Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Facultad de Ciencias Biolgicas

E.A.P de Gentica y Biotecnologa

Laboratorio de Microbiologa General

Practica N 3: Coloracin Gram y Ziehl Nielsen

Profesora: Susana Gutirrez Moreno

Alumno: Cdigo
Electo Oshiyama Jorge Alejandro 16100100

Ciudad Universitaria, 2017 II

I. Introduccin:

El estudio de los microorganismos requiere de su observacin en el

microscopio, de esta forma se pueden describir sus caractersticas
morfolgicas, de comportamiento, etc. Las diferentes caractersticas que
se pueden observar en los microrganismos depende del tipo y poder
resolutivo del microscopio que se use; el tipo de microscopio influye en la
calidad y forma con la que se observa al microorganismo y su poder
resolutivo mejor conocido como apertura numrica permitir diferenciar
las partes del microorganismo. Sin embargo las estructuras de la
mayora de los microorganismos son incoloras y con casi el mismo ndice
de refraccin entre ellas; por lo que diferenciarlos es una tarea
complicada solamente usando el microscopio. Por tal razn se usa
mtodos de tincin con el que se aprovecha las caractersticas qumicas
de los colorantes y microorganismos para poder diferenciar tanto sus
estructuras, como diferenciar los organismos entre ellos.

Tincin:
Es el proceso por el cual las molculas de un colorante se adsorben
a una superficie mediante interacciones qumicas con las
estructuras que esta posee; estas molculas absorben diferentes
longitudes de onda, se excitan y emiten diferentes colores dentro
del rango del espectro visible.

Colorantes:
Un colorante se define principalmente como aquella sustancia que
es capaz de dar color a otros cuerpos. Por su origen pueden
naturales o sintticos.

Qumicamente el colorante se compone de un cromforo y un

auxcromo.

El cromforo es aquel grupo no saturado que posee como

caracterstica la de absorber cierta longitud de onda en el rango de
UV o visible; qumicamente el cromforo contiene grupos que al
recibir luz se excitan y emiten longitudes de onda que dan como
 resultado que se perciban como colores (si estn dentro del rango
visible). La capacidad de excitarse al recibir luz es debido a que
posee grupos funcionales que pueden ser dobles enlaces,
aromticos, compuestos de coordinacin, etc. Entre los grupos
tenemos carbonilos, imino, diazo y nitro.

El auxcromo son son grupos funcionales o radicales que

constituyen una molcula y poseen carga parcial positiva; tienen
la funcin de intensificar la formacin de color mediante la accin
de grupos de tomos no saturados; su funcin es desplazar a los
cromforos hacia longitudes de ondas largas para aumentar la
intensidad.
Los siguientes grupos funcionales son considerados auxcromo:
grupo metilo, halgenos, hidroxi, alcoxi y amino.

El cromforo y el auxcromo conforman el cromgeno que es la

molcula que tiene la capacidad de colorear un cuerpo.

Muchos de los colorantes usados en microbiologa son de carga

positiva, por eso reciben como nombre colorantes bsicos por
ejemplo el azul de metileno, cristal violeta y la safranina. Estos
colorantes se unen fuertemente con los componentes celulares
acidas (carga negativa) como el ADN o polisacridos cidos.
De tal forma estos colorantes son capaces de unirse a las
superficies celulares y teirlas.

Tipos de tincin:
De acuerdo al objetivo que se busca al estudiar los
microorganismos se pueden emplear distintos tipos de tincin:

a) Tincin simple: La muestra se tie del mismo color usando

un solo colorante (azul de lactofenol o tinta china). En el
caso de la tinta china se usa para la tincin negativa que
significa que, en vez de teir a las clulas, se tie el medio
que las rodea con una sustancia opaca que no interactu con
las clulas. Se usa mayormente para ver la capsula.
b) Tincin diferencial: Las tinciones diferenciales tien de
clores diferentes para poder distinguir las clulas segn sus
caractersticas especficas. Ejemplo de ello son la tincin
Gram y la de Ziehl Nielsen.

c) Tincin especifica: Cuando se desea observar cierta

estructura en particular se emplea este tipo de tincin,
donde usando diferentes colorantes o anticuerpos se logra
colorear las estructuras deseadas. Por ejemplo la tincin
con el colorante de flagelos de Leifson.

d) Tincin de viables: En esta tincin se identifica la clulas

vivas de las muertas; este objetiva a travs de la membrana
citoplasmtica (si est intacta o no). En este caso se usa
colorantes de fluorescencia de color rojo y verde, las verdes
tien todas las clulas pero el rojo que contiene yoduro de
propidio solo penetra en las membranas rotas o sea en las
clulas muertas. Este tipo de tincin diferencial se suele
usar en ecologa microbiana.
Tincin de viabilidad
mostrando clulas
muertas (rojo) y vivas
(verde).

Fuente: Banco de
imgenes de la Facultad
de Biologa UCM

http://bioimagen.biouc
m.es/foto/6572

En la presente prctica se emplearn dos tinciones

diferenciales, la tincin Gramn y la de Ziehl Nielsen.
II. Mtodos:
a) Tincin Gramn:
Desarrollado por el cientfico dans Christian Gram, esta es unos
de los tipos de tincin ms usados en microbiologa y que divide
adems a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y
Gram negativas.

1) Fundamento: Pared celular bacteriana

Fundamentalmente la diferencia que existe entre gram
positivas y negativas recae en la composicin de su pared
celular. La pared celular posee como principal componente
al pptidoglicano el cual es un polisacrido compuesto por
dos azucares: La N-acetilglucosamina y el cido N-
acetilmurmico, estos se encuentran unidos por enlaces -
1,4 y adems, los azucares se conectan entre sus NAM
(Acido N-acetilmurmico) por aminocidos de forma
distinta segn los grupos de bacterias.

La siguiente presenta las diferencias ms resaltantes entre

la pared celular de las Gram positivas y negativas:

Como se puede observar la pared gram positiva posee una

gruesa capa de pptidoglicano adems de que posee pocos
poros entre ellos, tiene adems un entramado ms denso
producto de un puente peptdico compuesto de glicina.
 En las gram negativas adems de poseer una capa menos
gruesa y de tener una membrana externa, posee poros
muchos ms grandes y un una ttrada peptdica sin puentes
de glicinas.

2) Fundamento: Mecanismo de la tincin:

La tincin Gram usa como colorante primario al cristal
violeta, tambin luego se le adiciona Lugol el cual se forma
un complejo coloreado con el yodo del Lugol y el cristal. Este
complejo se queda indistintamente en las paredes de las
bacterias; sin embargo en al echar alcohol al frotis la pared
se deshidrata en el pptidoglicano de las gram positivas y
los poros se cierra; por lo tanto el complejo se queda
atrapado en la pared y no se decoloran. Las gram negativas
en cambio no tienen tal propiedad debido a que el alcohol
penetra rpidamente en la membrana externa y los grandes
poros no se cierran, adems de la poca cantidad de
pptidoglicano que posee. Por eso las gram negativas se
decoloran y luego se les aplica el colorante de contraste que
puede ser fucsina o safranina.
b) Tincin Ziehl-Nielsen:
En las actinobacterias como en gnero Mycobacterium son
tambin conocidos como cido-resistentes, propiedad que tienen
gracias a la presencia de cidos miclicos que solo aparecen en
especies de estos gneros. Los cido miclicos son lpidos
hidroxilados y ramificados complejos que se unen covalentemente
al pptidoglicano dndole una consistencia crea e hidrfoba.

Debido a esto las micobacterias no se tien bien con la tincin

gram por lo que se usa este modelo alternativo; donde se usa el
colorante rojo fucsina bsica y fenol que se introducen lentamente
con calentamiento lento y el fenol permite que la fucsina ingrese.

Luego se lava y se decolora con cido y alcohol para luego aadir

el colorante de contraste, azul de metileno. Como resultado las
clulas cido-resistentes aparecen teidas de color rojo y todo lo
dems azul.
III. Resultados:
Las siguientes imgenes muestran los organismos usados y su tincin
hecha.

Pseudomonas aeruginosa : Esta bacteria en su medio de cultivo se

puede notar una pelcula de color verdosa azulada, lo que significa
que produce un pigmento piocianina; tambin es una bacteria
aerbica por su crecimiento en la superficie del caldo. Es un bacilo
gram negativo pequeo.

Salmonella: Esta bacteria gram negativa gruesa es conocida por

producir trastornos intestinales adems de contaminar las aguas
residuales. Bacilo grueso gram negativo.
 Bacillus subtilis: Esta bacteria se encuentra en cultivos
alimentarios, rizosfera, bioabonos organicos, fitohormonas y
antibiticos. En estas bacterias cuando se encuentran en
condiciones desfavorables les aparece una estructura nica
(esporas) que es posible ver en el microscopio. La bacteria
esporulada es debido a cambios del PH al paso de tiempo. Este es
un bacilo gram positivo.
 Escherichia coli: Bacteria presente en el tracto intestinal,
saprofita, sin embargo existen algunas cepas oportunistas dainas
para el organismo. Es un bacilo gram negativos.

Mycobacterium tuberculosis: Esta bacteria es acido resistente por

lo que la tincin empleada fue la de Ziehl Nielsen.
IV. Conclusiones:
La tincin gram es uno de los mtodos ms comunes de
identificacin de bacterias, aprovechando las diferencias
estructurales de la pared celular de esta. Su aplicacin debe ser
bsica en todo proceso de identificacin de bacterias.
En el caso de las bacterias cido resistentes, siempre sera factible
usar el mtodo de tincin de Ziehl Nielsen con el fin de evitar los
errores de identificacin si solo se usa Gram.

V. Cuestionario:
1. Afecta la edad del cultivo a la coloracin de Gram?
S, ya que con el paso del tiempo la falta de nutrientes genera que
las bacterias mueran y su pared celular se va desgastando con el
tiempo. Cuando hacemos la tincin con estos cultivos, el complejo
cristal violeta no se quedara fijo en la pared celular por lo que al
final del procedimiento estas aparecen como falsos gram negativos.

2. Existen diferencias qumicas que expliquen las velocidades de

decoloracin en las gram positivas y negativas?
S, fundamentalmente las diferencias qumicas estan en el
entramado de las cadenas de pptidoglicano, en la composicin de
la ttrada peptdica y en la cantidad y tamao de los poros de
estas.

3. Qu componentes bacterianos permiten la resistencia a la

decoloracin alcohol cido?
Sobre todo el cido miclico y los lpidos que generan que la pared
sea ms hidrfoba, por lo tanto menos reactiva para que
interactuara con el cido.

4. Qu significa BAAR y cul es su interpretacin?

Bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR) son las bacterias del
gnero Mycobacterium cuyas propiedades de cido resistentes les
impide ser teidos por el mtodo Gram.
VI. Bibliografa
Madigan TM, Martinko JM, Bender SK, Buckley and others.
Biologa de los microorganismos. Dcimo cuarta edicin. Madrid
2015
http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/general.php?Mostra
r=baar
https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/bi
otecnologia/practico4.pdf
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf