Resumos de Biotecnologia 2014-2014

1 Mdulo Biotecnologia Microbiana

Biotecnologia microbiana utilizao de microrganismos, clulas ou partes de clulas, para produo de determinadas substncias com fins lucrativos/comerciais.
Biologia sinttica ramo da biologia que combina as seguintes disciplinas: biotecnologia, biologia da evoluo, biologia molecular, sistemas biolgicos e engenharia
gentica. O seu objectivo o desenho de sistemas biolgicos para utilizao com propsitos comerciais, apoiando-se muito na engenharia gentica.
Biologias Sinttica VS Biologia Microbiana Baseiam-se nos mesmos princpios, mas apresentam diferenas quanto ao avano do conhecimento e tecnologia. A
biotecnologia microbiana utilizada desde h muito tempo, inicialmente de forma inteligvel, por exemplo no fabrico do po, na produo de vinho e cerveja. Podem
distinguir-se 3 grandes marcos histricos:

1. Pasteur descobriu e explicou o papel das leveduras e bactrias nos processos de fermentao lctea e alcolica;

2. Descoberta da Penicilina Produo e utilizao de antibiticos, durante os perodos que embarcaram as grandes guerras mundiais;

3. Sntese de anticorpos no final do sc. XX graas ao desenvolvimento da biologia molecular.

Vantagens da aplicao dos microrganismos em relao utilizao de outros organismos:

So seres unicelulares ou pluricelulares pouco diferenciados possibilidade de cultura em grandes volumes em fermentadores

Elevada taxa de multiplicao

No sazonais (em comparao com os animais e plantas)

A ubiquidade dos microrganismos podem ser encontrados em qualquer meio, desenvolvem-se numa vasta fama de temperaturas, pH, e a sua diversidade
metablica permite a explorao das mais diversas fontes de energia - Grande versatilidade metablica e fisiolgica:

o Utilizao de diferentes substratos (incluindo subprodutos industriais) - O seu meio de cultura de fcil obteno, podendo inclusive, ser constitudo de
restos de outros meios;

o Produo de diferentes metabolitos cuja sntese qumica seria difcil/impossvel (vitaminas; antibiticos; enantimeros)

No existem (ou existem menos) problemas ticos

A sua razo rea/volume vantajosa absoro rpida de nutrientes e elevada velocidade de metabolismo, o que torna os processos mais econmicos

Vantagens econmicas e ecolgicas: reduo custos energticos e com matrias-primas, reduo uso de solventes e produo resduos

Valor comercial
 Clulas leveduras e cogumelos ou seja, as prprias clulas (por multiplicao) tm valor comercial

Bioconverso utiliza energia para modificar substratos, transformando um composto noutro com
estrutura semelhante atravs da ao de enzimas, alterando as suas propriedades (ex.: bioconverso de
esteroides) o substrato fornecido cultura e alterado por ela;

Produtos do metabolismo celular antibiticos, aminocidos, lcoois e cidos orgnicos (as enzimas
no so um produto do metabolismo, so um constituinte celular).

Para que algo tenha valor comercial necessrio que seja produzido em grande quantidade. Contudo, uma clula no produz nada em excesso, exercendo inclusive um
grande controlo e regulao sobre as reaces anablicas e catablicas, para evitar gastos de energia desnecessrios um dos grandes desafios a promoo da
produo:

Tipos de Metabolitos

Metabolitos primrios so essenciais para o crescimento, desenvolvimento e reproduo dos microrganismos,

sendo que na sua ausncia estes no sobrevivem. A sua produo acompanha a fase exponencial do
crescimento (ex.: aminocidos, vitaminas, cidos orgnicos, etanol, etc).

Metabolitos secundrios no desempenham um papel essencial no crescimento, desenvolvimento ou

reproduo, sendo formados apenas no final da fase exponencial e na fase estacionria do crescimento. Esta
categoria engloba compostos amplamente aplicados nas reas da sade e da nutrio, como antibiticos (ex.:
antibiticos, pigmentos, toxinas, imunossupressores, factores de crescimento, etc).

Os metabolitos podem ser utilizados pela indstria para obteno de aminocidos, antibiticos, vitaminas, cidos
orgnicos, qumicos necessrios sntese orgnica e desenvolvimento de vacinas.
Sntese Qumica VS Sntese Biolgica - Consoante o produto desejado pode ser mais rentvel e lucrativo a sntese qumica, a sntese biolgica ou uma combinao de
ambas.

A produo qumica de aminocidos s tem 50% de rendimento, uma vez que no final do processo so obtidas duas partes iguais de aminocidos na forma L e D,
contudo apenas a forma L biologicamente utilizvel, pelo que 50% da produo desperdcio, uma vez que no tem aplicao.

Os microrganismos como apenas utilizam aminocidos na forma L, produzem aminocidos apenas nesta conformao, contudo fazem-no em pouca quantidade.

Assim, quanto produo de aminocidos, a utilizao de microrganismos ao contrrio da sntese qumica permite a obteno de uma mistura no racmica , ainda que a
produo no seja muito elevada.

Por exemplo, a vitamina B12 apenas pode ser obtida por via microbiana, contudo a vitamina C obtida por conjugao da sntese qumica com a sntese biolgica, j que
um passo do processo de produo desempenhado por microrganismos.

Fermentao na biotecnologia a fermentao todo o processo realizado na indstria em que sejam utilizados microrganismos.

Sistemas Biolgicos:

Bactria Escherichia coli Levedura Saccharomyces cerevisiae

Vantagens Desvantagens Vantagens

No patognica Ausncia de modificaes ps-translacionais No patognica
Expresso rpida Protenas produzidas como corpos de incluso so Modificaes ps-translacionais
Elevados rendimentos inactivas Produo estvel de estirpes
Rpida taxa de crescimento Diferentes frequncias de aparecimento de diferentes Rpida taxa de crescimento
Os metabolitos so produzidos pelos microrganismos em pouca quantidade, sendo necessria a aplicao de metodologias que permitam o aumento da produo. Assim, os
microrganismos utilizados na indstria so selecionados/modificados com promoo da alterao das vias regulatrias do metabolismo por via a exponenciar a produo
dos metabolitos pretendidos.

Biotecnologia Tradicional o aumento da produo dos metabolitos conseguido de forma emprica, atravs da utilizao das estirpes mais produtivas. Estas estirpes
so derivadas de mutaes espontneas ou obtidas por exposio a agentes mutagnicos a biotecnologia tradicional a mais utilizada nas indstrias.

Biotecnologia Moderna o aumento da produo dos metabolitos conseguido atravs da modificao dos microrganismos, por exemplo atravs da tecnologia de
DNA recombinante.

Tecnologia de DNA recombinante permite a introduo, num organismo ou estirpe, de genes codificadores de protenas normalmente no produzidas por esse
organismo ou estirpe. Pressupe o conhecimento aprofundado do genoma e dos mecanismos de expresso gnica e de regulao do hospedeiro:

A interveno ou manipulao de um organismo, visando a produo de uma dada protena pode ser feita a qualquer um dos passos de expresso:

Na quantidade de cpias do gene

Na localizao do gene inserido num plasmdeo ou no prprio genoma, sendo esta ltima hiptese mais certa no que diz respeito estabilidade de transmisso a geraes
posteriores.
Na carga metablica
Com a permeabilizao da membrana para esse composto, inviabilizando deste modo eventuais mecanismos regulatrios de feedback.

Problemas gerados pelo aumento da produo:

Toxicidade o produto pode ser txico para a clula;

Sobrecarga metablica

o Um nvel excessivo de expresso de uma molcula leva saturao da maquinaria celular, o que faz diminuir a taxa de crescimento do organismo;

o Existe um limiar a partir do qual o organismo ir produzir a mesma quantidade de protena independentemente do nmero de cpias do gene Fenmeno
hottleneck.
Contudo a introduo de um gene no microrganismo e sua consequente expresso no perodo de crescimento, reduz a taxa de multiplicao por saturao da maquinaria
celular e possvel toxicidade do produto que codifica.

Objectivo

1. Aumento do nmero de clulas proporcionam-se as condies necessrias para que as clulas se multipliquem at uma densidade tica elevada , sendo que s
aps o seu crescimento deve ocorrer a expresso do metabolito desejado;

2. Expresso do gene fornecido um sinal que leva induo da expresso do gene, que havia sido introduzido nas clulas, para produo do metabolito
pretendido normalmente a expresso do gene induzida, por manipulao da temperatura ou emprego de uma molcula especfica.

Isto conseguido por regulao da expresso gnica, por via a que ocorra uma EXPRESSO DIFERENCIAL DOS GENES
N.B.: Tal particularmente importante quando o metabolito txico, pois de outra forma nunca se conseguir que haja um nmero suficiente de clulas a produzi-lo.
As bactrias respondem a alteraes do seu meio envolvente ao alterarem o padro de expresso dos seus genes . Por exemplo, quando num meio rico em glucose, as
bactrias expresso os genes que codificam as enzimas que participam no metabolismo da glucose, no produzindo as enzimas envolvidas no metabolismo de outros
aucares.

Se mudarmos essas mesmas bactrias para um meio rico noutro acar que no a glucose, elas vo alterar os genes que expressam, por via a inibir a expresso dos genes
que codificam enzimas necessrias ao metabolismo da glucose e promover a expresso dos genes que codificam enzimas precisas ao metabolismo do novo acar.

Manipulao da expresso gnica dos procariontes

Factores que afectam a expresso

o Transcrio estabilidade do mRNA;

o Traduo o cdigo gentico no transversal entre diferentes organismos, assim para expressarmos uma
protena humana numa bactria ou levedura, no basta apenas integrar o gene que a codifica nestes organismos,
pois estes podem no possuir tRNAs suficientes para que a produo da mesma seja rentvel;

o Dosagem do gene e localizao quantidade de cpias do gene e sua localizao, por exemplo se foi introduzido
num plasmdeo ou no prprio genoma;

o Carga Metablica

Expresso de Vectores
 Estabilidade proteica e secreo relativamente secreo do produto para o exterior das clulas, existem 2 vantagens: as clulas no tm que ser rebentadas para
libertao do produto; os produtos txicos no se acumulam no interior das clulas, inviabilizando eventuais mecanismos regulatrios de feedback negativo e no
conduzindo sua morte.

H uma maior estabilidade da transmisso do gene para as seguintes geraes, se este for integrado no genoma do
organismo e no incorporado num vector.

Procariontes como Hospedeiro para a Expresso Proteica

Todas as espcies de RNA so sintetizadas por uma nica RNA polimerase;

A RNA polimerase das bactrias tem a estrutura de uma holoenzima apresenta-se dividida em duas subunidades:

Ncleo enzimtico (core) catalisa a transcrio tem a capacidade de sintetizar RNA a partir de um
template de DNA. incapaz de iniciar a transcrio no local certo, pois no distingue os promotores de outas sequncias.
Subunidade 70 liga-se ao ncleo enzimtico conferindo especificidade pelo promotor, particularmente s boxes em -35 e -10. Permite que a RNA polimerase
se ligue ao promotor de forma estvel, pois aumenta a afinidade desta pelo DNA.

O RNA traduzido durante a transcrio;

Os genes so segmentos contguos de DNA, colineares com o RNA

que est a ser traduzido para protena;

Os mRNAs so com frequncia policistrnicos.

Muitas vezes so introduzidos vectores de expresso em hospedeiros, como por exemplo E. coli, para que estes expressem uma determinada protena.

Vectores de expresso em E. Coli tem que possuir

Promotor induzvel muitas vezes o produto do gene inserido txico para o hospedeiro ou faz com que haja uma sobrecarga metablica, sendo que a estratgia
adoptada passa por deixar as clulas multiplicarem-se num fermentador sem expressarem o gene, at ser atingida uma densidade ptica ptima, aps a qual se
induz a expresso do gene. O promotor deve ser regulvel (por exemplo por factores de transcrio) e no apenas constitutivo, podendo ser forte ou fraco.

o Promotor forte sequncia cuja ligao polimerase associada ao factor 70 tem elevada afinidade, sendo parecido com a regio consensos. necessrio
um repressor Factor que se liga entre a posio -35 e -10, por via a impedir a ligao ou o avano da DNA polimerase.
 o Promotor fraco a afinidade polimerase no elevada. necessrio um activador factor
que se liga antes da posio -35 de forma a aumentar a afinidade de ligao da polimerase
ao local.

Promotor regulvel existem fatores que podem promover o incio da transcrio.

Factores de transcrio possuem 2 domnios: um domnio de ligao ao DNA e um

domnio de regulao, passvel de ser controlado, de forma a aumentar ou diminuir
a afinidade do domnio de ligao ao DNA.

Local de ligao para o ribossoma/ Ribosome Binding Site (RBS) tem que ser forte e especfico do hospedeiro;

Terminador da transcrio

Mltiplos locais de clonagem/ Multiple Cloning Sites (MCS) para insero de vrias cpias do gene;

Origem de replicao

Marca de resistncia permitem exercer uma presso seletiva de modo a garantir que o vetor passa de
gerao em gerao. As marcas de resistncia mais utilizadas so as dos antibiticos.

Passos para formar um vector com o gene de interesse:

1. Identificar o gene de interesse;

2. PCR desse fragmento de DNA
3. Enzima de restrio, para efectuar cortes nos locais de interesse;
4. Inserir gene de interesse no plasmdeo (vector)
5. Colocar em E.coli

OPERO LAC EM E. COLI

Clusters genes que codificam protenas que desempenham funes numa mesma via metablica podem
estar localizados adjacentemente no genoma e ser controlados como se se tratassem de uma nica unidade. So transcritos sob a forma de um mRNA policistrnico.

Opero lac um cluster com promotor e terminador prprio, que contm trs genes adjacentes, cujas protenas que codificam permitem a metabolizao da lactose,
em funo do meio de cultura.

A E. Coli apresenta um crescimento diauxico com duas fases. Se esta bactria for colocada num meio com glucose e lactose, consumir em primeiro lugar a glucose e em
segundo lugar a lactose. Tal acontece porque a glucose a fonte de energia preferencial das bactrias, permitindo regular a expresso de outros genes, por via a ser
utilizada antes de qualquer outra fonte de energia (ex.: lactose). O lag entre ambas as fases de crescimento corresponde exausto da glucose e incio da sntese das
enzimas necessrias ao metabolismo da lactose.
Represso catablica capacidade da glucose para controlar a expresso de diferentes genes.

Na presena de glucose reprimida a expresso dos genes responsveis pelo catabolismo da lactose;

Na ausncia de glucose os genes que catabolizam a lactose so expressos.

Lac I protena com controlo alostrico que se liga a sequencias palindrmicas (operador). Funciona como um repressor que regula a transcrio do opero lac.
CAP (catabolic activator protein) / CRP (cyclic AMP receptor protein) protenas que se ligam aos promotores para promover o incio da transcrio. Funcionam
como ativadores que regulam a transcrio do opero lac. A CRP ao contrrio da CAP pleiotrpico ativador geral que pode atuar em vrios promotores diferentes,
no apenas no lac.

Regulao do opero lac II. Positive regulation of the lac operon

Regulao negativa o lacI na forma ativa ausncia de

lactose liga-se ao operador inibindo a transcrio.

o N.B.: Os genes no so transcritos a no ser que o

repressor seja inactivado por um activador Lactose.
Esta induz a alterao da conformao do Lac I,
reduzindo a sua afinidade pelo DNA e impedindo a sua
ligao ao operador. Tal possibilita a ligao da RNA
polimerase e assim a transcrio.

Regulao positiva a CAP ou CRP na forma ativa

presena de cAMP liga-se ao promotor possibilitando
o inicio da transcrio.

o N.B.: Existe uma relao entre os nveis de glucose e

cAMP nas bactrias, uma vez que o transporte de
glucose para o interior clula inibe a produo de cAMP. Assim, quando no existe glucose no meio,
os nveis de cAMP aumentam e a CAP/CRP liga-se ao promotor.

Nunca existe um silenciamento total, existe sempre expresso basal porque outros dos genes so estruturais, codificam por exemplo permeases. A regulao on/off que
se pretende no existe na natureza, sendo que para se conseguir uma aproximao deste preciso realizarem-se alteraes ao sistema. A regulao on/off que se
pretende no existe na natureza, sendo que para se conseguir uma aproximao deste preciso realizarem-se alteraes ao sistema.

SISTEMAS DE EXPRESSO
 Sistema pET o sistema induzido pela presena de ITPG. Envolve a utilizao de:

Uma estirpe de E. coli BL21(DE3) e BL21(DE3)pLysS que no seu genoma possua um gene codificante da RNA polimerase do fago T7, sob a regulao de LacI;

Um plasmdeo pET em que o gene de interesse clonado a jusante de um promotor T7 promotor reconhecido pela RNA polimerase do fago T7 igualmente
sob a regulao de Lac I. Promotor T7 no consegue ser reconhecido pela RNA polimerase da E.
coli;

Gene lacI codifica o repressor LacI

Existem cerca de 50 vectores pET diferentes, contudo so fundamentalmente constitudos por
Operador;

Gene de interesse inserido a jusante do promotor T7.

N.B.: Os plasmdeos inseridos na estirpe plasmdeos podem ainda expressar protenas de fuso com caudas de histidina (entre outras), permitindo a purificao do
produto proteico por afinidade.

Sistema inibido em circunstncias normais (ex.: existe glucose no meio, o meio no tem lactose e/ou ITPG), os operes lac da bactria e do plasmdeo no
estaro a ser expressos, por ao do repressor LacI. Deste modo:

No produzida RNA polimerase do fago T7;

No transcrito o gene inserido no plasmdeo, porque:

No h RNA polimerase do fago T7 e a RNA polimerase da E. coli no capaz de reconhecer o promotor e iniciar a transcrio;

Mesmo na presena de RNA polimerase do fago T7, o opero lac no expresso graas represso exercida por Lac I.

utilizada uma RNA polimerase do fago T7 por dois motivos:

1. Representa uma vantagem em termos do nvel de expresso, uma vez que mais rpida que a RNA polimerase da E. coli;

2. A RNA polimerase da E. coli est presente nas clulas em crescimento, no sendo a sua expresso influenciada de nenhum modo pelo repressor LacI. Se por
algum motivo o repressor no estiver a atuar sobre o plasmdeo, poderia ocorrer a expresso do gene inserido (assumindo que o promotor inserido no
plasmdeo pode reconhecer a RNA polimerase da E. coli), que at pode ser txico. Assim, utilizada a RNA polimerase do fago T7 em conjunto com o
promotor T7, ambos sujeitos a regulao de LacI, por via a conferir ao sistema 2 mecanismos de segurana.

Sistema em ao para que o sistema seja acionado e assim permanea necessrio imitar a ao da lactose, uma vez que esta molcula atua sobre o
repressor anulando o seu efeito.
 A alolactose um substrato natural que atua sobre o repressor (impedindo a sua ligao ao operador) e em simultneo a ser consumida. Deste modo a sua
eficincia fica reduzida, uma vez que cada vez que a sua concentrao no sistema baixa significativamente, pode ocorrer regulao negativa do opero e
diminui a expresso das enzimas do metabolismo da lactose.
o Por via a assegurar a expresso do opero, necessria uma molcula anloga da alolactose no-catalizvel, como por exemplo o ITPG. molcula que
apresenta uma concentrao intracelular constante, uma vez que no metabolizada, sendo capaz de impedir a ligao do repressor LacI ao
operador.
o Assim, num meio com ITPG, este liga-se LacI alterando a sua conformao e inibindo a sua ao repressora. Tal possibilita:
A expresso do gene que codifica a RNA polimerase do fago T7;
A expresso do gene de interesse inserido no plasmdeo.

Em certos casos, necessrio limitar

a produo de protena. Tal pode ser conseguido por:

Co-transformao com um plasmdeo pLysS ou pLysE estes plasmdeos codificam a lisozima do

fago T7, um inibidor natural da RNA polimerase do fago T7. Assim, com a expresso de lisozima vai
haver uma reduo do nvel de expresso basal do gene de interesse;

LacZY delection mutant o gene lacY codifica as permeases que permitem a entrada de lactose e
IPTG para o interior da clula, enquanto que o gene lacZ codifica a enzima capaz de degradar a
lactose em glucose e galactose. A deleo destes genes permite controlar a entrada de ITPG para o
interior das clulas, sendo que a sua concentrao pode ser utilizada para controlar os nveis de
 expresso. Inclusive, permite manter os nveis de expresso baixos para que a qualidade das protenas expressas aumento reduo da agregao e do
misfolding.

E. coli Tuner represso do gene que codifica as permeases. Sem permeases o IPTG entra para o interior das clulas lentamente, por difuso , o que baixa a
expresso do gene;

Introduo de glucose no meio a presena de glucose ir iniciar o processo de represso catablica, que inibe a expresso do opero lac.

Sistema pBAD baseado na utilizao do opero araBAD, regulado por AraC. a ao desta molcula depende da presena ou ausncia de arabinose no meio:

Repressor na ausncia de L-arabinose a AraC liga-se ao operador O2 e a I 1 (indutor), induzindo a formao de um loop no DNA que leva inibio da
transcrio;

Activador na presena de L-arabinose, esta associa-se a AraC, fazendo com que esta molcula se ligue simultaneamente a I 1 e I2, activando a transcrio.

Sistema pLEX este sistema utiliza um repressor caracterstico do fago , modificado de forma a ser sensvel
temperatura o sistema induzido por um aumento da temperatura.

o O repressor temperatura de 30 oC liga-se sequencia de DNA, impedindo a ocorrncia da transcrio.

Quando se pretende que o gene inserido seja expresso, basta apenas aumentar a temperatura para
42oC, uma vez que tal provoca a desnaturao do repressor que se torna incapaz de inibir a transcrio.

o N.B.: Por cada cpia do operador necessrio que exista uma cpia do repressor, uma vez que apenas
uma sequncia repressora na clula no suficiente para exercer o efeito repressor em todos os locais.

o Tags (GST, His-tag, Strep-tag, MBP, GFP) usualmente, encontra-se ligado protena alvo, por um local de
reconhecimento para uma protease especfica (factor Xa, enterocinase, TEV) permite a purificao por afinidade, a
proteco contra a protelise, reprter da expresso, aumento da estabilidade

ESTABILIDADE DAS PROTENAS E SECREO

vulgar ocorrem problemas ao nvel da traduo, uma vez que muitas vezes as protenas que
se pretende obter so de origem humana. O ambiente do citoplasma em E. coli no favorece a
formao de pontes dissulfureto, que existem com muita frequncia em protenas humanas. Um
dos principais problemas a formao de corpos de incluso.

Corpos de incluso agregados insolveis de protenas, que se formam no interior das clulas,
resultantes da no formao correta de pontes de dissulfureto aliada sobre expresso da
Chaperonas gerais
Foldases
protena Resultam de no existirem protenas que assistam o folding em nmero suficiente. So um problema, pois pretende-se obter uma protena solvel, uma vez
que assim o processo de extraco mais fcil e barato.

Protenas responsveis pelo folding existentes nos genomas das bactrias

o Pode ocorrer que quando haja sobre-expresso da protena a maquinaria de folding fique sobrecarregada, sendo incapaz de realizar o folding correto , o que
resulta na exposio da poro hidrofbica da protena e insolubilidade da mesma.
o Para que se formem pontes dissulfureto utilizada uma estirpe de E. coli mutante Origami(DE3) (consegue formar as pontes de dissulfureto no citoplasma,
permitindo que a protena se mantenha na forma solvel.) que possui um dissulfide reduction pathway.

Protenas recombinantes em E. coli:

Citoplasma Periplasma Meio de cultura

o Maiores taxas
o Origami permite a formao de
pontes dissulfureto no citoplasma
o Formao de pontes dissulfureto
o Reduo de protenas contaminantes
o Protelise diminuda
o Libertao de protenas simplificada por choque
osmtico
o Reduo de protenas contaminantes
o Protelise diminuda
o No acumulao do produto no interior das clulas evitando-se
problemas relacionados com a toxicidade;

A libertao do produto para o exterior (a localizao final do produto depende tambm do

tipo de bactria, se Gram positiva ou Gram negativa):

Evita o rebentamento das clulas;

Facilita a purificao das protenas;

Faz com que no ocorra acumulao de produto no interior, evitando problemas

relacionados com a degradao das protenas e formao de corpos de incluso a
reduo dos corpos de incluso permite um maior nvel de expresso.

Bactrias Gram positivas tm uma camada grossa de peptidoglicano (parede celular), contudo esta no oferece resistncia passagem das protenas Funciona
como uma rede.
Bactrias Gram negativas apresentam duas membranas intercaladas com uma camada fina de peptidoglicano. As protenas formadas ficam retidas no periplasma,
sendo que para serem libertadas para o exterior necessrio enzimas que degradem a membrana.

Existem dois principais tipos de sistemas de secreo em procariontes:

 Sistema Sec

SecA protena ligada membrana com actividade ATPase, hidrolisa ATP e empurra a protena para o poro formado por SecYEG;
SecB protena citoplasmtica com afinidade para protenas que apresentem um sinal no N-terminal, que indique que devem ser excretadas. Liga-se s protenas
recm-formadas impedindo o folding e transporta-as para a membrana se assumirem uma estrutura tridimensional as protenas no conseguem sair para o
meio extracelular;
SecD e F so protenas integradas na membrana que assistem o folding no meio extracelular ou periplasma;
SecYEG so protenas integradas na membrana que formam um canal que permite a translocao de protenas para o exterior a SecY expande a membrana de
modo a facilitar a passagem da protena pelo poro.
O poro formado por SecYEG utilizado por dois sistemas de secreo:

Modelo co-traducional a secreo realizada em simultneo com o processo de traduo

1. O SRP reconhece o pptido sinal emergente do ribossoma, ligando-se a este e
pausando a traduo, garantindo deste modo que a protena no libertada para o
citosol e que o processo de folding no tem incio;
2. O complexo formado dirigido at membrana para prximo do poro SecYEG, onde se
encontra o seu recetor o FtsY;
3. Posteriormente o SRP liberta-se do recetor por hidrlise de GTP e a cadeia polipeptdica
direcionada para o poro com gasto de ATP pela SecA, sendo que a traduo
posteriormente retomada.

o SRP (signal recognition particle) complexo proteico associado a um pequeno RNA, que reconhece a sequencia sinal da cadeia peptdica que est a ser
sintetizada.
o FtsY receptor bacteriano da SRP com funo de GTPase.

Este sistema semelhante ao sistema de transporte que os eucariontes utilizam para transportarem as protenas para o interior do reticulo onde realizam o folding e so
glicolisadas.

Modelo ps-traducional primeiro d-se a traduo completa da protena e s depois esta direccionada para a membrana. Para que este processo seja vivel
preciso impedir que a protena assuma uma conformao tridimensional no interior da clula:
 A SecB liga-se protena impedindo o seu folding, direcionando-a para a membrana
aps o fim da traduo;
A SecA funciona como um motor molecular que catalisa a translocao do pptido
atravs do poro para o exterior, com gasto de ATP;
Do lado externo, a Sec D e F ajudam as protenas translocadas a assumir a sua
conformao tridimensional correta, ao auxiliarem o folding.

Sistema TAT (Twin Arginine Translocation)

Apesar de o sistema Sec ser o mais frequente sistema de secreo, existem outros sistemas de translocao, como o caso do sistema TAT. Foi descoberto originalmente
em tilacoides de plantas, mas encontra-se conservado em bactrias.

O sistema TAT difere do sistema Sec maioritariamente por conseguir translocar protenas que j assumiram uma
estrutura conformacional prxima da final. composto por 3 protenas: TatA, TatB e TatC.

N.B.: Este sistema no utiliza ATP como fonte de energia, utiliza antes um gradiente de protes (ATP sintase).

Que sistema e modelo utilizar? A escolha de que sistema usar depende da protena em causa. Algumas protenas podero j ser naturalmente secretadas ou pode ser
necessrio inserir um pptido-sinal caracterstico na regio N-terminal (corresponde maioria dos casos).

Pptido sinal constitudo por cerca de 20 aa. Possui um corpo central hidrofbico e uma regio N-terminal carregada positivamente. No local que precede o seu corte
tem aminocidos pequenos (ex.: Alanina). Sinais que permitem identificar a sua localizao final, aps terem sido formadas. Estes sinais so semelhantes para os trs
sistemas, apresentando apenas ligeiras diferenas:

Os diferentes modelos do sistema Sec apresentam pptidos sinal com caractersticas muito semelhantes, sendo que o do modelo co-traducional mais hidrofbico;
O pptido sinal do sistema TAT semelhante aos do sistema Sec, contudo apresenta um motivo conservado caracterstico, composto por duas argininas gmeas perto
da regio do N-terminal.

Expresso de Protenas Recombinantes em Eucariotas

Protenas heterlogas (recombinantes) de DNA clonado proveniente dos mais variados organismos foi produzida utilizando organismos procariotas e os seus sistemas de
expresso. No entanto este tipo de expresso possui certas desvantagens:
Algumas protenas de origem eucariota produzidas em bactrias no possuem a estabilidade e actividade biolgica esperadas e desejadas. Isto acontece
essencialmente por processamento ps-traducional imprprio:
o Clivagem ou folding errado da protena
o Ausncia dos mecanismos apropriados para adicionar os grupos qumicos necessrios ao seu receptor especfico nos aminocidos
 Compostos bacterianos txicos ou que provocam o aumento da temperatura corporal em seres humanos e animais (pyrogens) podem, apesar de todos os
procedimentos de purificao, contaminar o produto final.
De forma a evitar estes problemas desenvolveram-se mtodos de expresso de protenas heterlogas em organismos eucariontes, como fungos, insectos e clulas de
mamferos.
Eucariontes vs Procariontes
Nos organismos procariontes, todos os passos de sntese proteica ocorrem de forma descompartimentalizada, e assim, a traduo do mRNA ocorrente simultaneamente
com a sua transcrio assim que um transcrito surge a partir da RNA polimerase, este est acessvel ao ribossoma para ser transcrito assim as protenas so folded
na sua configurao tridimensional apropriada durante a sntese com ajuda de chaperonas.
J nos organismos eucariontes, ocorre o transporte do mRNA do ncleo para os ribossomas no citoplasma ou no reticulo endoplasmtico, onde ocorre a traduo. As
protenas produzidas em ribossomas associados ao reticulo endoplasmtico pode sem seguir um de dois caminhos:
o So associadas membrana do prprio retculo
o So secretadas para o lmen do reticulo durante a sua sntese e so posteriormente processadas a maior parte das protenas de interesse teraputico para
doenas humanas, sofrem algum tipo de processamento ps-traducional necessrio para a sua estabilidade e actividade.

Quais so ento as modificaes ps-traducionais numa protena eucariota?

Correcta formao das ligaes dissulfureto tal como nos procariontes, o folding apropriado das protenas requer a assistncia de chaperonas no reticulo
endoplasmtico as chaperonas BiP e calnexina dobram os polipptidos nascentes de forma a permitir a formao das ligaes de dissulfureto entre resduos de
cistena adjacentes.
o O folding apropriado das protenas importante no s para que a estas adquiram a configurao que lhes permite a optimizao da sua actividade, mas
tambm proteger regies que de outra maneira seriam reconhecidas por protases que as clivariam destruindo a protena.

Clivagem proteoltica de um precursor inactivo algumas protenas so produzidas como precursores inactivos que necessitam de ser clivadas por protases em
locais especficos para darem origem protena activa.

Glicosilao o adicionar de acares especficos a certos aminocidos das protenas uma das principais modificaes ps-traducionais, fornecendo estabilidade e
propriedades distintas de ligao a cada protena.

o A glicosilao apropriada das protenas importante porque:

Contribui para a conformao destas influenciando o seu folding
Pode ser indicativo da localizao final de uma dada protena por exemplo interagindo com um determinado receptor
 Aumenta a estabilidade proteica, protegendo-a de determinada protases quando no est completa as protenas so reconhecidas como velhas e
so degradadas.
Numa clula a glicosilao ocorre no reticulo endoplasmtico e no complexo de Golgi e estes dois tecidos diferentes podem (e geralmente fazem-no) glicosilar de
forma diferente uma mesma protena, aumento a heterogeneidade proteica. Protenas teraputicas que necessitam de glicosilao incluem anticorpos, factores
sanguneos, alguns interferes e algumas hormonas. Por exemplo: A glicolizao no RE idntica em leveduras e humanos, mas no complexo de Golgi muito diferente.

Fosforilao, metilao, sulfatao, acetilao, etc.

Regulao Gnica Mantendo o Controlo Sobre a Expresso
Existem diversas diferenas entre a expresso gnica de Procariontes e Eucariontes, nomeadamente
Procariontes
Todas as espcies de RNA so sintetizadas por uma
nica RNA polimerase
mRNA traduzido durante a transcrio
Genes so segmentos contnuos de DNA que so
colineares com o RNA que traduzido numa
protena
mRNAs so muitas vezes policistrnicos
Eucariontes (entre parenteses esto os problemas que isto
pode representar)
3 Tipos diferentes de RNA polimerases so responsveis por originar
diferentes tipos de classes de molculas de RNA (em procariontes o
DNA est acessvel polimerase mas nos eucariontes o estado
normal de no acessibilidade)
O mRNA processado antes de ser transportado para o citoplasma,
onde traduzido. Caps e caudas so adicionadas e uma poro
interna do transcrito removida (compartimentalizao)
Os genes so muitas vezes separados ou seja, no so segmentos
contguos de sequncia codificante estas so interrompidas por
intres
mRNAs so monocistrnicos (a regulao muito mais feita
distncia, mais complexa e com mais componentes)

Assim ser possvel e necessrio manter o controlo da expresso gnica em Eucariontes a vrios nveis:
Meia-vida do mRNA
Iniciao da transcrio
Processamento do RNA
Iniciao da traduo
Eucariontes
Transporte do mRNA a partir do ncleo Modificaes ps-traducionais das protenas

Os genes eucariontes so maiores que os procariontes, no s porque a sua zona promotora abarca uma regio mais extensa
do DNA (~1000pb numa levedura, contra 100-200pb em bactrias) mas tambm devido presena de intres; assim, na expresso de protenas heterlogas, usual
recorrer-se ao cDNA e no sequncia completa do gene.
Translocao das Protenas Eucariontes
A translocao para o lmen do reticulo em eucariontes tem protenas homologas aos diversos tipos de translocao em procariontes, a nica diferena significativa : a
ATPse puxa a protena do Reticulo endoplasmtico para o lmen em vez de a empurrar a homloga da seca a Bip
A secreo em Eucariontes tambm apresenta duas vias possveis, a co-traduo e a ps-traduo.
Co-traduo a SRP pra traduo e dirige o ribossoma para junto do retculo endoplasmtico interaco com SR e SR (hidrolisam GTP); ocorrendo
posteriormente a translocao da protena atravs de um poro formado pelas protenas Sec71//.
Ps-traduo uma chaperona Hsp70 faz o papel de SecB, impedindo que a protena assuma a conformao final; a protena translocadas atravs do poro Sec
para o lmen do RE, sendo a energia para a translocao fornecida por uma protena Bip no lmen que puxa a protena para o interior (como explicado acima,
esta a principal diferena relativamente ao sistemas procariontes)
O lmen do RE tem menor poder redutor, permitindo que se formem as pontes dissulfureto e que se inicie o processo de glicolisao modificao associada excreo,
sempre presente em protenas excretadas.

Caractersticas Gerais de Sistemas de Expresso Eucariontes

Os requerimentos bsico para a expresso de uma protena alvo no hospedeiro eucarionte so semelhantes aos necessrio em procariontes vectores nos quais o gene alvo
foi clonado para ser expresso numa clula hospedeira podem ser plasmdeos especializados destinados para ser mantidos em hospedeiros eucariontes.
Assim o vector necessita de:
o Um promotor eucarionte que guie a transcrio do gene de interesse clonado
o MCS (polylinker)
o Sinais de stop da transcrio e da traduo eucariontes
o Uma sequncia que permita a poliadenilao do mRNA
o Um marker gene de seleco eucarionte marca de resistncia geralmente a resistncia a um dado antibitico (bactrias E.Cole) ou o complemento a uma
dada auxotrofia nutricional (leveduras) induzida no organismo produtor.
o Se destinar a ser utilizado como um plasmdeo isto , como DNA replicante extracromossomal uma origem de replicao eucarionte (bem como de
procarionte se for um vector shuttle)
o Se se destinar a ser integrado no DNA cromossomal do hospedeiro tem de possuir uma sequncia complementar ao segmento de DNA cromossomal do
hospedeiro, de forma a facilitar a sua insero no mesmo.
A introduo de DNA em bactrias ou leveduras chamada transformao.
Sistemas de Expresso em Leveduras
Os fungos possuem muitos das caractersticas moleculares, genticas e bioqumicas de outros eucariontes superiores e assim so muitas vezes uma boa escolha para a
produo de protenas heterlogas.
 Prs da Utilizao de Leveduras
Tm vantagens similares s dos procariontes em termos de:
o Crescimento rpido num meio low-cost rpidos
o Geralmente no necessitam que sejam adicionados factores de crescimento ao meio baratos
Complementa mutaes auxotrficas especficas nas
Processam as protenas eucariontes correctamente leveduras utilizadas para expresso tambm um
Podem produzir grandes quantidades de protenas heterlogas expresso mdia-alta marker gene para seleco, ou seja as leveduras tm
marcas auxotrficas e como se crissemos revertentes
So um sistema bem caracterizado e fcil de fazer o scale-up de propsito
Uma vez que os procedimentos de DNA recombinaste so
tecnicamente difceis de executar em clulas eucariontes, a
maioria dos vectores eucariontes so shuttle vectors vector
que funciona em ambos: leveduras e E.coli (replica em ambos
porque tem uma origem de replicao em ambos) Assim todas as
manipulaes do vector so feitas em E.Coli e o hospedeiro
eucarionte usado somente para a sua expresso.
Os promotores eucariontes, cuja fora pode variar, podem ser:
Constitutivos (tambm so regulveis, por exemplo pela concentrao de dado nutriente, s no se pode
par-los como acontece com os regilveis) - podem ser utilizados para protenas no txicas para a clula; so
obtidos a partir dos genes de enzimas sempre necessrias em qualquer clula eucarionte, como a piruvato
cinase ou fosfoglicerato cinase (gliclise); mesmo para estes, apesar de serem sempre expressos, pode haver Regulao dos Promotores Gal(1,10,7)
um certo grau de induo, p.e. por glucose (aumenta expresso)
A Gal4 regula a expresso dos genes GAL em leveduras em
o ADH1 resposta concentrao de galactose:
o PGK1
Quando no existe galactose no meio (A) a Gal4
Regulveis apresentam diferenas significativas no nvel de expresso, dependendo da actividade de um encontra-se ligada regio de activao
ou mais repressores e/ou activadores; so obtidos a partir de promotores de genes de enzimas que nem upstream(UASGAL) mas est impedida de interagir com
sempre so necessrias na clula, como, p.e., fosfatase cida ou enzimas da metabolizao da galactose; a
a RNA polimerase e assim da activao da transcrio
sua importncia prende-se com o facto de a expresso da protena heterloga mobilizar todos os recursos
celulares, atrasando o crescimento da cultura; assim, com promotores regulveis, deixa-se primeiro a por estar ligada ao inibidor Gal80
cultura atingir uma densidade ptica ptima e s depois se procede induo do promotor e consequente Quando existe galactose no meio (B) a galactose liga-
produo da protena se Gal3, que por sua vez se liga Gal80, inibindo o
seu efeito inibidor para Gal4 liga RNA polimerase -
o GAL1,10,7 galactose metabolic enzymes
ocorrendo posteriormente a expresso dos genes GAL
o ADH2
 Trata-se de jogar com os feedbacks existentes nas clulas

Enquanto que nos procariontes s havia um regulador, nas leveduras h vrios

Nos eucariontes existem 2 nveis de processamento at atingir a protena final, nos procariontes s existia 1:
1. Pr-protena onde ocorre como nos procariontes, a clivagem no peptdeo sinal (o sinal removido no Reticulo endoplasmtico)
2. Pr-protena tm que sofrer um processamento que vai para alm da clivagem do pptideo sinal para se tornarem activas

N.B: Podem incluir-se os pptidos de sinal no prprio vector vector de secreo. Nesta
caso as sequncias sinal utilizadas em S. cerevisiae incluem aquelas que so
derivadas da invertase (SUC2), da fosfatase acdica (PHO5), da feromona -factor
(MF)
Exemplo de Aplicaes - Valores de Mercado (do que + vale para o
que - vale)
1. Biofarmacuticos
2. Hormonas de Crescimento
3. Molculas orgnicas
4. Biopolmeros
5. Aditivos alimentares
Porque que precisamos de protenas na indstria Farmacutica?
Como fonte para uso teraputico - como o caso da insulina, de
anticorpos, de hormonas de crescimento (hGH), EPO (controla a
produo de glbulos vermelhos no sangue) e de tPA (factor de
coagulao) - atravs de injeces intravenosas ou subcutneas ou
Vacinas
Produo de protenas para fazer o diagnstico, desenvolvimento
(validao de conceito) e optimizao (estudo estruturais) de
medicamentos, como receptores, protases, cinases, canais inicos
Que formas existem de se aceder a essas protenas utilizadas na indstria
farmacutica?
Protenas Nativas
o Que em humanos as recolhidas esto limitas s protenas sanguneas, porque outras na so recolhidas por razes bvias
o Em animais so recolhidas da maior parte dos tecidos mas no so muito abundantes, possuindo ainda a desvantagem de que no so totalmente
idnticas variante humana
 Protenas Recombinantes
o Na maior parte dos casos a melhor e nica opo
Quais so as clulas hospedeiras utilizadas para a produo destas protenas recombinantes?
Bactrias E. coli
Leveduras S. cerevisiae e P. pastoris
Clulas de mamferos C127, CHO, DON, HEK, BHK, COS
Clulas de insectos High-five, Sf 9, Sf 21
Clulas transgnicas de animais e plantas ovelha, cabra, vaca
As clulas que possuem a maior taxa de crescimento so as de bactria, que simultaneamente apresentam o
menor tempo de duplicao, seguida das leveduras, pelas clulas de insecto e por ultimo pelas clulas
animais, que apresentam o maior tempo de duplicao e a menor taxa de crescimento por hora
N.B: BEVS acho que significa Baculovirus Expression Vector Systems/ insecto cells ou seja, no desenho acima, refere-se s clulas de insecto e sua posio nas diversas
categorias.
A FDA a Food and Drug Administration - necessrio que esta aprove o produto para que este entre em circulao.
Podemos assim concluir que os dois tipos de organismos com maior sucesso na produo de protenas heterlogas, nomeadamente em termos de maior velocidade de
crescimentos, menor custo de manuteno e aprovao pela FDA so as bactrias e as leveduras. Apresenta-se em seguida as vantagens e inconvenientes para cada um
destes dois sistemas de expresso.
Bactrias Contras Leveduras Contras
Prs No faz as alteraes ps-traducionais Prs
Modificaes ps-traducionais
Crescimento extremamente rpido (glicosilao e fosforilao) Bem caracterizado limitadas em leveduras o
Muito barato Produz bastantes vezes protenas Normalmente apresenta mdia- oligossacrido quase s composto
Genomas de pequena dimenso, desnaturadas (necessitam de refolding) grande expresso por manose, enquanto em humanos
sequenciados e com mecanismos de Problemas com pontes dissulfato e Fcil de fazer scale up comea com manose mas so depois
expresso bem estudados, existncia de protenas multimricas Relativamente fcil e barato
adicionados outros resduos,
muitos vectores bem conhecidosGrande Encontrando-se num estado Apresentam a vantagem
A recolha por ser um problema devido
quantidade de vectores desnaturado, as protenas produzidas adicional, sendo eucariontes, de
parede celular clulas difceis de
Normalmente apresenta grande expresso s mais sensveis actuao de proceder a modificaes ps-
rebentar para extrair o produto final
Fcil de fazer scale up protases intracelulres traducionais Pode precisar de refolding
Fcil de recolher
Produo simples e bem estabelecida
Biotecnologia Moderna
Estes dois tipos de organismo so utilizados para a produo a larga escala de diversos produtos teraputicos. Sero aqui descritas a produo de insulina e da vacina contra
o vrus da Hepatite B, respectivamente por E. coli e por S. cerevisiae.
Microorganismos utilizados como hospedeiros para a produo de produo de protenas recombinantes humanas . Exemplo de sucesso:

Produo de Insulina Hormona fundamental na rea da sade, sendo administrada regularmente em indivduos com diabetes. Foi o primeiro produto humano de
DNA recombinante a ser comercializado, tendo sido introduzido no mercado em 1982. Inicialmente era utilizada insulina extrada de animais, sendo esta uma fonte
limitada e de risco devido a eventuais contaminaes com outros compostos animais. Esta hormona constituda por dois pptidos, A e B, ligados por pontes
dissulfito.
o Existe em trs estados de produo:
A pr-insulina o resultado da traduo do gene codificante.
Sendo uma protena normalmente excretada para o meio extra-celular, possui um pptido sinal. A
pr-insulina assim a denominao que se d cadeia peptdica resultante da exciso, pela
peptidase de sinal, do pptido-sinal
Por fim, considera-se a protena como madura uma vez realizada a clivagem enzimtica da cadeia peptdica em dois locais.
o O processo de produo apresenta os seguintes passos:
1. Clonagem clonagem do plasmdeo da proinsulina (percursor da insulina)
2. Insero o plasmdeo inserido em Eschericia coli, que consegue produzir a proinsulina humana
3. Fermentao as bactrias multiplicam-se e produzem grandes quantidades de proinsulina humana
num fermentador
4. Esterilizao as bactrias so mortas por esterilizao por calor, libertando assim a proinsulina
5. Clivagem a proinsulina clivada enzimaticamente para produzir a insulina humana
6. Purificao centrifugao, cromatografia e cristalizao
Esta produzida de duas formas:
Ou as duas cadeias A e B so produzidas individualmente e depois juntas pro mtodos qumicos envolve a
utilizao de duas estirpes de E. Coli
Ou as duas so produzidas em simultneo e neste caso uma metionina inserida para permitir a clivagem das cadeias verde e vermelha da protena fuso
produzida cyanogen bromide o biopolmeros utilizado para clivar a protena nessa mesma metionina envolve a utilizao de apenas uma estirpe de E. Coli
 Produo de Vacinas. Exemplo de sucesso:
Vacina de Hepatite B
Esta vacina Este constitui um exemplo de sucesso na produo de protenas recombinantes, tendo sido a primeira vacina de subunidades do mercado.
Contem o HBsAg (Hepatitis B Virus Surface Antigen) que um dos principais componentes do invlucro do vrus. A imunizao com esta protena de 226
resduos confere proteco contra a infeco pelo vrus da hepatite B.
Sendo uma protena naturalmente glicosilada, a sua verso produzida por E. coli conferia pouca imunidade ao receptor. No entanto, quando expressa em S.
cerevisiae, adquire uma ambas a configurao tridimensional e a glicosilao correctas ao ponto de se agregar na forma de invlucros virais vazios.

Biossntese Combinatria (antibiticos, vitaminas, aminocidos)

Antibiticos so os produtos com maior valor comercial da indstria farmacutica e so produzidos essencialmente por trs gneros: Streptomyces,
Bacillus, Penicillium

1. Delete Stream Drain assim promove-se a catalisao do subproduto total para o produto final pretendido
2. Introduzir genes de Resistncia adicional que permitam ao organismo no ser to afectado pelo antibitico
que ele prprio produz e produzir mais
3. Aumentar o transporte do antibitico para o exterior e assim diminuir o efeito txico que este possa causar

Um aumento da produo de antibiticos pode ser provocado por

mutao aleatria, sendo depois necessrio um rastreio eficiente
para seleccionar os mutantes com caractersticas desejadas, ou por
engenharia metablica.

N.B: O aumento da produo de certos metabolitos primrios para

promover a produo de um dado metabolito secundrio denomina-
se biossntese dirigida.

Podem ser inseridos determinados plasmdeos em outros

microorganismos que fazem com que estes, para l do antibitico
que j produziam, produzam um novo.
 Bem como se em vez de se transferir todo um fragmento cormossomal responsvel pela produo de um certo antibitico se pode somente transferir parte dele num
plasmdeo e assim permitir que organismos origine um outro antibitico.
Os actuais objectivos da produo de antibiticos so o combate a patognicos emergentes, a bactrias e fungos que desenvolveram resistncia aos antibiticos existentes,
a produo de antibiticos contra outros alvos como tumores, infeces virais e parasitas e o desenvolvimento de antibiticos broad sprectrum, contra maiores gamas de
patognicos.

Vitaminas esto na segunda posio do top de vendas da indstria farmacutica. Na produo de vitaminas geralmente s os passos relacionados com a escolha
de enantimeros (L ou D) so efectuados por processos biolgicos. E ainda que existam processos viveis da produo total de dada vitamina utilizando somente
microorganismos estes no so utilizados j que no so rentveis do ponto de vista industrial.
o Por exemplo o caso da sntese de Vitamina C utilizando converso microbiana todo o processo de transformao de D-glucose a cido L-ascrbico pode ser
realizado por microorganismos, no tento somente o passo de converso de D-sobrbitol para L-Sorbose (seleco de enantemeros) realizado recorrendo a
microorganismos
Polissacardeos
o Xanthan Gum um polissacrido usado para espessar, na indstria alimentar.
o Para o organismo que produz o polissacrido crescer, usado um desperdcio da indstria do leite/queijo soro do leite que tem lactose e glucose. No
entanto, o organismo incapaz de metabolizar lactose naturalmente, pelo que foi inserido o opero lac neste.
Polisteres procuram encontrar-se novas propriedades e assim produzirem-se co-polimeros (compostos com as mesma propriedades que os plsticos) fazendo-
se alteraes nas vias metablicas.
o Por exemplo existe um microorganismo que produz um polmero com semelhanas a plstico, mas biodegradvel. O organismo lento a crescer e alimenta-
se de acares caros. Assim foram passados 3 genes da produo deste bioplstico para E.coli.

2
3 Produo de enzimas (protases, quimosinas recombinantes, lpases)
o Por exemplo a subtilisina uma protena valiosa visto que utilizada em todos os detergentes. Desta forma, procura-se melhorar as suas caractersticas, como a
sua resistncia a altas temperaturas, o seu melhor funcionamento a pH alcalino ou o facto de ser resistente s lixivias.
o Porque que a mutagnese importante na modificao gentica das enzimas (engenharia das protenas)?
Permite a anlise das funes proteicas
Permite a anlise da estrutura proteica (mapear os domnios e entender as suas caractersticas)
E assim permite a engenharia das protenas, na medida em que estudar:
A relao entre a estrutura e funo das protenas
O centro cataltico
Novos designs de protenas que possuem novas caractersticas
 At a alterao de um nico resduo pode alterar significativamente a actividade de um protena e assim aumentar grandemente a sua aplicao na industria
por exemplo a alterao de um Asp para uma Ser na posio 99 (perto do centro activo) na subtilisina aumentou a sua activadade consideravelmente a pH mais
elevados.

o A modificao de enzimas pode ser feita de duas formas:

Mutagnese aleatria ( necessrio um rastreio eficiente e rpido) mutao aleatria do gene codificante da enzima. Este processo no requer o
conhecimento da sequncia do gene, mas exige a realizao de um rastreio eficiente. Exemplos de processos:
Error Prone PCR basicamente um PCR mal feito que cria mutaes aliatrias
DNA shuffling possumos vrias cpias de um mesmo gene ancestral pertencentes a espcies diferentes:
1. Cortamos cada um desses fragmentos com uma DNAse (DNAsei ) e obtemos diversos fragmentos
2. Faz-se PCR sem primers, onde ocorre a extenso com a ajuda da polimerase e se d origem a genes quimricos
3. Por ltimo necessrio um rastreio eficiente
Mutagnese dirigida ( necessrio conhecer a sequncia) aqui a mutao consiste na substituio ou alterao de uma sequncia especfica de amino-
cidos. Neste caso necessrio o conhecimento da sequncia do gene. Figura 4: Esquema da supresso de uma side streem, em que G o produto de
interesse. As caractersticas da enzima podem ser alteradas por meios qumicos ou enzimticos na prpria enzima purificada. Exemplos de processos:

Site-Directed Mutagens PCR based Method a enzima DpnI s actua quando o DNA Directed Enzyme Evolution encontram-se a seguir indicados os passos
est metilado, ou seja s vai cortar os plasmdeos que vieram da E. coli (cujo DNA no essenciais para que este processo ocorra.
mutado) porque o plasmdeo mutado no est metilado no cortado
 Agricultura
Biopesticidas
o Bacillus thuringiensis (Bt) uma bactria Gram positiva, formadora de esporos. No processo de esporulao so formadas incluses proteicas cristalinas
txicas (prototoxinas Cry estas toxinas tm 3 domnios estruturais: um envolvido na insero na membrana e formao do poro e uns segundo e
terceiro envolvidos no reconhecimento e ligao ao receptor)
o Modo de aco insecticida:
1. Ingesto da bactria pelo insecto e dissoluo dos cristais de Cry no intestino
2. Proteases intestinais clivam as toxinas Cry, activando-as
3. As toxinas activadas associam-se a receptores especficos das clulas epiteliais do intestino, e formam poros na membrana, que levaro a uma
morte lenta do insecto.
o Os receptores presentes nas clulas epiteliais do intestino, responsveis pela adsoro das toxinas na membrana variam de uma espcie de insecto para
outra. A manipulao de estirpes de Bt permite a eliminao selectiva de certos insectos, o que constitui uma vantagem, do ponto de vista ecolgico, em
relao a outros insecticidas, nomeadamente no combate a pragas.
N.B: Preparaes de Bt (ou s de toxinas Cry) so 300 a 80000 vezes mais eficientes do que insecticidas convencionais.