olyacrilamide. Teknik purifikasi dalam skala besar kita dapatkan dengan menggunakan chro
marography. Gel acrylamidedalamSDS-PAGE diletakkan diantara dua plat kaca. Ada dua ma
cam gel yang digunakan, yaitu main atau separating gel dan stacking gel. Main gel merupaka
n gel yarg komposisiya paling banyak dan terletak dibagian bawah alat. Main gel berfungsi u
ntuk memisahkan protein berdasarkan berat molekulnya. Stacking gel terletak pada bagian at
as, digunakan untuk mencetak sumuran (sekat pemisah untuk penempatan sempel). SDS mer
upakan sejenis detergen yang berfungsi mendenaturasikan protein, memberikan muatan negat
if pada protein, dan molekul hidrofobik (tidak suka air) (Seidman&Moore 2000).

Metode SDS PAGE dimanfaatkan untuk mendenaturasi protein menjadi bentuk yang
lebih sederhana, mengubah molekul menjadi bermuatan negatif.Metode SDS-PAGE menggu
nakan gel poliakrilamid. Gel poliakrilamid terbentuk dari hasil polimerisasi monomer akrilam
id dan bisakrilamid. Polimerisasi tersebut diinisiasi oleh amoniun persulsat(APS) yang dapat
membentuk radikal bebas (Martin 1996).
Sistem buffer terdiri dari continous system dan discontinuous system. Continous
system menggunakan satu jenis gel yaitu menggunakan resolving gel, sementara discontinous
system menggunakan dua jenis gel berupa resolving gel dan stacking gel. Stackinggel
berfungsi untuk menahan sementara agar sampel bermigrasi pada waktu yang
bersama.Resolving gel berfungsi untuk memisahkan molekul-molekul yang ada
berdasarkanberat molekulnya. Perwarnaan atau staining pada gel juga merupakan bagian dari
teknik SDS-PAGE. Pewarnaan gel pada teknik SDS-PAGE terdiri dari commasie blue
staining dan silver salt staining. Commasie blue staining adalah pewarna tekstil
trifenilmetana, dan lebih sering digunakan di dalam teknik SDS PAGE.Commasie blue
staining mempunyai beberapa kelebihan yaitu harga yang relatif murah, mengikat protein
secara spesifik, serta bekerja cepat.Silver salt staining memiliki kelebihan yaitu hasilnya
lebihakurat jika dibandingkan commasie blue staining. Kekurangan silver salt staining
yaituharga yang lebih mahal dan membutuhkan waktu yang lebih lama( Boyer 1993).

Metode kjehdal adalah salah satu metode yang dapat digunakan untuk menentukan
kadar nitrogen dan protein dalam suatu bahan dengan cara yang sederhana. Prinsip dari
metode ini adalah penentuan jumlah nitrogen yang dikandung dalam suatu bahan dengan cara
mendegradasi protein bahan organic dengan menggunakan asam sulfat pekat untuk
menghasilkan nitrogen sebaagai ammonia. Terdapat 3 tahapan pada metode ini, yaitu:

1. Proses destruksi
Pada tahapan ini yang terjadi adalah penguraian bahan orgaanik menjadi unsur-unsurnya
dengan mengggunnakan bantuann larutan H2SO4 pekat dan pemanasan. Proses destruksi
dilakukan dalam lemari asam agar unsur S yang dihasilkan tidak menyebar diruang terbuka
dalam bentuk SO2, kaena senyawa ini termasuk senyawa yang mmbahayakan. Reaksi yang
terjadi adalah:
Bahan organic + H2SO4 panas CO2 + SO2 + (NH4)2SO4 + H2O
Proses destruksi diakukan hingga larutan yang pada awalproses berwarna hitam berubah
menjadi jernih. Setelah proses destruksi selesai , sekitar 4-8 jam, larutan yang tlah
didestrusksi didinginkan agar dapat direaksikan pada tahapan berikutnya.

2. Proses destilasi
Pada tahapan ini, larutan yang telah didinginkan hingga mencapai suhu ruag, ditambahkan
aquadest secukuonya. Setelah itu larutan ditambahkan sedikit bubuk Zn gar dpat mencegah
terjadinya percikan api. Setelah itu larutan kembli dipanaskan,sembari ditambahkan NaOH
secukupnya, hingga NaOH habis bereaksi, dan eluruh ammonia telah tercampur dengan
larutan asam boraks. Reaksi yang terjadi adalah:
(NH4)2SO4 + 2 NaOH 2NH4OH + Na2SO4
Larutan asam boraks dipilih pada reaksi ini karena dapat menangkap NH3 yang menguap
secaara efektif. Pada larutan ini ditambahkan Methyl Orange (MO) sebagai indicator pada
tahap reaksi berikutnya. Proses yang tejadi pada saat destilassi adalah:
2NH4OH 2NH3 + 2H2O
4NH3 + 2H3BO3 2(NH4)2BO3 + H2
Setelah seluruh ammonia ditangkap oleh asam boraks maka prosess destilasi dihentikan dan
dilanjutkan pada proses titrasi.

3. Tahap Titrasi
Titrasi merupakan tahap terakhir dari seluruh metode Kjehdahl pada penentuan kadar protein
dalam bahan pangan yang dianalisis. Dengan menggunakan titrasndardiasassti, dapat
diketahui banyaknya asam boraks yang breaksi dengan ammonia. Untuk titrasi, destilat
dititrasi dengan HCl yang telah distandardisasi sebelumnya. Pada tahapan ini digunakan
indicator MO dan titrasi dihentikan bila warna larutan telah berubah menjadi merah muda.
Reaksi yang terjadi:
(NH4)3BO3 + 3HCl 3NH4Cl + H3BO3
(Merril & Watt, 1973)
BAB III. METODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Alat dan Bahan


3.1.1 Alat
- Beaker gelas
- Pipet mohr
- Pipet tets
- Ball pipet
- Erlenmeyer
- Labu kjeldahl
- Buret
- Statif
- Set alat destilasi
3.1.2 Bahan
- Sampel unknown (KH1)
- Akuades
- Asam borat
- Larutan NaOH
- Larutan HCl 0,1 N
- Metil biru
3.2 Skema Kerja
3.2.1 Penentuan Berat Molekul Endo- -1,4-D-Xilanase
a. Preparasi Gel SDS-PAGE

Gel SDS-PAGE

- dicuci perangkat elektroforesis dan dibilas dengan akuades.


- dibersihkan lempengan kaca sandwich dengan etanol dan
dikeringkan.
- dirangkai seluruh perangkat pembuatan gel untuk menentukan
volume ketebalan gel yang akan dibuat.
- diisi lempengan kaca pencetak gel dengan akuades agar tidak
terjadi kebocoran.
- diserap air dengan kertas penyerap (gel bawah adalah SDS-
PAGE 12% dan gel atas menggunakan SDS-PAGE 5%)
- ditambahkan akuades diatas gel bawah kemudian dibuang jika
gel bawah sudah memadat.
- diinjeksikan formulasi gel atas ke dalam pencetak gel dan segera
dipasangkan sisir cetakan (comb).
- dilepas sisir jika gel telah berpolimerisasi atau memadat.
- dibilas dengan akuades sumur yang terbentuk untuk
menyingkirkan akrilamida yang tidak berpolimerisasi.

Hasil
b. Preparasi Gel SDS-PAGE

SDS-PAGE

- ditambahkan 40 L sampel enzim yang telah ditambahkan buffer


sampel.
- dicampur dengan SDS-PAGE.
- dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih untuk denaturasi.

Hasil

c. Running SDS-PAGE
Gel SDS-PAGE
- dirangkai sel elektroforesis sesuai petunjuk dan dilakukan
pemeriksaan terhadap kebocoran pada kompartemen.
- diisi kompartemen dengan larutan buffer elektroda hingga
memenuhi kompartemen upper dan lower.
- diinjeksikan sampel protein ke dalam masing-masing sumur
yang terbentuk pada gel atas.
- ditutup kompartemen.
- dihubungkan masing-masing buffer atas dan buffer bawah
dengan kutub negative (katoda) dan positif (anoda) pada power
supply.
- digunakan voltase 40-100 V dengan arus 5,0 A.
- diakhiri elektroforesis apabila warna biru tracking dye (BPB)

Hasil telah mencapai sekitar 0,5 cm dari bagian bawah gel bawah.
d. Staining dan Destaining SDS-PAGE
Gel SDS-PAGE

- diambil gel dari lempeng kaca pencetak gel.


- direndam dalam wadah berisi larutan pewarna.
- digojok wadah perlahan-lahan pada suhu ruang hingga warna
larutan pewarna dapat diikat oleh protein.
- dicuci protein yang tidak terikat pada larutan pewarna dengan
larutan pelepas warna hingga pita-pita protein nampak jelas
atau background menjadi berkurang selama beberapa kali
dengan mengganti larutan pelepas warna.
- dilakukan penggoyangan untuk mempercepat pelepasan
larutan pewarna.

Hasil
3.2.2 Kadar N-total (Metode Kjeldahl)
0,3 gram sampel kering
dimasukkan dalam labu Kjeldahl.
ditambahkan secara hati-hati 5 mL asam sulfat pekat (H2SO4) menggunakan
pipet yang dilengkapi karet penghisap.
ditambahkan 10 gram campuran CuSO4: Na2SO4 (1:8).
dilakukan destruksi dalam lemari asam hingga cairan berwarna biru atau
hijau jernih.
dinginkan labu kjeldahl dengan air (suhu <250C).
larutan yang telah jernih diencerkan dengan sedikit aquades.
ditambahkan NaOH 40% sampai terbentuk larutan coklat.
sampel didestilasi dengan rangkaian alat ke destilasi kjeldahl.
destilat ditangkap dengan asam borat yang telah ditambahkan 2 tetes
indikator campuran metil merah dan metil biru.
destilasi dihentikan hingga destilat berubah warna.
distilat yang diperoleh dititrasi dengan HCl 0,1 N yang telah distandarisasi.
dibuat blangko dengan cara yang sama tanpa menggunakan sampel.

Hasil
DAFTAR PUSTAKA

Lehninger,A.L.2004.Dasar-dasar Biokimia.Jakarta:Erlangga
Merril, A.L and Watt BK, 1973, Energy value of food: basis and deriration, Agriculture Hand
book, Washington.
Harvey, D.. (2000). Modern Analytical Chemistry. McGraw-. Hill : New York.

Boyer , R. F.1993. Modern experimental biochemistry. The Benjamin Clummings.Publishing


Company: California

Girindra, A.1993. Biokimia I. Jakarta: Gramedia

Seidman, L.A. & C.J. Moore. 2000. Basic laboratory for biotechnology: Textbook
andlaboratory reference. Prentice Hall, Inc. : New Jersey

Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994.Basic methods: Molecular biology. 2nd ed.Appleton
& Lange : Norwola

Martin, R. 1996.Gel electroforesis: Nucleid acids.Bros Scientific Publishers Ltd. : Oxford