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INTRODUCCIN

La microbiologa es el estudio de los organismos microscpicos y de sus


actividades. Cuando partimos para esta disciplina, debemos considerar
que varios microorganismos pueden provocar infecciones, y que las
mismas tambin son las formas de diagnstico e identificacin de los
agentes etiolgicos de estas enfermedades. Para identificarlos, debemos
analizar su morfologa, estructura, reproduccin, fisiologa y
metabolismo. Dentro de estas se evalan tambin los conceptos de
distribucin natural, sus relaciones simbiticas y las alteraciones fsicas
y Qumicas que provocan en el medio ambiente. En este caso, los
microorganismos siguen las caractersticas comunes a todos los sistemas
considerados biolgicos con capacidad para reproducirse, ingerir o
asimilar substancias (metabolizndolas para sus necesidades energticas
y de crecimiento), habilidad de excrecin de metabolitos, capacidad de
reaccionar los cambios medio ambientales (irritabilidad) y la
susceptibilidad a las mutaciones.
Los principales organismos estudiados en Microbiologa son las
bacterias, los hongos, las algas y los protozoos, los virus a pesar de no
ser considerados, tienen algunas caractersticas de clulas vivas y por lo
que son los estudiados como microorganismos.
Cuando pensamos en desarrollar un estudio de Bacteriologa general,
clnica y de laboratorio, tomamos en cuenta inicialmente los conceptos
biolgicos, donde se considera de importancia microorganismos como
participantes de la microbiologa y como causantes de enfermedades. En
la parte del diagnstico bacteriano, la necesidad de estudiar las
metodologas simples y complejas, que permiten la obtencin de
resultados correctos que, en su mayora de las veces, el paciente depende
del resultado de un examen para el inicio del tratamiento, nos ha llevado
a investigar de acuerdo con la regin anatmica en la que puede ocurrir
la enfermedad.
MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de
microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. Un medio de cultivo es un
sustrato o una solucin de nutrientes que permite el desarrollo de
microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un
cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras
en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar
colonias.
El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio
de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo, estos
seguir recomendaciones bsicas para que el medio de cultivo crezca
adecuadamente; como la temperatura, grado de humedad y presin de
oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad.
Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de
crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo
contaminante.
I. CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DE
MICROORGANISMOS:
Los crecimientos adecuados de las bacterias en un medio de cultivo
pueden verse afectados por una serie de factores de gran importancia y
que, en algunos casos podran dar un falso positivo.
NUTRIENTES:
un medio de cultivo adecuado debe contener como mnimo carbono,
nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. Siempre han de estar
presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o
captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar.
Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de
infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin
embargo, las preparaciones de estas sustancias para su aplicacin a los
medios de cultivo provocaban la prdida de los factores nutritivos lbiles.
En la actualidad la forma ms extendida de aportar estas sustancias a
los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente
fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los
microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas
naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros
compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona.
Existe ciertas bacterias que tienen necesidades nutritivas especficas por
lo que se utiliza sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc.
Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales
como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias
promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica.

CONSISTENCIA DEL MEDIO DE CULTIVO:


Medios Lquidos: se utilizan preferentemente para favorecer el desarrollo
bacteriano de clulas estresadas. En determinadas ocasiones no se
pueden sustituir por los medios slidos, por ejemplo, en la sntesis de
exotoxinas, pigmentos, enzimas, etc. - Ejemplo: Agua peptonada, Caldo
comn, Caldo Cerebro Corazn, Caldo Saboureaud, etc
Medios Slidos: se utilizan para obtener bacterias aisladas por la
formacin de colonias sobre la superficie del medio de cultivo y para el
estudio de la morfologa de las colonias, lo que no permiten los medios
lquidos. Se diferencian porque tienen una sustancia de sostn, que
puede ser agar-agar. - Ejemplo: Agar Comn, Agar SS, Agar Cerebro
Corazn, Agar Saboureaud, etc.
Medios Semislidos: se utilizan para estudiar la motilidad de las
bacterias. Tienen un menor porcentaje de agar, por lo que no solidifican
totalmente a la temperatura ambiente. - Ejemplo: Agar MIO, Agar SIM.
La ventaja fundamental de usar un medio de cultivo lquido, es que
permite que crezcan bacterias que se encuentran en muy poca cantidad,
es decir, cuya concentracin es muy baja en la muestra que estemos
analizando. Para el caso del medio de cultivo slido, la ventaja radica en
que permite detectar los diferentes tipos de bacterias que puedan
encontrarse en una sola muestra. Actualmente los medios slidos son
de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran
cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el
laboratorio.
PRESENCIA O AUSENCIA DE OXIGENO:
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin
de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de
variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo
se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno
ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos micro aerfilos
crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente en tensin de
oxgeno muy reducida, mientras los anaerobios facultativos tienen un
metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.
INDICADORES DE PH EN MEDIOS DE CULTIVOS:
La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el
crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan
mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios
ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o
bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden
sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos
normales.
Todos los medios de cultivo deshidratados son fabricados de acuerdo a
los valores de pH indicados en la etiqueta. A pesar de esto, se debe
verificar despus de la esterilizacin, que el pH del medio concuerda con
el correcto. La medicin del pH debe ser realizada a una temperatura de
25C. Si fuera necesario, este pH se puede ajustar antes de que el medio
solidifique. Se debe evitar el exceso de ajuste de pH, ya que esto puede
alterar la composicin qumica del medio.
TEMPERATURA:
Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas
entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a
80C o incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas
generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura
mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saproftos tienen rangos ms
amplios.
ESTERILIZACIN:
Los medios de cultivo contienen diferentes organismos que proceden de
las diferentes materias primas y de los recipientes utilizados. Estos
organismos deben ser eliminados antes de la inoculacin para evitar
falsos resultados. Existe una gran variedad de mtodos de esterilizacin,
pero el ms utilizado es la esterilizacin por calor. Las clulas vegetativas
se eliminan rpidamente y a temperaturas alrededor de los 60C durante
5-10 minutos, sin embargo, para la eliminacin de las esporas se
necesitan una temperatura de 121C durante 15 minutos.
Los medios que contienen carbohidratos no deben ser autoclavados a una
temperatura que exceda los 116-118C. En todos los casos se debe evitar
el sobrecalentamiento. En algunos medios lquidos, el calentamiento
puede dar lugar a perdida de actividad de algunos componentes. En estos
casos se debe esterilizar por filtracin. La muestra se pasa a travs de
unos filtros en lo que se quedan retenidos los microorganismos, la
eficacia de estos sistemas depende del tamao del poro del filtro o bien
de su carga elctrica; a pH ptimo la mayora de las bacterias tienen una
carga de superficie negativa por lo que la filtracin ser ms eficaz
cuando ms positiva sea la carga del filtro.
II. UTILIZACIN DE MEDIOS CULTIVOS
A causa de los requerimientos qumicos del mundo microbiano, a veces
es necesario agregar o eliminar componentes qumicos del medio.
MEDIOS COMUNES:
su finalidad es el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos
poco existentes. Es el medio ms frecuentemente utilizado para mantener
colonias microbianas. Por ejem: agar comn o caldo comn.
MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO:
son aquellos medios de cultivo que por su riqueza nutritiva, sirven para
el cultivo de bacterias muy exigentes. Contienen en su formulacin
sustancias inhibidoras para ciertas bacterias, que permiten el
aislamiento y diagnstico precoz de aquellas bacterias que nos interesan
por ser los agentes etiolgicos de las enfermedades infecciosas. Tambin
pertenecen a este grupo aquellos medios que, por adiccin de sustancias
qumicas determinadas, facilitan el diagnstico por caractersticas
bioqumicas de algunas especies microbianas; se clasifican en:
a) Medios mejorados: se obtienen aadiendo a los medios corrientes
sustancias de mayor valor nutritivo, que tienen el efecto de
proporcionar condiciones favorables para el cultivo de bacterias
exigentes (Estreptococos, Corynebacterium). Las sustancias aadidas
pueden ser: sangre desfibrinada, suero sanguneo, suero fetal bovino,
huevo, cerebro, corazn, trozos o extracto de hgado, carne o levadura,
etc. La mayora de estas sustancias por ser proteicas coagulan con el
calor, lo cual impide que sean esterilizadas en autoclave. Deben por lo
tanto ser esterilizadas por filtracin o ser agregadas a los medios
previamente esterilizados, en condiciones de rigurosa asepsia. (Agar
Sangre, Agar Cerebro Corazn).
b) Medios selectivos: generalmente el microorganismo patgeno
causante del cuadro infeccioso que se desea aislar a partir de la
muestra, no se encuentra puro, sino que convive con otras especies
sin inters diagnstico; se caracterizan por estimular el desarrollo de
ciertas especies bacterianas y a la vez inhibir el desarrollo de otras
especies, lo que permite es aislamiento y diagnstico de las bacterias
con facilidad y rapidez. Estas caractersticas se obtienen por la adicin
de sustancias tales como colorantes de anilinas, sales biliares,
antibiticos, etc. (Agar Brucella, Caldo Selenito Cistina).
c) Medios diferenciales: son medios comunes o mejorados, con adiccin
de ciertas sustancias que ponen de manifiesto determinadas
propiedades bioqumicas, inherentes a algunas especies bacterianas.
MEDIOS DE MULTIPLICACIN:
Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a partir de un
microorganismo ya aislado. Seemplean en la obtencin de vacunas, en la
investigacin y en la industria. Los medios ms adecuados para la
multiplicacin suelen ser lquidos (el caldo-infusin cerebro-corazn
BHI).
MEDIOS DE IDENTIFICACIN:
Son los destinados a comprobar alguna cualidad especfica que puede
servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos
medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el
crecimiento de los microorganismos, el sustrato especfico que vaya a ser
metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado.

III. MEDIOS DE CULTIVO MS UTILIZADOS


AGAR NUTRITIVO:
Es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo
de bacteria. Por las caractersticas de sus componentes es un medio
usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus
requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo
bacteriano. La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrgeno para el
desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio permite el
enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar
el cultivo de microorganismos exigentes. El agar nutritivo contiene
normalmente (w/v).
0.5 % Peptona
0.3 % extracto de carne/extracto de levadura
1.5 % agar
0.5% NaCl
Agua destilada
pH casi neutro (6.8) a 25 C
AGAR C.L.E.D:
El medio C.L.E.D. (Cistina Lactosa Electrlito Deficiente) est
recomendado para el recuento e identificacin presuntiva de los
microorganismos de las vas urinarias. Su bajo contenido en electrolitos
evita la invasin de los cultivos por Proteus. La presencia de lactosa en
su composicin le confiere el carcter de medio diferencial, aunque la
interpretacin sea diferente al anterior medio por la incorporacin de otro
indicador: el azul de bromotimol. Las colonias lactosa positivas
aparecern de color amarillo y las lactosas negativas lo harn con un
color verdoso, blanco o azulado.

Digerido pancretico de gelatina


Digerido pancretico de casena
Extracto de carne bovina
Lactosa
L-cistina
Azul de bromotimol
Agar
pH 7,3 +/- 0,2
AGAR MAC CONKEY:
Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de
fcil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar
bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y
alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae
desarrollan en el mismo.
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios
para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono
fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los
agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram
positiva. Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la
colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro),
la absorcin en las colonias, y la precipitacin de las sales biliares. Los
microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias
incoloras.
Peptona
Pluripeptona
Lactosa
Mezcla de sales biliares
Cloruro de sodio
Agar
Rojo neutro
Cristal violeta
pH final: 7.1 0.2
AGAR SANGRE:
Medio para propsitos generales, para el aislamiento y cultivo de
numerosos microorganismos. Con la adicin de sangre, el medio es til
tanto para el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y
anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de
muestras, como para la observacin de reacciones de hemlisis.
Tambin, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para
preparar el medio agar chocolate.
La infusin de msculo de corazn y la peptona, otorgan al medio un alto
valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de
microorganismos, an de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro
de sodio mantiene el balance osmtico. El agregado de sangre al medio
de cultivo, en concentracin final de 5-10 %, aporta nutrientes para el
crecimiento bacteriano, y permite detectar hemlisis.
Infusin de msculo de corazn
Peptona
Cloruro de sodio
Agar
pH final: 7.3 0.2
GC AGAR BASE:
Medio de cultivo empleado como medio basal para la preparacin del
medio Thayer-Martin original o modificado, y como agar chocolate con o
sin enriquecimiento. Es til para la recuperacin de N. gonorrhoeae, N.
meningitidis y otros microorganismos exigentes en sus requerimientos
culturales.
Es un medio altamente nutritivo. La pluripeptona (es una mezcla en
partes iguales de peptona de carne y peptona de casena) es la fuente de
nutrientes para el desarrollo de microorganismos, el almidn soluble
absorbe sustancias txicas indeseables para el desarrollo de ciertos
microorganismos, las sales de fosfato forman un sistema buffer y el
cloruro de sodio mantiene el balance osmtico.
Este medio de cultivo, puede ser suplementado con otros nutrientes o
con antimicrobianos, logrndose un medio ms enriquecido o selectivo
segn el aditivo.
El agar base GC, en combinacin con hemoglobina y el suplemento estril
de enriquecimiento, se usa para el aislamiento de microorganismos
exigentes.
Si se desea un medio selectivo para N. gonorrhoeae, se puede adems
aadir mezcla antimicrobiana para inhibir el desarrollo de
microorganismos Gram positivos y Gram negativos, excepto N.
gonorrhoeae.
Pluripeptona
Almidn soluble
Fosfato dipotsico
Fosfato monopotsico
Cloruro de sodio
Agar
pH final:7.2 0.2
MUELLER HINTON AGAR
Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la
prueba de sensibilidad a los antimicrobianos. Adems es til con el
agregado de sangre para el cultivo y aislamiento de microorganismos
nutricionalmente exigentes; su uso en forma rutinaria para la realizacin
del antibiograma en medio slido, debido a una serie de factores que se
detallan a continuacin: presenta buena reproducibilidad lote a lote en
las pruebas de sensibilidad, su contenido en inhibidores de
sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es bajo, la mayora de los
patgenos crece satisfactoriamente y una gran cantidad de datos han
sido evaluados y avalados usando este medio de cultivo.
Cuando se suplementa con sangre de carnero al 5%, es til para realizar
las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en especies de
estreptococos.
Infusin de carne
Peptona cida de casena
Almidon
Agar
pH final: 7.3 0.1
SALMONELLA SHIGELLA AGAR
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de
algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros
materiales en los cuales se sospeche su presencia.
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial.
La selectividad, est dada por las sales biliares y el verde brillante, que
inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayora de los
coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a
la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido sulfhdrico a partir
del tiosulfato de sodio. Los pocos microorganismos fermentadores de
lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo
el indicador de pH, obtenindose colonias rosadas o rojas sobre un fondo
rojizo. Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de
lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias
transparentes. La produccin de cido sulfhdrico se evidencia como
colonias con centro negro debido a la formacin de sulfuro de hierro. Para
aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la muestra
en caldo de selentino.

Extracto de carne
Lactosa
Mezcla de sales biliares
Citrato de sodio
Tiosulfato de sodio
Citrato frrico
Agar
Verde brillante
Rojo neutro
Pluripeptona
pH final: 7.0 0.2
AGAR HEKTOEN
Este es un medio ideal para el aislamiento selectivo de Salmonella y
Shigella spp., a partir de heces y alimentos. El medio de cultivo contiene
sales biliares que inhiben el desarrollo de la flora acompaante, y 2
sistemas indicadores: azul de bromotimol y fucsina cida como
indicadores de la fermentacin de carbohidratos, y el citrato de hierro
como un indicador de la formacin de SH2 a partir del tiosulfato.
El desarrollo de Shigella spp. es adecuado debido a que la inhibicin de
estos microorganismos por las sales biliares est disminuida por la
adicin de cantidades relativamente elevadas de peptona y carbohidratos.
El medio de cultivo, permite una buena diferenciacin de las colonias e
inhibe el desarrollo de algunos coliformes y otras bacterias no
fermentadoras de lactosa, facilitando as la identificacin de Salmonella
y Shigella a partir de la muestra.
AGAR KLIGLER
Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiologa de alimentos
para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de
glucosa y lactosa, y a la produccin de cido sulfhdrico. En el medio de
cultivo, la peptona de carne y la triptena, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la glucosa son los
hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato
necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el citrato de hierro y
amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los cuales se combinan con el cido
sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol
es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico.
El agar es el agente solidificante. Por fermentacin de azcares, se
producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,
el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se
reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de
hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

LOS COMPONENTES DEL MEDIO Y SUS FUNCIONES


a) Rojo fenol:
Un indicador de pH. En medios cidos (debajo de 6.8) se torna amarillo.
En medios alcalinos (arriba de 8.2) se torna rojo.
b) 1,0% de lactosa y 1,0% de sacarosa:
Su fermentacin produce una gran cantidad de cidos.
c) 0,1% de glucosa:
Su fermentacin produce una pequea cantidad de cidos.
d) Sulfato ferroso (FeSO4):
Nos permite averiguar si las bacterias pueden producir H2S (cido
sulfhdrico).
MTODOS DE SIEMBRA
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra
(inculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo
microbiano, para su desarrollo y multiplicacin. Una vez sembrado, el
medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el
crecimiento.
Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:
Que se efecten aspticamente
Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estn
esterilizados
Que se realicen solo los manipuleos indispensables
Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando
un mechero o bien Flujo laminar.
Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los
requerimientos del microorganismo a estudiar.
MTODOS GENERALES
SIEMBRA POR DILUCIN:
Se toma el tubo de ensayo con medio lquido, como el caldo simple. Se
toma el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del asa cargada
con el material bacteriolgico, se agita, con movimientos moderados.
Medio de cultivo: Liquido
Instrumento: Asa
Finalidad: poner la bacteria en suspensin.
SIEMBRA POR ESTRAS EN SUPERFICIE:
Se siembra el material en la superficie del agar inclinado en un tubo de
ensayo, all se extiende por toda la superficie con el asa bacteriolgica,
previamente esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo
estras no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la
parte ms profunda de la superficie inclinada y se termina la estra en la
parte ms cerca de la boca del tubo.
Medio de cultivo: agar base inclinado
Instrumento: asa o aguja bacteriolgica.

SIEMBRA POR ESTRA POR AGOTAMIENTO:


Con este procedimiento se puede conseguir una buena separacin de las
colonias y aislarlas fcilmente. Para ello se funde el medio de cultivo, se
vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente
esterilizada se toma material de un cultivo heterogneo y se descarga
sobre la superficie del medio formando estras. Esto puede realizarse de
varias formas:
Al comienzo se coloca el inoculo, luego se contina con las estras.
Cuando se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar
dos o tres placas de Petri, para lo cual se repite la operacin sin tomar
con el asa nuevo material.
Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez
depositado el material en el primero, siguiendo el sentido de las agujas
del reloj, se hace una estra luego en el segundo, tercero y cuarto
cuadrante sin cargar nuevamente el asa; en el ltimo cuadrante
aparecern las colonias aisladas.
El inculo se extiende sobre una pequea zona de la placa, prxima
al borde, se esteriliza el asa y se traza otra estra a partir del depsito
y as sucesivamente.
Medio de cultivo: solido en placa de Petri
Instrumento. Asa
Finalidad. Obtener colonias aisladas.

SIEMBRA POR PUNCIN:


Con una aguja se toma el material que se quiere sembrar y se lo introduce
en el tubo, con medio semislido. Introducir la aguja hasta el fondo,
formando un canal de puncin, trayecto por el cual la retiraremos luego.
Este mtodo se utiliza para estudiar la movilidad de las bacterias.
Medio de cultivo: Semislido
Instrumento: aguja bacteriolgica
Finalidad: Estudiar la movilidad de las bacterias.
SIEMBRA EN TSI:
El TSI (Triple Sugar Iron) es un medio que contiene glucosa, sacarosa y
lactosa, hierro y un indicador que es el rojo fenol. En este medio
sembraremos por picadura y estras en superficie, como ya conocemos,
para estudiar los cambios que ocurrirn en superficie y profundidad. A
lo largo del canal se desarrollan los microorganismos, y segn lo hagan
en la parte superior o inferior del tubo, estarn indicando su
comportamiento frente a los azucares, los cambios indican lo siguiente.

TINCIONES BSICAS EN MICROBIOLOGA


La tincin es un proceso por el cual las molculas de un colorante se
absorben a una superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color
de las clulas de los microorganismos y poder realizar la observacin en
microscopio ptico. Dado que las bacterias son casi incoloras, no
presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas
y no pueden observarse claramente sin algn tratamiento previo. De
acuerdo a la reaccin que ocurre, existen diferentes tipos de tincin:
a. Simples: utilizacin de un solo tinte con el cual podemos evaluar
solamente la morfologa, es cuando toda la muestra se tie del mismo
color y se utiliza un solo colorante.
b. Compuestas especiales: constituidas por 2 ms tintes o reactivos
y sirven para clasificar las bacterias u observar sus caractersticas
especiales.
c. Positivas: se observa teida la clula sobre un fondo claro.
d. Negativas: El fondo se tie de oscuro para observar la clula o
estructuras refringentes
TINCIN GRAM
Composicin de la pared celular de las bacterias, las bacterias G+ est
compuesta por varias capas de peptidoglicanos, las bacterias G- tienen
una membrana externa con un componente estructural nico que son
los lipopolisacridos. Las bacterias G+ retienen el cristal-violeta despus
de la decoloracin y aparecen de color azul intenso (purpura), las
bacterias G- no son capaces de retener el cristal-violeta despus de la
decoloracin y son teidas de rojo con safranina. Existe bacterias de un
mismo gnero que pueden observarse en la misma muestra como Gram
positivas y como Gram negativas, a este evento se le llama tincin Gram
variable secundaria a alteracin en nutrientes, temperatura, pH o
concentracin de electrolitos. No todas las bacterias se pueden teir por
esta tcnica, ya que carecen de pared celular (micoplasma) o su pared
celular tiene una composicin qumica diferente (micobacterias, que
cuentan con una gran cantidad de cidos miclicos). Las muestras tiles
para su uso son lquidos estriles, biopsias para cultivo, abscesos,
hisopados, crecimiento de colonias aisladas en medios de cultivo. Las
bacterias Gram positivas se observan de color azul obscuro a morado,
mientras que las Gram negativas se observan de color rosa a rojo.
TINCIN DE MOELLER (ESPORAS)
Se suspende una bacteria del genero Bacillus, evidencia capsula incolora
en un contraste morado. Las esporas permiten a las bacterias pasar a un
estado latente en condiciones ambientales adversas. Su principal
componente es Ca2+ fijado a cido dipicolnico. El calor despus de la
tincin con carbol-fuscina con permite que rompa la estructura que
protege la espora para que as pueda penetrar el colorante. Con el lavado
de agua se retira todo tinte que se adhiri a la bacteria, para despus
teirse con azul de metileno.

TINCIN DE ANTHONY (CPSULA)


Es una tincin negativa en donde vemos la cpsula no teida sobre un
fondo morado y se visualiza la bacteria en el centro de la cpsula, esta
pude ser de glicoprotenas o polisacridos. La cpsula es una sustancia
viscosa producida por algunas especies que la sintetizan a partir de
polipptidos, polmeros de glucosa u otros amino azcares que contienen
nitrgeno, que despus de combinarse con el agua es segregada por todo
el contorno de la pared celular como un moco gelatinoso. Cuando la
cpsula ha sido producida puede observarse en los frotis coloreados por
el mtodo de Gram como un halo incoloro alrededor de la bacteria.
Cuando se requiere ver la cpsula con ms detalle o inducir su
produccin se recurre a coloraciones especiales; las cpsulas no se tien
normalmente con colorantes bsicos como el cristal violeta o la safranina.
Tincin negativa de cpsulas en que la leche litmus se tie con violeta
cristal como contraste de un fondo morado con el halo transparente de
la cpsula incolora.

TINCIN ACIDO ALCOHOL RESISTENCIA


Se trata de un procedimiento de tincin diferencial, conocido como
mtodo de Ziehl-Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicacin
clnica. Permite poder distinguir aquellos microorganismos cuya
coloracin resiste la accin de alcoholes y cidos suaves (cido-alcohol
resistentes) de otros que no resisten la decoloracin (no cido-alcohol
resistentes). Encontramos dos importantes patgenos: Mycobacterium
tuberculosis y Mycobacterium leprae, microorganismos responsables de
latuberculosis y la lepra respectivamente. Estas bacterias pertenecen al
Phyllum Actinobacteria, un grupo grande y complejo de bacterias gram
positivas, que incluye a la Familia Mycobacteriaceae caracterizada por
contener en sus paredes celulares un altocontenido lipdico, ceras con
una gran diversidad de cidos miclicos, molculas de 60 a 90 tomos de
carbono. La presencia de estos lpidos, en la cara externa de la pared,
hacen que estas bacterias sean muy resistentes a la accin de
compuestos qumicos presentes en su entorno, caracterstica que se
utiliza para aislar estos microorganismos: uno de los medios ms
frecuentes es el Loewenstein-Jensen con verde malaquita que permite el
crecimiento selectivo de estos microorganismos.
TINCIN DE NEGATIVA
En microbiologa, la tincin negativa proporciona un resultado
presuntivo de la presencia de Cryptococcus neoformans, microorganismo
causante de meningitis en pacientes con inmunosupresin, siendo la
tcnica ms utilizada para poner de manifiesto su cpsula. El principio
es simple, ya que slo se requiere depositar una gota de la muestra clnica
sobre un portaobjetos, posteriormente se coloca el colorante y se observa
al microscopio sin necesidad de fijacin, algunas estructuras difundirn
el colorante y otras no, lo que permitir un contraste de las estructuras
observadas. Se han utilizado diferentes colorantes: uno de ellos es la tinta
china, la cual tie el fondo de la muestra de un color oscuro y la cpsula
del C. neoformans permanece sin teir. La principal dificultad con la
tincin negativa es que los microorganismos tienden a contraerse
durante el periodo de secado; para evitarlo, se ha optado por usar la
tincin negativa hmeda, en la cual los organismos se suspenden en una
pelcula de tinta china o mancha oscura y el contorno de la cpsula puede
ser observado sin el peligro de contraccin. Adems de ser una tcnica
sencilla, es muy barata, ya que no requiere equipos o material costoso
para su realizacin.
BIBLIOGRAFA.
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