Anda di halaman 1dari 7

Berdasarkan hasil praktikum isolasi DNA tanaman Sawi hijau (Brassica

sp.), langkah pertama yang dilakukan adalah penghancuran membran dan dinding
sel pada daun muda yang digunakan. Isolasi DNA tanaman ini digunakan daun
yang masih muda hal ini dikarenakan dipucuk daun dapat menekan senyawa
polifenol dan polisakarida sehingga dapat memperbesar kemungkinan
keberhasilan untuk melakukan isolasi DNA yang kita inginkan.
Hal ini diperkuat dengan pernyataan Zubaidah (2004), pada bagian tanaman
banyak memiliki senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi
yang dapat menghambat pemurnian DNA, senyawa polifenol dan polisakarida
juga dapat mempengaruhi enzim-enzim seperti polimerase, ligase, endonuklease
restriksi, atau enzim yang mengakibatkan DNA tidak digunakan dalam praktikum
Biologi Molekuler.
Penghancuran bertujuan untuk merusak jaringan yang ada pada sel sehingga
mempermudah bahan-bahan kimia lain yang akan digunakan untuk masuk ke
dalam organel-organel sel, dalam hal untuk mengambil DNA. DNA yang diisolasi
dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder
seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih
banyak mengandung protein.
Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses
destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman
memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman,
kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Pembukaan sel
untuk mengeluarkan asam nukleatnya pada praktikum ini dengan cara mekanik
yaitu digerus dengan tip steril pada tabung mikro atau dapat juga menggunakan
bahan kimia yaitu nitrogen cair untuk mendegradasi dan melarutkan komponen
dinding sel.
Pada saat proses destruksi jaringan tanaman dapat menyebabkan degradasi
pada DNA dengan adanya aktivitas enzim endonuklease, karena itu digunakan
buffer ekstraksi yang mengandung senyawa 200 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM
NaCl, 25 mM EDTA, dan 0,5 % SDS. DNA akan terpisah menjadi suatu larutan
dan dapat dimurnikan (dipurifikasi) melalui dua cara yang umum dilakukan yaitu
sentrifugasi dan ekstraksi kimia.
Sampel disentrifugasi dengan kecepatan yang tinggi sehingga komponen
yang berukuran lebih besar atau lebih berat akan mengendap membentuk sedimen
pada bagian bawah tabung. SDS berfungsi untuk melisis dinding sel tumbuhan
yang terdapat dalam larutan sampel. Ini disebabkan karena sifat dari SDS sama
dengan sifat dinding sel yang hidrofobik, sehingga terjadi ikatan diantara
keduanya dan menyebabkan dinding sel rusak.
Setelah ditunggu beberapa menit, sampel selanjutnya diinkubasi. Muladno
(2002), buffer lysis ini mengandung EDTA yang berfungsi merusak dinding sel
secara kimiawi dengan cara mengikat ion magnesium berfungsi mempertahankan
integritas sel maupun aktifitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat.
Kotoran (debris) yang dihasilkan dari aktivitas lysis ini dibersihkan dengan cara
sentrifugasi agar kotoran mengumpul didasar tabung mikro.
Untuk membersihkan protein dan polisakarida dari larutan digunakan
kloroform sedangkan kondisi yang lebih ekstrem, dapat digunakan
proteinase.DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan
dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein
agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi.
Tahap selanjutnya yaitu sampel yang telah vortex selama 5 detik
dankemudian diinkubasikan isolasi pada suhu 60C selama 30 menit, hal ini
bertujuan agar enzim bekerja secara optimal setelah ditambahkan buffer
ekstraksi. Kemudian dilakukan ditambahkan kloroform dan isoamil alkohol (24:1)
1x volum sampel dan disentrifugasi untuk mendapatkan supernatan.
Terbentuk 2 fase setelah penambahan CIA dan disentrifugasi yaitu fase cair
( supernatan ) dan fase organik. Hal tersebut sesuai dengan pernyataan
Pharmawati, (2009) menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2
fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus (air)
pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus
setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada
interfase dan lipid akan berada pada fase organik.
Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air.
Disamping itu, protein juga mengandung residu hidrofobik yang mengakibatkan
protein larut dalam pelarut organik. Berdasarkan sifat ini, terdapat beberapa
metode deproteinisasi berdasarkan pemilihan pelarut organik. Biasanya pelarut
organik yang digunakan adalah fenol atau kloroform yang mengandung 4%
isoamil alkohol. Penggunaan kloroform isoamil alkohol (CIA) berdasarkan
perbedaan sifat pelarut organik.
Kloroform tidak dapat bercampur dengan air dan kemampuannya untuk
mendeproteinisasi berdasarkan kemampuan rantai polipeptida yang terdenaturasi
untuk masuk atau termobilisasi ke dalam fase antara kloroform air. Konsentrasi
protein yang tinggi pada fase antara tersebut dapat menyebabkan protein
mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa organik lain akan terpisah
pada lapisan kloroform (Doyle, 1990).
Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara
kloroform-air. Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk emulsi dari air dan
kloroform. Hal ini hanya dapat dilakukan dengan penggojogan atau sentrifugasi
yang kuat karena kloroform tidak dapat bercampur dengan air. Isoamil alkohol
berfungsi sebagai emulsifier dapat ditambahkan ke kloroform untuk membantu
pembentukan emulsi dan meningkatkan luas permukaan kloroform-air yang mana
protein akan mengalami presipitasi.
Penggunaan kloroform isoamil alkohol ini memungkinkan untuk didapatkan
DNA yang sangat murni, namun dengan ukuran yang terbatas (20.00050.000
bp). DNA kemudian diikat dari fase aquoeus dengan presipitasi
isopropanol (Muladno, 2002). Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat
dipekatkan melalui presipitasi. Pada umumnya digunakan isopropanol dingin
untuk mengendapkan, melekatkan dan memisahkan DNA dari larutan.
Pada saat penambahan isopropanol dingin terlihat benang-benang tipis DNA
tanaman berwarna putih yang melayang di larutan tersebut. Kedua senyawa
tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA
menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan
sentrifugasi. Menurut Heldt (2005) bahwa presipitasi berfungsi untuk
menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi.
Menurut Yuwono, (2008) prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama,
menurunkan kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air
yang polar mengelilingi molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif
dari air berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester DNA.
Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat
bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air.
Molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam
nukleat sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat;
kedua, penambahan isopropanol akan menghilangkan molekul air dalam larutan
DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol dingin
akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga memudahkan presipitasi
DNA. Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari
residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa.
Residu tersebut juga mengalami koagulasinamun tidak membentuk struktur
fiber dan berada dalam bentuk presipitat granular.Pada saat etanol atau
isopropanol dibuang dan pellet dikeringanginkan dalam tabung, maka pellet yang
tersisa dalam tabung adalah DNA pekat. Proses presipitasi kembali dengan
isopropanol sebelum pellet dikeringanginkan dapat meningkatkan derajat
kemurnian DNA yang diisolasi (Farrel, 2004).
Tahap selanjutnya yaitu tabung dikocok dan diinkubasi pada suhu -200C
selama 15 menit. Hal ini dilakukan untuk optimalisasi kerja isopropanol.
Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm x g selama 15 menit. Proses
sentrifugasi ulangan dilakukan untuk mendapatkan pellet DNA. Tahap selanjutnya
yaitu tabung di sentrifugasi kembali pada kecepatan 6.000 rpm selama 15 menit.
Hasil yang didapat yaitu berupa supernatan yang bening dan pelet (endapan DNA
murni) yang berwarna putih terdapat pada dasar tabung.
Kemudian supernatan tersebut dibuang karena DNA berada pada bagian
natan. Menurut Donata (2007) DNA murni yang dihasilkan adalah DNA yang
terbebas dari campuran material dan komponen intraceluler yang mengandung
larutan kompleks berupa RNA, protein, lemak dan karbohidrat. Setelah
ituditambahkan 100 L buffer TE ke dalam tabung yang berisi pelet dan
kemudian disimpan di dalam freezer dengan suhu sekitar -20C.
Ardiana, (2009) menyatakan bahwa buffer TE dan penyimpanan suhu pada -
20C bertujuan agar sampel DNA yang telah diekstraksi dapat disimpan hingga
waktu berminggu-minggu. Pharmawati, (2009) juga menjelaskan bahwa pelarutan
kembali dengan buffer TE juga dapat memisahkan antara RNA yang mempunyai
berat molekul lebih rendah dibandingkan DNA sehingga DNA yang didapatkan
tidak terkontaminasi oleh RNA dan DNA sangat stabil ketika disimpan dalam
keadaan terpresipitasi pada suhu -20C.
Elektroforesis dengan agarose merupakan metode standar untuk
memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul
DNA/RNA. Cara pemisahan dengan elektroforesis ini merupakan alat pendukung
yang sangat cocok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan aplikasi yang
begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untau ganda molekul DNA.
Pada PH mendekati netral, DNA bermuatan negatif akan bermigrasi dari Katode
ke Anoda, dengan mobilitas yang terutama ditentukan oleh ukuran serta
konformasi potongan atau fragmen DNA/RNA, electron buffer dan gradien
voltage yang diberikan. Gel agarose mempunyai kemampuan pemisahan dengan
range yang cukup luas yaitu mulai dari 70pb (pasangan basa) sampai 800.000pb
(Koesmadji, 2017).
Molekul DNA dalam bentuk linier ataupun duplek akan bermigrasi
sepanjang gel matriks yang proposional dengan log dari berat molekul. Dengan
demikian penggunaan molekul standar dari DNA (yang sudah diketahui
ukurannya) dapat sebagai pembanding dari DNA dalam penentuan besar molekul.
Sebagai DNA standar biasanya digunakan fragmen hasil pemotongan dari DNA
bakteriofag lambda dengan enzim Hindll dan EcoRV ataupun fragmen-fragmen
DNA yang sudah diketahui ukurannya (Koesmadji, 2017).
Berdasarkan hasil elektroforesis yang dilakukan dengan bantuan sinar UV
yang dilakukan diruang gelap DNA hasil isolasi dapat terlihat dan dapat
ditemukan.
Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan
bahwa, praktikan mampu melakukan isolasi DNA tanaman Sawi hijau (Brassica
sp.)dengan cara penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan
padat seperti dinding sel, membran sel dan protein, serta dapat
melakukan pemurnian DNA. Pada isolasi DNA ini digunakan daun muda atau
pucuk, hal ini dikarenakan dipucuk daun dapat menekan senyawa polifenol dan
polisakarida sehingga dapat memperbesar kemungkinan keberhasilan untuk
melakukan isolasi DNA yang kita inginkan.

DAFTAR PUSTAKA
Ardiana, D.W. 2009. Teknik isolasi DNA genom tanaman papaya dan jeruk
dengan menggunakan modifikasi buffer CTAB. Buletin Teknik
Pertanian14(1): 12-16.

Donata. 2007. Komunikasi pribadi. Ciri-ciri DNA murni dan penyebab


keberhasilan serta kegagalan dalam PCR dan elektroforesis.Erlangga.
Jakarta.
Doyle J.J and Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus.
Moscow. 12(1):13-15.
Farrel, R.E. 2004. RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and
Characterization. Third Edition. Elsevier Academis Press. London. Hal.
693-705.
Heldt, H. W. 2005. Plant Biochemistry. Third Edition. Elsevier Academic Press.
California. Hal. 491Doyle JJ, Doyle JL. 1990. Isolation of plant DNA
from fresh tissue. Focus. 12: 13-15.
Muladno. (2002). Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pusataka Wirausaha
Muda. Bogor
Pharmawati, M. 2009. Optimalisasi ekstraksi DNA dan PCR-RAPD pada
grevillea spp. (Proteaceae). Jurnal Biologi 13(1): 12-16.
Ribeiro RA, Lovato MB. 2007. Comparative analysis of different DNA extraction
protocols in fresh and herbarium specimens of the
genus Dalbergia.Genet. Mol. Res. 6: 173-187.
Yuwono, Triwibowo. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Penerbit Erlangga

Zubaidah. 2004. Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan DNA Baru pada Bakteri
Radioresisten Deinococcus radiodurans. Prosiding Seminar Nasional
Sains dan Teknik Nuklir. Bandung.