Analisis protein dan Immunoblotting

Kultur schizochytia dipindahkan ke 50 ml tabung berbentuk kerucut dan disentrifugasi pada 3000 g
atau 4500 g selama 15 menit. Supernatan yang dihasilkan dari sentrifugasi ini dalam beberapa kasus
selanjutnya disentrifugasi pada 100.000 g selama 1 jam. CFS atau sampel protein lainnya dipisahkan
oleh elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE) pada gel bis-tris NuPAGEH
NovexH 12% (Invitrogen, Carlsbad, CA) di bawah kondisi reduksi dengan asam propanesulfonat 3-
(N-morfolino) - sodium dodecylsulfate (MOPS-SDS) buffer yang mengalirkan, kecuali jika dinyatakan
lain dalam teks. Protein kemudian diwarnai hanya dengan pewarna biru yang aman (Invitrogen,
Carlsbad, CA, AS) atau dipindahkan ke membran fluoride polivinogen dan diperiksa untuk mengetahui
adanya protein HA dengan antiserum anti-PR8 dari kelinci, nomor katalog 11684-RP01 (Sino
Biological Inc., Beijing, China), diikuti oleh antibodi sekunder anti-kelinci IgG (Fc) yang digabungkan
ke alkaline phosphatase (Promega Corporation, Madison, WI). Selaput kemudian diolah dengan larutan
tetrazolium 5-bromo-4-kloro-3-indoyl- fosfat / nitroblue sesuai instruksi manufaktor (KPL, Gaitherst
urg, MD). Urutan protein dikonfirmasi oleh spektrometri massa (perangkap ion linier Finnigan LTQ)
sesuai dengan protokol yang dikembangkan oleh Laboratorium Spektrometri Massa untuk Urutan
Protein di Institut Lerner Research (Cleveland Clinic, Ohio) dan degradasi Edman menggunakan 494
Procise Protein Sequencer / 140 C Analyzer (Applied Biosystems, Inc., Carlsbad, CA, USA) sesuai
dengan protokol yang dikembangkan oleh negara Iowa fasilitas unversitas protein.

Analisis Glikolisasi

Fraksi CFS dari kultur Schizochytrium yang mengandung PR8 HA dijalankan pada gel bis-tris
NuPAGEH NovexH 12% (Invitrogen, Carlsbad, CA, AS) di bawah kondisi non-pereduksi dengan
penyangga MOPS dan gel yang dihasilkan diwarnai dengan pewarna biru yang aman. Protein HA
dikeluarkan dari gel dan diolah secara bergantian dengan larutan destain (DS) yang terdiri dari
ammonium bikarbonat 40 mM, dan asetonitril 100%, sampai warnanya berubah menjadi jelas. Gel yang
rusak itu Dibakar kembali dalam 10 mM dithiothreitol (DTT) dalam 40 mM amonium bikarbonat pada
55uC selama 1 jam. Solusi DTT ditukar dengan 55 mM iodoacetamide dan diinkubasi dalam gelap
selama 45 menit. Inkubasi diikuti oleh dua pencucian dengan DS sebelum didehidrasi dalam asetonitril
dan mengalami degilosilasi dalam gel. Bagian gel dehidrasi dihidrasi pada suhu 4uC dengan 50 mM
sodium fosfat, pH 7,5 mengandung PNGase F (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) dan
kemudian diinkubasi pada suhu 37uC semalam untuk melepaskan N-glycans . Glycans bebas
diekstraksi dari gel secara seri dengan asetonitril 20% dalam asam formiat 5%, asetonitril 50% dalam
asam format 5%, dan akhirnya 80% asetonitril dalam asam format 5%. Larutan sampel dikeringkan,
digabungkan untuk dilalui melalui kartrid C-10 (Resprep, Bellefonte, PA, AS), dielusi asam asetat 5%
untuk menghilangkan kontaminan, dan dikeringkan lagi dengan liofilisasi. Relilised N-linked
oligosaccharides dimetetilasi dan dianalisis dengan spektrometri massa ionisasi nanospray (NSI-MSn)
menggunakan spektrometer massa LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). Secara
khusus, gliserol permetilasi dilarutkan dalam 1 mM NaOH dalam metanol 50% dan dimasukkan
langsung ke instrumen pada laju alir 0,5 ml / min konstan. Spektrum MS transformasi Fourier penuh
dikumpulkan pada resolusi 30.000. Suhu kapiler Ditetapkan pada 210uC Dan analisis MS dilakukan
pada mode ion positif. Untuk pemetaan ion total (Analisis MS / MS otomatis), kisaran m / z 800 sampai
2000 dipindai dengan menggunakan mode MS perangkap ion dalam 2,8 unit unit global yang tumpang
tindih dengan jendela sebelumnya dengan 2 unit massa.

Purifikasi Protein

Sel dari Schizochytrium yang mengekspresikan HA dibudidayakan di bawah kondisi fermentasi yang
dijelaskan di atas dan disentrifugasi selama 15 menit pada 3000 g. CFS kemudian diencerkan 1: 1 dalam
larutan yang mengandung 20 mM natrium fosfat pH 7,0, gliserol 5%, EDTA 1 mM, dan 0,2% TritonTM
X-100. Campuran disaring (0,45 mm ukuran pori) dan dipindahkan ke kolom putaran anion-exchange
(Thermo Scientific Pierce Biotech, Fisher Scientific, Rockford, IL USA) yang sebelumnya
diseimbangkan dengan 20 mM sodium fosfat pH 7.0, gliserol 5%, dan 0,1% TritonTM X-100. Sampel
yang dimuat disentrifugasi sesuai dengan petunjuk pabriknya. Aliran aliran yang dihasilkan dipekatkan
dan buffer ditukar dengan larutan garam buffer fosfat (PBS), pH7.4 dengan ultrafiltrasi menggunakan
perangkat sentrifugal Amicon (Millipore, Billerica, MA).

Imunisasi dan Model Hewan

Tikus betina betina / c (6-8 minggu) dibeli dari Charles River Laboratories (Wilmington, MA, AS).
Antigen HA yang dimurnikan disimpan di suhu 265uC sebelum diformulasikan untuk injeksi.
Formulasi vaksin dan formulasi kontrol pembawa disiapkan segera sebelum injeksi sehingga masing-
masing dosis (15, 5, 1,7 dan 0 mg HA) dapat diberikan pada jam I.m. Dalam 100 ml volume secara
bilateral (50 ml / quadricep). Setiap dosis diencerkan dalam PBS ke konsentrasi yang sesuai, atau untuk
kelompok adjuvant yang sesuai, dengan konsentrasi 2 kali lipat lebih tinggi untuk emulsifikasi dengan
AddavaxTM (Invivogen, San Diego, CA, AS) dengan rasio 1: 1 (v: v) menurut Instruksi pabrikan.
Placebo (PBS) dan bahan pembantu juga dicampur dengan perbandingan 1: 1. Desain penelitian dan
kelompok eksperimen dirinci di bagian hasil. Tepatnya, kelompok 4 dan 11 diimunisasi dengan
campuran rHA-Addavax. Kelompok 1-3 diberi imunisasi dosis tunggal pada massa turun. Kelompok
7-9 diberi dosis awal yang identik yang kemudian dilanjutkan dengan dosis kedua 3 minggu kemudian.
Kelompok 11 didirikan untuk menguji tikus yang diberi semua kombinasi di atas. Kelompok 5, 6, dan
10 diberi suntikan plasebo sesuai volume satu dosis PBS tunggal, satu dosis PBS-Addavax tunggal,
atau dua dosis PBS. Semua tikus diberi pengujian mematikan 21 hari setelah vaksinasi terakhir. Tikus
diberi anestesi i.p. Dengan ketamin (100 mg / Kg) / xilazin (10 mg / kg) dan diinokulasi secara intranas
dengan 3000 TCID50 (5 MLD50) virus PR8 menular. Tikus kemudian ditimbang dan dimonitor setiap
hari untuk tanda-tanda penyakit. Tikus ditiadakan secara alami dengan CO2 jika berat badan mereka
turun sampai 75% dari berat dasar. Semua penelitian dilakukan berdasarkan undang-undang dan
pedoman yang berlaku dan disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan IIT Institut
Research .

Uji Serologis

Sampel serum diobati dengan enzim penghancur reseptor (RDE) (Denka Seiken, Tokyo, Jepang)
semalam di 37uC dan diencerkan 1:10 dengan garam buffer fosfat (PBS). Sampel yang diobati dengan
RDE diencerkan secara nominal menjadi delapan pengencer dua kali lipat (1:10 sampai 1: 20,480) di
PBS dan diuji dengan alat penghambatan hemaglutinasi (HI) dengan sel darah merah ayam 0,5%.
Timbal balik pengenceran serum atau plasma tertinggi yang benar-benar menghambat hemaglutinasi
ditentukan sebagai titer HI. Untuk tujuan komputasi, titer dari, 1: 10 diberi nilai 1: 5. Nilai titer log2
berubah sebelum melakukan analisis statistik dan dinyatakan sebagai titer mean geometrik (GMT).

Bronchoalveolar Lavage Titera Virus

Pada hari ke 3 dan 7 setelah inokulasi dengan virus PR8 influenza, 1-3 tikus pada masing-masing
kelompok eksperimen dan kelompok kontrol dikorbankan. Cairan bronchoalveolar lavage (BAL)
dikumpulkan dalam dua pencucian 1 ml dengan PBS. Sampel BAL disimpan pada suhu 265uC sampai
penentuan titer virus hidup dengan uji TCID50 pada sel Madin-Darby Canine Kidney (MDCK). Sel
MDCK diinokulasi dengan pengenceran serial cairan BAL dan diinkubasi pada 37uC selama 48 jam.
Uji hemaglutinasi dilakukan dan titer virus (log10 TCID50 / ml) dihitung dengan metode Reed dan
Muench. Analisis statistik Perbandingan kelangsungan hidup antar kelompok tikus dilakukan dengan
uji log rank pada data survival Kaplan-Meier. Perbandingan data antibodi dan virus titer dilakukan
dengan menggunakan analisis varians untuk beberapa perbandingan dengan Systat (Systat, Chicago,
IL). Kesalahan Bar mewakili standar deviasi, dan signifikansi statistik didefinisikan sebagai P, 0,05.