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Universidad de San Carlos de Guatemala Ingeniera en Alimentos

Centro Universitario de Suroccidente Bioqumica I

PRACTICA No. 1
PROPIEDADES INICAS DE LOS AMINOACIDOS

En solucin acuosa neutra, los aminocidos se encuentran en forma de iones bipolares o


zwitteriones, y cristalizan, de estas soluciones, formando cristales en los que el aminocido
posee la misma estructura de in dipolar:

H H
R-C-COOH R-C-COO-
NH NH +
Forma sin disociar Ion dipolar o zwitterin

Cuando un aminocido cristalino, en forma de in dipolar, es disuelto en agua, puede actuar


ya sea como un cido (donador de protones) o como una base (aceptor de protones), de
acuerdo a las reacciones:

Como cido: 3H + N - CH COO- __________ H + HN - CH COO-


R R

Como Base: 3H + N - CH - COO- + H + 3H + NCH - COOH


R R

Sustancias que tienen esta propiedad se conocen como substancias anfotricas o anfolitos.
Algunos aminocidos poseen adems otros grupos ionizables, situados en el radical R, que
esta unido al carbono alfa (Grupos p-hidroxifenil, sulfhidrlo, guanidino, imidazol, carboxilo y
amino). Cada uno de estos grupos posee propiedades cido base.

En este experimento se estudiara el comportamiento del aminocido glicina, en cuanto a sus


propiedades cido- base.

Materiales:
Solucin de glicina al 1.5%
Hidrxido de sodio 0.2N
Acido sulfrico 0.2N
Potencimetro
Bureta

Procedimiento:
1. Titular 25 ml de agua destilada, con cido sulfrico 0.2 N, utilizando una bureta y el
potencimetro. Anotar el pH inicial antes de empezar a agregar el cido. Efectuar la
titulacin, agregando suficiente cido para que el pH cambie 0.2 unidades cada vez.
Anote la cantidad en mililitros de cido agregados para obtener dichos cambios de pH.
Titule hasta llegar a un pH de 1.2.
2. Titular en la misma forma, siempre con cido sulfrico 0.2 N, 25 ml de una solucin de
glicina al 1.5%. Titular hasta llegar a un pH de 1.2 o hasta emplear ms de 5 ml de cido
para disminuir el pH en 0.2 unidades.

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3. Titular 25 ml de agua destilada, con hidrxido de sodio 0.2 N, utilizando la bureta y el


potencimetro. Anotar el pH inicial antes de empezar a agregar la base. Efectuar la
titulacin agregando suficiente base para el pH cambie 0.2 unidades cada vez. Anote la
cantidad en mililitros de base agregados para obtener dichos cambios de pH. Titule hasta
llegar a un pH de 12.0
4. Titular en la misma forma, siempre con hidrxido de sodio 0.2N, 25 ml de una solucin de
glicina al 1.5%. Titular hasta llegar a un pH de 11.0 o hasta emplear ms de 7 ml de base
para aumentar el pH en 0.2 unidades.

Presentacin de resultados:
Para determinar cul es la curva de titulacin se necesita saber cuanto titulante se usa para
titular el solvente, en este caso agua, a cada valor de pH. Este valor se resta de cantidad
total de titulante usado para obtener ese pH, en la titulacin del aminocido.

1. Representar por medio de un grafico, el volumen de cido aadido en funcin del pH


alcanzado, tanto en la titulacin de la muestra como en la del agua.
Represntese ambas titulaciones en la misma grfica.
2. Restar ambas graficas y la diferencia representa el volumen de cido consumido en la
titulacin de la glicina.
3. Repetir los pasos anteriores, con los datos de la titulacin de agua y glicina con hidrxido
de sodio.
4. Representar en una sola grfica la curva de titulacin total y corregida de la glicina, tanto
con el cido como con la base, utilizando en el eje de las ordenadas pH y en el de las
abscisas los miliequivalentes de cido y de base usados.

Cuestionario:
1. De acuerdo a su curva de titulacin obtenida, indique los valores de pH para los grupos
alfa-amino y alfa-carboxilo de la glicina.
2. Indique la estructura de los otros grupos ionizables presentes en los aminocidos, que
tienen propiedades cido-base. Para cada uno de ellos indique cul es la ecuacin del
par conjugado.
3. Escriba la estructura de la glicina a pH 1, 7 y 12. Indique cul es el pH isoelctrico de este
aminocido.

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PRACTICA No. 2
SEPARACION E IDENTIFICACIN DE
AMINOACIDOS POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

La cromatografa se puede definir como la tcnica de separacin de una mezcla de solutos,


basndose esta separacin en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los
solutos a travs de un medio poroso, arrastrados por un disolvente que se desplaza en una
direccin predeterminada. El medio poroso est constituido por un material slido, insoluble,
orgnico o inorgnico. Mas o menos finamente dividido.

En la mayora de los mtodos cromatogrficos la separacin est basada en un proceso de


reparto mltiple (Particin mltiple) o uno continuo de adsorcin- desorcin. Aunque en la
prctica existe una combinacin de ambos, dominando ms o menos uno u otro tipo.

La cromatografa de reparto (Particin), como su nombre lo indica, est basada en la


separacin de una mezcla de substancias y la fase estacionaria, soportada sobre un slido
adecuado.

La cromatografa de adsorcin se basa en la diferencia de un comportamiento que presentan


las substancias, contenidas en un disolvente mvil, en lo que respecta a su adsorcin y
desorcin sobre un slido estacionario. La adsorcin es un fenmeno de superficie, que se
manifiesta por un aumento en la interfase que rodea el medio estacionario. En el sentido
cromatogrfico el trmino absorcin se limita a las interacciones que implican enlaces de
hidrgeno o fuerzas electrostticas. Cuando las interacciones son jnicas el proceso se
denomina intercambio jnico.

En la cromatografa de absorcin existe, como mnimo, un sistema de tres componentes:


Adsorbente, medio de elusin (Disolvente) y compuesto (A separar cromatogrficamente. El
comportamiento cromatogrfico depende tanto del adsorbente como del medio de dilucin en
capa fina, se encuentran xidos, xidos hidratados y sales.

Los ms populares son la gel de slice (silicagel) y el oxido de aluminio (almina).

Dos de las tcnicas mas empleadas en cromatografa son la cromatografa en papel la


cromatografa en capa fina4- La cromatografa en capa fina es mas utilizada en la actualidad,
debido a su gran rapidez y versatilidad. La separacin se hace sobre una capa fina de un
material adecuado. La cual est adherida a una placa de vidrio u otro material de soporte. El
disolvente utilizado para la separacin se mueve sobre esta capa fina, ya sea hacia arriba
por capilaridad (cromatografa ascendente). La separacin de las substancias se basa en sus
caractersticas la polaridad.

Por consiguiente, una sustancia polar se mover muy lentamente con relacin al frente de un
solvente apolar, mientras que una sustancia no polar se mover ms rpido. Bajo ciertas
condiciones experimentales, el movimiento de una sustancia en particular es constante, el
movimiento de una sustancia en particular es constante, con respecto al movimiento del
frente de un disolvente determinado. Esta constante se llama Valor Rf y se define como:

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Rf = Distancia recorrida por la muestra


Distancia recorrida por el disolvente.

En este experimento se identificar una muestra desconocida de un aminocido, por


cromatografa en capa fina, utilizando una capa de silicagel.

Procedimiento:
PRECAUCION: Durante todo el procedimiento, evitar tocar la capa de silicagel con los
dedos.
1. Activar una cromatoplaca de silicagel colocndola en un horno a 1100 C durante 15 30
minutos. Sacarla y dejarla enfriar.
2. Trazar una lnea paralela a uno de los extremos de la cromatoplaca, a una distancia de
1.5 cm, de separacin y numerarios 1 y 2.
3. Aplicar las siguientes soluciones en las marcas:

No. de marca Solucin


1 Mezcla de aminocidos
2 Muestra desconocida

Hacer dos aplicaciones de cada una de las soluciones, utilizando para ello tubos
capilares, y dejando secar la primera aplicacin antes de aplicar la siguiente. La
mancha de cada aplicacin no debe ser mayor de 2 mm. de dimetro.

4. Despus que las aplicaciones estn secas colocar la cromatoplaca en un recipiente, que
contenga en el fondo una capa de disolvente (n-propanol - agua, 7:3) y en una de las
paredes un pedazo de papel filtro con un extremo introducido en el disolvente. La
cromatoplaca se introduce con el extremo donde se aplicaron las muestras hacia abajo,
de forma tal que el nivel del disolvente quede por debajo de la lnea de aplicacin de las
muestras.
5. Cerrar el recipiente y efectuar la cromatografa hasta que el frente del disolvente ascienda
a una distancia aproximada de 10 cm. (30 - 40 minutos)
6. Remover la cromatoplaca del recipiente y marcar con un lpiz la posicin del frente del
disolvente, antes de que se evapore. Dejar secar la cromatoplaca a temperatura ambiente
primero y luego a 80 C.
7. Rociar las placas con un spray de ninhidrina (0.3 g. de ninhidrina en 100 ml de n-butanol y
3 ml de cido actico glacial). Secar la cromatoplaca a temperatura ambiente primero y
luego colocarla en un horno a 1100 C, durante 5 minutos.
8. Marcar alrededor de las manchas con un lpiz y mediar la distancia, en centmetros,
desde el centro de ellas a la marca inicial. Calcular el valor de Rf para todas manchas.
9. Con base en los valores de Rf obtenidos, identificar la muestra desconocida.

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PRACTICA No. 3
ALGUNAS PROPIEDADES FISICAS DE LAS PROTEINAS

En esta prctica se estudiaran algunas propiedades de solubilidad de las protenas en


relacin a su punto isoelctrico y al proceso de desnaturalizacin.

A. Punto Isoelctrico de la Casena:


Las protenas, al igual que los aminocidos reaccionan con cidos y bases (anfoterismo).
En soluciones fuertemente cidas, con un pH menor que el pH isoelctrico de la protena,
stas se asocian con iones H+, teniendo entonces carga positiva. En soluciones alcalinas,
pH mayor que el isoelctrico de la protena, estas liberan iones H+ y presentan carga
negativa. En el punto isoelctrico, la protena no tiene carga neta, por lo que se asocia
menos con el solvente y presenta neta, por lo que se asocia menos con el solvente y
presenta menor solubilidad. Esto hace posible estimar el punto isoelctrico de la casena.

Procedimiento:
Hacer 3 series de 9 tubos cada una.
A la primera serie de 9 tubos aadir 0.1 ml de sulfato de cobre de 2%.
A la segunda serie de 9 tubos aadir 0.1 de sulfato de sodio al 2%.
La tercera serie de tubos prepararla siguiendo las indicaciones como se muestra en el
cuadro de abajo, colocar primero la solucin de casena 0.5% en acetato de sodio 0.4 N y
luego el agua, mezclando en seguida. Luego aadir la cantidad indicada de cido actico
al tubo No. 1 y mezclar rpidamente. Observar. Colocar 1 ml en uno de los tubos con
sulfato de sodio. Notar si hay precipitado luego aadir la cantidad indicada de cido actico
al tubo No. 2 y repetir el proceso. Continuar igual con los otros 7 tubos.

Tubo No. 1 2 3 4 5 5 7 8 9
ml de casena 0.5% en acetato
1 1 1 1 1 1 1 1 1
de sodio 0.4 N
ml de agua destilada, mezclar 8.38 7.75 8.75 8.50 8.00 7.00 5.00 1.00 8.00
ml de cido actico 0.04 N
0.62 1.25 - - - - - - -
Mezclar
ml de cido actico 0.4 N - - 0.25 0.50 1.00 2.00 4.00 8.00 -
ml de cido actico 4 N - - - - - - - - 1.00

Luego de haber terminado la parte anterior, examinar los tubos con sulfato de cobre y
sulfato de sodio cada 10 minutos. Anotar las observaciones. Notar si hay opalescencia o
precipitado. Estimar la cantidad de precipitado por O, +, ++, +++, ++++. Calcular el pH
terico de cada tubo. Estimar lo ms cercano posible, el pH isoelctrico de la casena.
Informar en un cuadro as:
Tubo No. 1 2 3 4 5 5 7 8 9
Al mezclar
Mezclado con CuSO4
Na2SO4
Despus de 10 min
Despus de 20 min
pH calculado

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B. Desnaturalizacin:
1. Desnaturalizacin de la albumina:
Calentar una solucin de albmina de huevo sobre una llama de mechero, hasta que el
tubo este caliente, pero sin que hierva la solucin, luego aada 2 a 3 gotas de cido
actico al 1% a la solucin caliente, y observe el efecto.

2. Desnaturalizacin de la catalasa:

Mediante esta experiencia, vamos a ver una propiedad fundamental de protenas, que es
la desnaturalizacin.
Ya que la catalasa qumicamente es una protena, podemos desnaturalizarla al someterla
a altas temperaturas. Al perder la estructura terciaria, perder tambin la funcin y como
consecuencia su funcin cataltica, por lo que no podr descomponer el agua oxigenada y
no se observar ningn tipo de reaccin cuando hagamos la experiencia anterior con
muestras de tejidos hervidos.

1. Colocar en un tubo de ensayo varios trocitos de hgado.


2. Aadir agua para hervir la muestra. Hervir durante unos minutos.
3. Despus de este tiempo, retirar el agua sobrante.
4. Aadir el agua oxigenada.
5. Observar el resultado

Preguntas:

1. Qu es punto isoelctrico?
2. Explique los resultados obtenidos al mezclar CuSO4 y Na2SO4 con las soluciones
bufferizadas de casena.
3. Describa la estructura helicoidal de la cadena peptdico. indique el papel de los puentes
de hidrgeno.
4. Qu cambios ocurren en la molcula de protena durante la desnaturalizacin?

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PRACTICA No. 4
ALGUNAS PROPIEDADES QUMICAS DE LAS PROTEINAS

An cuando todas las protenas son compuestos formados por aminocidos unidos por
enlaces peptdico. Estas sustancias presentan variaciones considerables en sus propiedades
qumicas y biolgicas. El propsito de este experimento es para familiarizar al estudiante con
algunas propiedades qumicas comunes a las protenas, especialmente aquellas propiedades
por medio de las cuales las protenas se pueden diferenciar unas de otras.

La molcula de protena es tan compleja que es un poco difcil interpretar el comportamiento


qumico de estos compuestos. Las protenas reflejan las propiedades qumicas de los
aminocidos que stas contienen en su estructura. Muchas de las reacciones de color de las
protenas dependen de la presencia de un aminocido en su molcula. Las protenas o sus
derivados que se usarn en este experimento son:

Albmina de huevo (Ovo albmina), una de las principales protenas del huevo, casena la
principal protena de la leche, gelatina de protena muy conocida que puede extraerse del
tejido conectivo, peptona un grupo de sustancias complejas de peso molecular intermedio,
las cuales pueden ser obtenidas por hidrlisis de protenas y Glicina, un aminocido.

REACCIONES DE COLOR DE LAS PROTENAS

a) Reaccin de Biuret:
Para que se de esta reaccin tiene que haber 2 ms enlaces peptnicos. 1 como
mnimo.
El in cobre formar un complejo con las protenas de una manera similar al que forma
con el amonio. El complejo en el caso de las protenas es rojo o violeta, y azul en el caso
del amonio. Los aminocidos libres y los dipptidos no dan el color rojo o violeta; se
necesitan al menos dos uniones peptdicas para obtener dicha coloracin. La sustancia
ms simple que tiene esa estructura requerida es (NH 2CONH2)2 y se llama Biuret y esta
es la razn por la cual esta reaccin lleve el nombre de Biuret.

Parte experimental
Lleve a cabo la reaccin de Biuret en soluciones al dos por ciento de glicina, peptona,
casena, gelatina y albmina de huevo. A 2 cc. de las soluciones anteriores agregue 2 cc.
de hidrxido de sodio 6 N y una gota de solucin de sulfato de cobre al 0.5% mezcle bien
y agregue ms sulfato de cobre gota a gota hasta distinguir un color Rosado o violeta, sin
el color no aparece rpidamente deje reposar el tubo durante 10 15 minutos. Note
cualquier diferencia en el color obtenido en las diferentes soluciones.

Preguntas
1. Describa las bases qumicas de la reaccin.
2. Por qu debe ser alcalina la solucin?
3. Cul es el mnimo de aminocidos que deben estar presentes para que d positiva la
reaccin?
4. Escriba la formula del complejo que se forma

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5. Todas las protenas dan positiva la reaccin?


6. Explique por qu el amonio interfiere en la reaccin de Biuret.

b) Reaccin Xanto Proteica:


Esta reaccin es especfica para protenas que contienen aminocidos aromticos,
especialmente triptfano. Si se le agrega cido sulfrico al cido ntrico la fenilalanina
dar positiva esta reaccin.

Parte Experimental
Haga la reaccin en las soluciones al 2% de glicina, peptona, gelatina, casena y
albmina. Ponga 2 3 cc. de las soluciones en un tubo de ensayo y agregue de 2 a 3 cc.
de cido ntrico concentrado. Caliente a ebullicin muy lentamente o hasta que se
disuelva el precipitado que se form al agregar el cido, enfri la solucin y agregue
hidrxido de sodio 6 N en exceso. El color amarillo cambia a naranja.

Preguntas
1. Por qu el cido Ntrico colorea la piel de amarillo?
2. Todas las protenas da positiva la reaccin, Xanto Proteica?
3. Describa las bases qumicas de la reaccin.

c) Reaccin de Milln:
La reaccin es especfica para el grupo fenlico, el aminocido tirosina contiene este
grupo como parte integral de sus molculas. Como consecuencia, todas las protenas
que contienen este aa en su molcula darn positiva esta reaccin. El reactivo de
Milln es una mezcla de sales de mercurio, el cual se encuentra disuelto en cido
ntrico. El color que se observa al realizar la reaccin es debido a la formacin de
sales de mercurio del grupo cido del fenol.
Parte experimental: Colocar de 2-3 cc de las soluciones de protenas, agregue unas
pocas gotas del reactivo de Milln, caliente gradualmente la solucin y llvela a
ebullicin, la presencia de tirosina es indicada por el desarrollo de un color rojo el cual
permanece despus de la ebullicin. Si el color no aparece ser necesario agregar
ms reactivo de Milln, pero bajas concentraciones del reactivo son las deseables. El
color puede desaparecer si continua el calentamiento por lo cual es necesario hacer
gradualmente el calentamiento.
Preguntas:
- Describa las base qumicas de la reaccin?

d) Reaccin de Hopkins-Cole:
Las protenas que contengan triptfano darn positivas esta reaccin. El color es
debido a la condensacin del anillo de indel del triptfano con un aldehdo presente en
el reactivo.
Parte experimental:
Coloque de 2 a 3 cc de las soluciones de protenas en un tubo de ensayo y agregue 3
cc del reactivo (sal magnsica del cido glioxlico) y mezcle vigorosamente. En un
tubo de ensayo conteniendo la solucin de protenas, agregue cuidadosamente
(resbalado por las paredes del tubo) 5 cc de H2SO4 concentrado. Caliente en un bao

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de agua hirviendo por dos minutos y deje reposar, aparecer un color rojo violeta, este
aparece en la unin de las dos fases si el triptfano est presente.
Preguntas:
- Escriba la estructura del cido glioxlico
- Describa las bases qumicas de la reaccin.

e) Reaccin de Erlich-Diazo:
El cido sulfanlico diazotizado se condensa con el anillo fenlico e imidazlico de la
tirosina y de la histidina para dar productos coloreados. Con histidina se obtiene un
color cereza intenso y con la limosina da un color rojo naranja.
Parte experimental:
Coloque en un tubo de ensayo 1 cc de la solucin sulfanlico al 0.5 % en HCl al 2%,
agregue igual volumen del solucin de NaNO3 al 0.5 % mezcle bien y despus de
medio minuto agregue 1 cc de las soluciones de protenas, mezclar nuevamente y
agregar NH4OH NH4 CO3 hasta hacer alcalina la mezcla. La histidina da un color
rojo naranja y la tirosina da un color naranja.
Preguntas:
Describa las bases qumicas de la reaccin.

f) Reduccin del Sulfuro:


Las protenas que contienen cistena o cistina, cuando son tratadas con lcalis fuertes,
formarn H2S, el cual puede se detectado por la formacin de sulfuro de plomo de
color negro e insoluble o por su caracterstico olor a huevo podrido.
Parte experimental:
A 2 cc de las soluciones de protenas agregue dos veces el volumen de NaOH 6 N.
Coloque alrededor de cc de solucin de acetato de plomo al 2 %, caliente a
ebullicin durante 3-5 minutos. Puede ser necesario dejar enfriar la solucin para que
deposite el sulfuro de plomo.
Preguntas:
- Escriba las reacciones qumicas para la reduccin del sulfuro tal como se lleva
a cabo con la cisterna.

g) Reaccin de Molisch:
La reaccin de Molisch es general para Carbohidratos. Como consecuencia, las
glucoprotenas, dan positiva esta reaccin, por ser protenas conjugadas que contienen
como grupo prosttico carbohidratos. En esta reaccin los carbohidratos son
deshidratados por cidos fuertes a furfural o derivados del furfural el cual se condensa
con el alfanaftol para formar un producto coloreado rojo violeta.

Parte experimental
A 2 cc. de las soluciones de protenas agregue 2 gotas de solucin de alfanaftol al 5% en
etanol y cuidadosamente agregue cido sulfrico resbalndolo por las paredes del tubo
para formar dos capas. En la unin de las dos capas aparecer un anillo rojo violeta, el
cual indica la presencia de carbohidratos.

Preguntas
- Describa las bases qumicas de la reaccin.

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h) Deteccin de fsforo:
Las protenas conjugadas las cuales contienen como grupo prost0tico al fsforo,
cuando se ponen a digerir con H2SO4 se libera fosfato inorgnico, el cual puede ser
detectado por la formacin del fosfomolibdato de amonio de color amarillo.
Parte experimental:
Pipete 5 cc de las soluciones de protenas en un tubo de ensayo largo (NNP) y
agregue 1 cc de H2SO4 6 N y concentre la solucin por ebullicin en la llama directa
(agite continuamente el tubo para evitar las proyecciones) si ocurre un exceso de
vapores, esto se puede evitar con la adicin de una gota de alcohol octlico. Contine
calentando hasta que los vapores blancos del trixido de azufre aparezcan. La
protena puede carbonizarse en este punto. Agregue cuidadosamente una gota o dos
de HNO3 conc. Colocando la boca del tubo de ensayo en sentido contrario a donde se
encuentran sus compaeros. Caliente nuevamente para lograr el punto de
carbonizacin, y repita la adicin de HNO3 . Contine calentando hasta que la solucin
sea incolora. Cuando los vapores del trixido de azufre sean visibles en el tubo.
Enfre y agregue 5 cc de agua destilada, aada NH 4OH hasta que la solucin sea
alcalina. Ajuste la solucin nuevamente con H2SO4 6N y acidifquela, caliente la
solucin a 700C y agregue 2 cc del reactivo de molibdato de amonio. Deje reposar, la
aparicin de un precipitado amarillo indica la presencia de fsforo.
Preguntas:
- Qu clase de prote nas contienen fsforo?
- Nombre de tres protenas que contengan fsforo.
- Describa qu clase de unin existe entre la protena y el fsforo.
- Describa la reaccin que se verifica para la deteccin de fsforo.
-
REACCIONES DE PRECIPITACIN DE LAS PROTEINAS

a) Coagulacin por el calor


Muchas protenas son inestables a temperaturas arriba de los 500 C. A estas
temperaturas la molcula sufrir ciertos cambios que la harn menos soluble en agua.
Ciertas protenas al calentarlas precipitan y forman agregados insolubles. Esta
propiedad de las protenas se llama coagulacin.

Parte Experimental
Aada 1 cc. de solucin de cloruro de sodio al 5% a 2 3 cc. de las soluciones de
protenas. Caliente a ebullicin y observe la cantidad de coagulacin en cada tubo.

Preguntas
- Explique las diferencias entre coagulacin y desnaturalizacin.
- Todas las protenas coagulan con el calor?

b) Precipitacin de protenas por reactivos alcaloides:


A esta clase de reactivos se eles llama de esa forma porque tienen la propiedad de
precipitar a los alcaloides. Cantidades pequeas de estos reactivos como cido tnico,
cido pcrico, cido saliclico, cido metafosfrico y cido tricloroactico. Las uniones

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de estos cidos se combinan con las protenas ( las cuales tienen carga positiva neta
en el lado cido del punto isoelctrico), para formar complejos insolubles en los cuales
la protena y los aniones estn unidos por uniones electrostticas. Estas reacciones
son muy usadas para separar a las protenas de fluidos biolgicos.
Parte experimental:
Colocar en tubos de ensayo 5 cc de las soluciones de protenas, acidifique con cido
actico, y agregue 2 cc de cido pcrico concentrado.
Repita el procedimiento colocando esta vez 2cc de cido tricloroactico al 10 %. Anote
los resultados obtenidos.
Preguntas:
- Describa un mtodo por medio del cual pueda preparar una solucin libre de
protenas de un fluido biolgico tal como la sangre.
- Indique cul de los dos medios cido o alcalino favorece la precipitacin de las
protenas por reactivos alcaloidales. Razone su respuesta.

c) Precipitacin de Protenas por formacin de sales de metales pesados


Ciertas protenas en el lado alcalino de su punto isoelctrico se combinan con metales
pesados para formar protenatos metlicos insolubles.

Parte experimental
A 5 c.c.. De las soluciones de protenas agregue muy lentamente una gota de una
solucin de cloruro frrico 1%, observe el resultado en los diferentes tubos, y luego
agregue un exceso de cloruro frrico al 1%. Repita usando sulfato de Cobre al 2%,
nitrato de plata al 2%. En el caso del sulfato de cobre agregue unas pocas gotas de
hidrxido de sodio 6 N cada tubo.

Preguntas
lndique qu medio si el alcalino o el cido favorecen la precipitacin de protenas.
Razone su respuesta.
Servira la clara de huevo como antdoto contra envenenamiento por metales pesados?
Para cul de los metales anteriores servir ms? Razone su respuesta.

d) Precipitacin de Protenas por cidos Minerales Fuertes


Los cidos minerales fuertes desnaturalizan ciertas protenas y causan que ellas se
vuelvan insolubles en soluciones acuosas. Esta propiedad de las protenas es
frecuentemente usada en clnica, para determinar s la albmina esta presente en la
orina.

Parte Experimental
A 3 cc. De una solucin de clara de huevo, agregue cido ntrico concentrado
resbalando ste por las paredes del tubo para formar una capa debajo de la solucin de
protenas. Observe el precipitado que se forma en la unin de las capas. Repita la
reaccin con cido clorhdrico concentrado. Lleve a cabo esta reaccin con una solucin
de peptona y una de gelatina.

Preguntas
Es la albmina una constituyente normal de la orina?

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Qu es el anillo de Heller?

e) Salting out de Protenas:


Las protenas son menos solubles en soluciones de alta densidad inica de tal forma
que algunas de ellas pueden ser: Precipitadas por la adicin de una sal ionizada muy
soluble. El sulfato de amonio es frecuentemente usado para estas reacciones de salting
out, pero el sulfato de sodio es tambin usado. Las globulinas son precipitadas por
media saturacin de sulfato de amonio; Las albminas precipitan con soluciones
saturadas de sulfato de amonio. La albmina de huevo cruda contiene globulinas, las
cuales pueden ser separadas de la albmina por este mtodo.

Parte Experimental
Ponga 25 ml de agua destilada en un beacker y agregue lentamente con agitacin, 1g
de albmina de huevo. Agite por varios minutos y deje reposar durante 5 minutos. Filtre
la solucin a travs de un papel filtro. Si la solucin de albmina est ya preparada
pipetear 5 ml y contine con el mismo procedimiento. Pipetee 5 ml. del sobrenadante y
pngalos en un tubo de centrifuga de 12 ml. Agregue 5 ml de solucin saturada de
sulfato de amonio. La solucin estar ahora media saturacin con sulfato de amonio.
Agite el tubo y note la aparicin de una nubosidad en la solucin, debido a la
precipitacin de las globulinas presentes en la clara. Deje descansar el tubo por 5
minutos y entonces centrifugue por 10 minutos. Ponga el sobrenadante en un segundo
tubo de centrifuga y vaya agregando pequeas cantidades de sulfato de amonio slido
con vigorosa agitacin, hasta que la solucin este saturada con sulfato de amonio.
Cuando la solucin esta saturada algunos cristales de sulfato de amonio puede ser
observados. Centrifugue la solucin por 10 minutos, para colectar la albmina.

Preguntas
Cul es la diferencia entre albmina y globulina?

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PRCTICA No. 5
ALGUNAS PROPIEDADES QUMICAS DE LOS CARBOHIDRATOS

Los carbohidratos se definen Como polihidroxialdehdos o Cetonas y sus derivados. Los


monosacridos, tambin llamados azcares simples, consisten de una sola unidad de un
polihidroxialdehdo o cetona. Los oligosacridos contienen de dos a diez unidades de
monosacridos, unidos a travs de enlaces glucosdicos. Los polisacridos contienen
muchas unidades de monosacridos unidos en largas cadenas lineales o ramificadas.

Existen algunas reacciones generales de los carbohidratos, tales como el test de Molisch,
que son utilizadas para identificar la presencia de carbohidratos, incluso glucoprotenas.
Otras reacciones son utilizadas para demostrar la presencia de carbohidratos reductores,
basndose casi todas ellas en la reduccin del in cprico, en medio alcalino, para formar
xido cuproso (Test de Benedict, Fehling, etc.). Los carbohidratos reductores se caracterizan
por poseer sus grupos aldehdos o cetnicos libres, es decir que no forman parte de uniones
glucosdicas. En los carbohidratos los grupos aldehdicos y cetnicos se encuentran en forma
de hemiacetales, por lo que su poder reductor tambin vara entre los diferentes tipos de
carbohidratos (aldosas y cetosas, monosacridos y disacridos), por lo que el tiempo en que
se realiza la reduccin del cobre, a una temperatura controlada, permite identificar en una
muestra el tipo de carbohidratos reductor que se encuentra presente. La identificacin
precisa de un determinado carbohidratos requiere de la preparacin de derivados cuya forma
cristalina a punto de fusin sean determinables, o bien de la utilizacin de mtodos
cromatogrficos.

Los monosacridos y disacridos pueden deshidratarse con cidos minerales fuertes, con la
formacin de furfural o derivados de ste. Esta propiedad se utiliza con fines analticos, ya
que los furfurales reaccionan con compuestos fenlicos, como el alfa-naftol o la resorcina,
para dar complejos coloreados, que se pueden medir colorimtricamente.

Los azcares reductores (aldosas y cetosas) reaccionan con la fenilhidrazina, para formar
cristales de formas caractersticas, llamados osazonas. La observacin de estos cristales, en
el microscopio, permite la identificacin tanto de microorganismos como de carbohidratos.

Algunos polisacridos dan colores caractersticos con el yodo en solucin. El almidn da un


color negro azulado, mientras que el glucgeno, dextrinas y amilopectina dan un color violeta
rojizo.

Los oligosacridos y polisacridos pueden ser convertidos en monosacridos por medio de


una hidrlisis cida o enzimtica. El curso de la hidrlisis se puede seguir por el cambio
gradual de color producido por el yodo y por el aumento en la concentracin de azcares
reductores.

Reactivos
1. Soluciones al 1 % de:
- Manosa

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- Glucosa
- Galactosa
- Fructosa
- Ribosa
- Maltosa

2. cido sulfrico concentrado


3. Solucin de alfa-naftol al 5 %
4. Solucin de Benedict
5. Reactivos de clorhidrato de fenilhidrazina y acetato de sodio
6. Solucin de 23 mM de fosfato de sodio y 6.6 mM de cloruro de sodio, pH 6.8
7. Solucin de almidn al 1 %: calentar 80 ml de buffer de fosfato de sodio y cloruro de
sodio, pH 6.8. Al estar en ebullicin, agregar 1 g de almidn soluble (suspendido en 20 ml
del mismo buffer). Mantener en ebullicin por un minuto y despus enfriar a temperatura
ambiente. Mantener en refrigeracin.
8. Solucin de amilasa al 1 %: macerar 0.1 g de amilasa (5 000 unidades SKB/g) en 10 ml
del buffer

Procedimiento
1. Test de Molisch
Colocar en un tubo de ensayo 2 ml de la solucin que contiene la muestra de
carbohidratos. Aadir 2 gotas de solucin de alfa-naftol al 5 %, directamente en la
solucin de carbohidratos y mezclar. Agregar 3 ml de cido sulfrico concentrado,
resbalndolo por las paredes del tubo, con el objeto de formar dos capas. En la zona de
separacin aparecer un anillo rojo violeta, el cual indica la presencia de carbohidratos.

2. Test de fermentacin
Preparar una serie de tubos (12 x 75 mm) etiquetados y aadirles 2 ml de las soluciones
de (fructosa, maltosa y glucosa al 1 %). Aadir a todos los tubos una pequea cantidad
de levadura seca y suficiente cantidad de agua destilada para cubrir la campana de
durham, asegurndose que la campana este completamente llena de la solucin. Tapar el
tubo con un corcho y dejarlo en reposo, a temperatura ambiente, durante dos a tres
horas, haciendo una marca a la altura de la solucin antes de dejarlo este tiempo. La
prueba ser positiva se aparece una burbuja de gas en el interior de la campana de
durham o si hay desplazamiento de la campana.

3. Hidrlisis de almidn
3.1 Hidrlisis enzimtica
Colocar, en un Erlenmeyer de 125 ml, 5 ml de la solucin de almidn al 1 %.
Agregar 1 ml de la solucin de amilasa diluida, mezclar, e inmediatamente despus
tomar 1 ml de la mezcla, colocndolo en un tubo de ensayo marcado como tiempo
0.
Introducir inmediatamente el tubo en un bao de agua hirviente y mantenerlo all por
dos minutos. Al cabo de este tiempo, sacar el tubo y dejarlo enfriar.

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5 minutos despus de haber agregado la amilasa, mezclar nuevamente y sacar otra


alcuota de 1 ml, colocndola en otro tubo de ensayo, marcado como tiempo 5.
Repetir con este tubo el procedimiento indicando en el paso C.
Obtener otras alcuotas a los 10, 15 y 20 minutos, en la misma forma como se indic
anteriormente.
Agregar a todos los tubos 0.1 ml de reactivo de Lugol diluido y observar las
coloraciones obtenidas.

3.2 Hidrlisis cida


A 2 ml de solucin de almidn al 1 % aadir 0.5 ml de cido clorhdrico 6 N. Mezclar.
Calentar el tubo en bao de agua hirviente, durante 10 minutos. Enfriar.
Transferir 1 ml de la mezcla a otro tubo de ensayo. Colocar en otro tubo de ensayo 1
ml de la solucin de almidn al 1 %.Aadir a cada tubo una solucin de hidrxido
de sodio, gota a gota, hasta obtener un pH alcalino 7 8.
Agregar a cada tubo 2 ml del reactivo de Benedicto. Mezclar y calentar los tubos en
un bao de agua hirviente, durante 5 minutos. El desarrollo de un color verde,
amarillo o rojo indica la presencia de azcares reductores.

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PRACTICA No. 6
HIDROLISIS DE POLISACARIDOS

La hidrlisis de una macromolcula puede Llevarse a cabo usando diversos procedimientos:


catalizando con cidos o bases fuertes, con catalizadores inorgnicos u orgnicos o
mediante enzimas hidrolticas adecuadas. En esta prctica se ilustran algunos de estos
mtodos, verificando la produccin de la reaccin mediante reacciones cualitativas. Podr
compararse no slo la diferencia de tiempo requerido en cada mtodo, sino tambin la gran
diferencia en las condiciones requeridas para que se verifique la hidrlisis.

Reactivos
1. Solucin de almidn soluble, al 2%.
Para preparar 100 ml, pese 2 g de almidn, mzclelos bien con un poco de agua
destilada, mientras hace hervir 90 ml de agua aproximadamente. Cuando haya formado
una pasta con el almidn humedecido, agregue a dicha pasta el agua hirviendo, agitando
intensamente. Deje enfriar un poco y complete a 100 ml. Filtre si es necesario.
2. HCI concentrado - 50 ml.
3. NaOH al 20%- 100 ml.
4. Solucin indicadora de lugol.
Mezcle bien 2 g de KI y 1 g de Yodo; disuelva esta mezcla en agua destilada, calentando
ligeramente si es necesario. Complete a 100 ml.
5. Reactivo de Lucas
Disuelva 136 g de ZnCl2 en 89 ml de HCI concentrado.

Material Biolgico
Saliva (amilasa salival): Recolectar unos 25 ml de saliva, filtrada a travs de gasa y evitando
que tenga espuma.

Procedimiento

1. Hidrlisis cida del almidn


En un vaso de 100 ml coloque 20 ml de disolucin de almidn al 2%.
Agregue 20 gotas de HCI concentrado y caliente de modo que hierva suavemente.
Agite continuamente. Cada cinco minutos tome, con una varilla de vidrio, una gota y
depostela sobre una excavacin en una placa de porcelana.
Agrguele una gota de lugol y anote el color que se produce. Contine calentando hasta
que ya no se produzca color azul con el yodo, lo cual indica que la hidrlisis se ha
completado.

2. Hidrlisis cida, catalizada, de la celulosa


Coloque en un mortero pequeo, un trozo de algodn bien desmenuzado o varios
pedacitos pequeos de papel filtro.
Agregue 3 ml de reactivo de Lucas y caliente durante 1 minuto, agitando enrgicamente.
Deje enfriar y neutralice con NaOH al 20%. Coloque la solucin en un tubo pequeo y

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verifique la reaccin con lugol. Si la hidrlisis no fue completa, repita el procedimiento


calentando durante dos minutos.

3. Hidrlisis enzimtica del almidn.


En un tubo de ensayo ponga 1 ml de saliva y 1 ml de agua destilada. Introduzca el tubo en
un bao de agua mantenido a 40 C y agregue rpidamente 2 ml de disolucin de almidn
al 2%. Mantngala en el bao durante media hora, agitando cada 5 minutos. A los 15
minutos y a la media hora, verifique en porciones de 0.5 ml la reaccin de lugol.

Resultados
Los colores que se obtienen con con lugol deben interpretarse as:
Color azul, lila o negro: AlmidnHidrlisis ()
Color rojizo: AcrodextrinaHidrlisis parcial.
Color amarillo como el del lugol: Reaccin () Hidrlisis total.
Tiempo requerido para la hidrlisis cida del almidn: ______________________________
Resultados de las pruebas en la hidrlisis de celulosa: _____________________________
Hidrlisis enzimtica: a) Color a los 15: _________________________________________
b) A lo s 30: _____________________________________________

Preguntas

1. Cules son los productos de la hidrlisis parcial y total del almidn y de la celulosa?

2. Qu son la amilosa y la amilodextrina? En qu se diferencian?

3. Cul es el mecanismo de la accin cataltica del reactivo de Lucas?

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PRACTICA No. 7
EXTRACCION Y SEPARACION DE ALGUNOS LIPIDOS

En esta prctica se inicia el alumno en las tcnicas de aislamiento de lpidos a partir de


materiales biolgicos, lo cual es de especial inters en numerosos tipos de estudios
bioqumicos. Adems (le la extraccin de lpidos totales, se extraen y separan dos grupos de
lpidos muy importantes, ambos conocidos como fosfolpidos, por contener fsforo: lecitinas y
cefalinas. Se efectuar tambin la extraccin de colesterol, por ser uno de les esteroides de
mayor importancia en nutricin y bioqumica de esteroides. Por tratarse de procedimientos
relativamente largos y cuidadosos, el alumno podr escoger dos de los tres que se
describen, para realizarlos.

Reactivos

1. Disolventes orgnicos: acetona, cloroformo, etanol, ter de petrleo y ter etlico (200 ml
de cada uno). Mantnganse perfectamente tapados y en recipientes secos.
2. Sulfato de sodio anhidro (100 g).

Materiales biolgicos:
1 yema de huevo, un hgado de rata, pollo o conejo; un cerebro de conejo.

Procedimiento
1. Extraccin y separacin de lecitina y cefalina de huevo
Separe la yema de un huevo en un vaso de precipitados de 100 ml o en un matraz
erlenmeyer de 100 ml. Agregue ter hasta cubrir totalmente la yema y agite con una
varilla de vidrie para homogeneizar bien. Agregue lentamente y sin dejar de agitar, un
volumen de acetona igual al de ter. Se observar que la acetona provoca la precipitacin
de los fosfolpidos, en tanto que las grasas y el colesterol permanecen disueltos. Filtrar,
despus de dejar en reposo unos minutos. El precipitado que contiene lecitina y
cefalina se lava con alcohol bien fro, recibiendo el filtrado en un tubo seco y limpio. La
lecitina es ms soluble en el alcohol fro por lo tanto queda en el filtro nicamente
cefalina, Para obtener la lecitina, evapore el alcohol lentamente en bao de vapor. Deje
secar los dos precipitados y pselos.

2. Extraccin de lpidos totales del hgado


Pese el hgado del animal y anote este peso. Corte el tejido en fragmentos pequeos y
pngalos en un mortero, con dos veces su peso de sulfato de sodio anhidro. Muela la
mezcla en e mortero hasta obtener una pasta homognea. Agregue 1 ml de alcohol y
continu homogeneizando. Transfiera la papilla a un matraz erlenmeyer ayudndose con
3 porciones ms de alcohol, de 5 ml de cada una, de modo que quede limpio el mortero.
Coloque el matraz en un bao de agua a 70C y man tngalo agitando a esa temperatura
durante 10 minutos. Deje enfriar y agregue 10 ml de ter etlico para completar la
extraccin; agite bien y deje reposar hasta que se asiente bien. Filtre el sobrenadante por
decantacin y agregue al residuo otra porcin de 10 ml de mezcla alcoholter en

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proporcin 3: 1; que se calienta a 70C y se filtra en la misma forma. Repita por tercera
vez la extraccin con otros 10 ml de mezcla alcoholter.
Evapore el ter de los filtrados reunidos, colocando el matraz en el bao caliente, sin
flama, hasta que ya no se desprenda olor a disolventes. Enfre el matraz y agregue 10 ml
de ter de petrleo, agitando, para volver a disolver los lpidos. Filtre, recibiendo el filtrado
en una probeta seca y lavando el residuo con ter de petrleo hasta completar su
volumen total de filtrado de 25 ml.

3. Extraccin de colesterol, del cerebro


Decapitar al conejo y extraer e cerebro lo ms rpida y limpiamente posible. Pesar el
cerebro sobre un vidrio de reloj previamente tarado. Homogeneizar en un
homogeneizador de vidrio. Agregar al homogeneizado 10 ml de acetona, agitando con
una varilla de vidrio, durante 10 minutos. Centrifugar a 2000 rpm, durante 1 minuto.
Transferir el sobrenadante a un matraz de 25 ml. con tapn esmerilado (no debe usarse
tapn de plstico o hule). El residuo se vuelve a extraer dos veces, con porciones de 5 ml
de acetona, en igual forma. Se renen los 3 extractos y se concentran hasta un volumen
de 1/5 del original, evaporando lentamente en bao de vapor (sin flama). El residuo se
deja enfriar en el refrigerador durante toda la noche para que precipite todo el colesterol.
El precipitado se vuelve a disolver en 2 ml de acetona, se filtra y se recristaliza. El
producto seco se pesa para determinar el rendimiento a partir del peso del cerebro.
Efecte la reaccin de Lieberman-Burkhard (adicionar 10 gotas anhdrido actico y 2
gotas de H2SO4 conc. Mezclar suavemente, verificar cambio de color) para verificar que
se extrajo colesterol. Para purificarlo ms, y tambin con fines de identificacin puede
efectuarse una cromatografa en capa delgada, en un portaobjetos recubierto con gel de
slice, corriendo el cromatograma en una mezcla de cloroformo-metanol-agua (65:
25:4). El revelado se hace con vapores de yodo.

Preguntas
1. Escriba las frmulas estructurales de todos los productos de hidrlisis de la1 - - lecitina
(dioeil fosfatidil colina).
2. Escriba la frmula general de una cefalina
3. En qu consiste la condicin patolgica conocida como hgado graso, y cules son sus
causas ms frecuentes?

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BIBLIOGRAFIA

1 LEHNINGER, A. 1981. Bioqumica. Las bases moleculares de la estructura y funcin


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XIV, Vol. 1, 141 p.
3 BOHINSKY, R.C 1987. . Bioqumica. Traci. Valenzuela M.A. y Puente J. Mxico.
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4 STRYER, L. 1976. Bioqumica. RoselI M. Revert, Espaa, 875 p

5 MARTIN, D. W. 1882 Bioqumica de Harper. 8. Ed. Trad. Casolio M. R. Mxico. El


Manual moderno, 636 p.

6 HERNANDEZ, L. R. 1979. Bioqumica experimental. Manual experimentos de


Bioqumica General. Editorial LIMUSA, Mxico.

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