INTEGRANTES:
QUI02SV-13
PRCTICA 1
INTRODUCCIN
Medios de Cultivo.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una
serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuadas,
as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los
nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo
contaminante.
El agar es un elemento solidificarte muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica
completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con
mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por
aquellas que crecen en l.
La Gelatina es otro agente solidificarte pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias
provocan su licuacin.
Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la
formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol
se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se
usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayora de las bacterias Gram-positivas).
Condiciones generales para el cultivo de microorganismos.
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie
de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.
Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona
que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora
de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen
capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la
peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medios
sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos
carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y
sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica.
Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas
actividades metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos
microorganismos.
Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos
no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificarte
y de que otros tienen la capacidad de licuarla.
Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay
tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio.
3- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas
pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos
anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental.
En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones
atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios
facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.
5- Luz ambiental
La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz
solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos.
6- pH
7- Temperatura
Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros
como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores
(hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura
mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saproftos tienen rangos ms amplios.
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas
de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o
de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de
cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante).
MATERIAL
Cajas petri estriles 2 Cajas Petri
Potencimetro 2 Tubos de ensayo medianos
Tubos de ensaye con tapn 1 Pipeta graduada de 10ml.
Buffer pH 4, 7, 10 1 Pipeta graduada de 1ml.
2,Mecheros 1 Probeta de 100ml.
2 matraz erlenmeyer (250ml) 1 Frasco de dilucin
1probeta de 100ml 1 Balanza Granatara
Balanza granataria
Parrilla
Esptula
Autoclave
Cinta testigo
REACTIVOS
Agua destilada Algodn
Sal y manitol Papel manila
Agar MIO, TSI Agua destilada
Caldo lactosado Solucin de hipoclorito de Sodio al 2
Agar Nutritivo ppm
Agar Salmonella o TCBS} Solucin salina al 0.9%
Caldo de infusin cerebro corazn
PROCEDIMIENTO
1) Leer cuidadosamente la etiqueta en la preparacin del medio de cultivo.
2) Hacer una relacin de gr. de acuerdo a los ml de medio
3) Colocar en el matraz EM y se la mitad de agua destilada, de acuerdo a los ml que sean cada
tipo de medio.
4) Pesar el medio de cultivo, vaciar en el matraz, agitar vigorosamente y despus agregar la
otra parte del agua destilada, seguir mezclando.
5) Colocar el medio (si as lo indica la etiqueta) a la parrilla a calentar a ebullicin; se quita de
la parrilla cuando comienza a hervir y se deja enfriar un poco, para medir pH.
6) Tapar etiquetar, pegar con cinta testigo.
7) Introducir en el autoclave el material por 15Lb/ 15 min.
8) Sacar de la autoclave y se hace el vaciado respectivo si es necesario.
9) Se dejan enfriar y se colocan invertidas en bolsas de plstico, etiquetar correctamente y se
guardar en refrigeracin.
10) Anotar en la bitcora de medios de cultivo.
RESULTADOS
Diagrama de flujo de preparacin de medios de cultivo
Verter el medio de
Leer las instrucciones Quitar de la parrilla y
cultivo en la cantidad
de preparacion del se dejar enfriar un
adecuada a el frasco
medio poco
donde se esterelizara
Determinar cuanto
Aadir el resto de Determinar el pH, de
medio en polvo se
agua necesaria y se no ser adecuado se
debe de emplear en
matiene calentando ajusta con NaOH o
relacion a la cantidad
para disolver bien HCl
total a preparar
Aadir el medio de
Pesa ren la balanza Etiquetar con cinta
cultivo a el matraz,
ya calibrada la testigo con el
agitando y evitando
cantidad de medio de nombre del medio de
que se formen
cultivo necesaria cultivo y equipo
grumos
Se vierte la mitad de
Calentar en parrilla Sacar del autoclave y
la cantidad total de se lleva a autoclave a
electrica y se aade se guarda en bolsas
agua destilada a usar 15 lb /in ^2 durante
un agitador de plastico en
en un matraz 15 minutos
magnetico refrigeracion
erlenmeyer limpio
Se determina la cantidad
verter en un matraz
de sal a usar para la
pesar en balanza calibrada erlenmeyer agua destilada
concentracion y cantidad
la cantidad de sal suficiente para la cantidad
de solucion salina a
a preparar
preparar
se envasa en frascos y se
se lleva a esterilizar a etiqueta con cinta testigo
aadir la sal y agitar para
autoclave a 15 lb/ in^2 por con el nombre de la
evitar que sedimente
15 minutos solucion y equipo que
preparo
Se requieren usar 22.5 gr de agar para preparar 1000 ml de medio, por lo cual, para preparar 700
ml necesarios para la prctica:
Se calcul las cantidades de solucin salina necesaria para que a cada integrante del grupo le tocaran
9 ml y a cada equipo le tocaran 90 ml, ms una reserva por algn contratiempo, siendo el total a
preparar de 850 ml. Realizando los clculos de acuerdo a la concentracin de 0.9 %:
Los principales puntos crticos durante la preparacin de los medios de cultivos son:
La limpieza del material a usar, ya que de presentarse algn residuo en alguno de los frascos
este afectara las propiedades del medio.
La determinacin de la cantidad adecuada de polvo del medio de cultivo a usar para la
cantidad que requerimos de medio a preparar.
Disolver el medio de cultivo de forma adecuada, empleando calor para facilitar la disolucin
y evitar la formacin de grumos.
Evitar que el medio de cultivo se sobrecaliente y empiece a hervir, ya que esto ocasionara
que las protenas y azucares se descompongan y variara la concentracin de la solucin
preparada.
Describir cada uno de los componentes de los medios de cultivo.
CUESTIONARIO
1.- Qu norma mexicana nos indica el procedimiento para la realizacin de medios de cultivo?
NOM-065 SSA
3.- Cuntos tipos de medio de cultivo existen menciona un ejemplo de cada uno de ellos?
Segn su estado fsico en: lquido o caldo, semislidos o agar blando y solidos o agar.
Segn su clasificacin:
Comunes (Caldo cerebro corazn)
Enriquecidos (Agar sangre Hemina-Menadiona)
Selectivos (Agar Mitis-salivarios)
Diferenciales (Agar sangre para streptococus)
Transporte (Caldo traglicolato)
Que el medio de cultivo solido contiene 1.5 - 2% de Agar-Agar mientras que el medio lquido
no contiene Agar-Agar el cual brinda la consistencia.
La tcnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de cualquier origen
(esputo, orina, pus, etctera) que supuestamente contenga bacterias no identificadas. Los
colorantes tien la pared de las bacterias de color morado y, tras unos minutos, se realiza
un lavado del colorante. Despus de eso puede que el colorante permanezca en la pared
bacteriana o que se haya ido. En el primer caso permanecera el color morado, y se tratara
de bacterias Gram positivas y, en el segundo, la pared tendra un color rosado, y seran Gram
negativas.
Estos dos grupos de bacterias son los pilares en los que se basa la clasificacin de la amplia
mayora de las bacterias. Cada uno de los grupos responde de forma diferente a cada tipo
de antibiticos, por eso es una tcnica til para seleccionar el frmaco antimicrobiano inicial
ante una infeccin. Hay que tener en cuenta que en ciertas situaciones (como la sepsis) es
muy importante iniciar un tratamiento antibitico adecuado de forma precoz, por eso la
tincin de Gram se pide de urgencia en muchas ocasiones.
La tincin de Gram tambin tiene ciertas limitaciones. Algunas bacterias no tienen pared,
como por ejemplo las Chlamidias, y no se podrn identificar, al igual que los virus. En esos
casos la tincin no colorear ningn germen. Otro aspecto negativo de la prueba es que no
puede identificar el tipo exacto de bacteria responsable de la infeccin. Para ello es
necesario realizar un cultivo microbiolgico que se acompaa siempre de un antibiograma
para estudiar de forma exacta el antibitico ms efectivo.
OBSERVACIONES
Otra cosa que pudimos observar, fue que la prctica se atras un poco debido a que una
autoclave se encontraba tapada y esto ocasiono que para poder meter todo el material
esperamos a que la otra autoclave estuviera desocupada.
Los medios de cultivo son sustancias adecuadas para el estudio de los microorganismos ya que
proveen los sustratos adecuados para que se desarrollen y se puedan analizar sus caractersticas
bioqumicas de forma fcil, adems, al existir diferentes medios de cultivos con cualidades
especializadas, se pueden usar en diferentes ocasiones, dependiendo del tipo de bacteria, el tipo de
estudio o las condiciones que se quieren desarrollar para el anlisis.
En esta prctica fue muy importante conocer los cuidados que se deben de llevar a cabo para la
preparacin, ya que de no ser llevada a cabo de forma correcta puede afectar la composicin del
medio de cultivo y ocasionar problemas durante los anlisis de los microorganismos.
Con esto procedimos a determinar las cantidades que debamos emplear para la cantidad de medio
de cultivo que vamos a preparar, posterior a esto llevamos a cabo la preparacin como lo indica el
fabricante y analizamos el pH para determinar que cumpliera con lo que requeramos. Finalmente
llevamos el medio a esterilizar a autoclave en frascos limpios, y etiquetados con cinta testigo para
confirmar que se esterilicen adecuadamente.
As mismo preparamos solucin salina al 0.9%, para lo cual, en base a la cantidad que requeramos
preparar determinamos la cantidad de sal adecuada, pesamos y disolvimos en agua destilada,
llevamos la solucin a frascos y los tapamos y etiquetamos de forma adecuada con cinta testigo
antes de llevar al autoclave a esterilizar.
Es importante recalcar que cada medio de cultivo tiene una preparacin diferente de acuerdo a las
condiciones de su composicin, agar nutritivo y sangre son los dos grupos representativos, y de
acuerdo a este trato el medio de cultivo cumplir con su funcin; tambin es conveniente cuidar
demasiado la temperatura, ya que de lo contrario en el agar podran caramelizarse los azcares y
perder protenas, as como repetir la prctica. Mantener con vida al medio de cultivo tambin
requiere controlar condiciones de pH, puesto que, para que las bacterias crezcan adecuadamente
en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado
de humedad y presin de oxgeno, adecuadas, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad.
Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar
exento de todo microorganismo contaminante.
Se determinaron las cantidades a emplear para preparar el medio de cultivo, en ciertas ocasiones
estas cantidades vienen dadas por el fabricante, ya una vez preparadas se analiza el pH para saber
si estaba apto para usarse o sino para tener el pH indicado, ya con el pH adecuado se llev a
esterilizar a autoclave, a los frascos limpios se le coloco un pedazo de cinta testigo para confirmar
que se esterilizaron adecuadamente.
Con el conocimiento adquirido se pudo entender que un medio de cultivo es un sustrato o una
solucin de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos. En las condiciones de
laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras
en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias.
Los microorganismos son los seres ms abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones
extremas de pH, temperatura y tensin de oxgeno, colonizando una amplia diversidad de nichos
ecolgicos. Entre los requerimientos ms importantes para su desarrollo estn el carbono, el
oxgeno, nitrgeno, dixido de carbono e hidrgeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del
aporte extra de factores de crecimiento especficos en forma de suero, sangre y extracto de levadura
entre otros.
Existen medios de cultivo natural y sinttico, en esta ocasin nuestro equipo se encarg de preparar
el agar nutritivo (medio sinttico).
La preparacin del agar consisti en partir de un medio deshidratado con el que cuenta la
universidad en donde el fabricante indica la cantidad de medio necesaria por cada litro de agua as
como las condiciones a las cuales se debe de manejar; ya que se tena el clculo de la cantidad
necesaria, se coloc la mitad de agua en un matraz y se le agrego el agar hasta disolverlo
completamente y posteriormente se le agrego el agua restante y se llev a ebullicin, se modific
el pH con cido ya que sali ms alto que lo que requera y por ltimo se esterilizo en el autoclave.
Tambin se prepar una solucin salina a concentracin de 0.9% y se esterilizo en tubos de ensayo
en la autoclave.
Como se mencion arriba cada equipo preparo diferentes medios de cultivo cada uno con
caractersticas y composiciones diferentes para permitir el crecimiento de microorganismos con
diferentes caractersticas.
Aun as todos estos deben someter sea una esterilizacin en autoclave, para que en su utilizacin
no tengamos contaminaciones cruzadas.
Con todo esto se reafirm el conocimiento adquirido en T.S.U. acerca de la preparacin de un medio
de cultivo para microorganismos, las tcnicas necesarias para el manejo de los mismos, poniendo
en prctica conocimientos tcnicos de laboratorio.
De forma general, y por ltimo, la forma de elaborar un medio de cultivo es relativamente sencilla,
siendo muy til para el estudio de microorganismos debido a que presentan condiciones aptas para
la reproduccin y sobrevivencia del mismo.
HIPOCLORITO DE SODIO
FORMULA: NaClO
CLORURO DE SODIO
FRMULA: NaCl
Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiologa. Manual de Mtodos Generales (2da
edicin). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Preparaci
%C3%B3n_de_medios_de_cultivo.pdf
Dugas Beverly Tratado de Enfermera Prctica Nueva Editorial Interamericana Mxico, 1999.
http://es.scribd.com/doc/14173118/4-Esterilizacion-y-Preparacion-de-Medios-de-Cultivo
Biotecnologa Vegetal (cultivo de tejidos, manual )Gonzalez, Cruz, Camarillo, Silos. 2000.
SEP. 133p.
http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/CultivoTejidos.pdf