ANALISIS SEDIAAN FARMASI DENGAN

METODE SPEKTROFLUOROMETRI
NIA KRISTININGRUM, M.Farm., Apt.
 PENDAHULUAN
Penyerapan energi oleh
molekul

EKSITASI FOTOLUMINESENSI
FLUORESENSI
FOSFORESENSI
Tingkat energi molekuler terkait dengan
peristiwa Fluoresensi dan Fosforesensi
Keadaan elektron dalam keadaan dasar,
tereksitasi singlet dan tereksitasi triplet
 Hubungan antara Intensitas
fluoresensi dan konsentrasi
Intensitas fluoresensi dapat dijelaskan dari
hukum Lambert-Beer :

A=abc
dimana:
A = absorbansi
a = konstanta disebut absortivitas
b = tebal larutan
c = konsentrasi larutan
Intensitas fluoresensi (F) sebanding dengan banyaknya sinar yang
diserap oleh molekul analit.

F = (Io It)

Io-It merupakan banyaknya sinar yang diserap

merupakan efisiensi kuantum atau hasil kali kuantum ( fraksi
atau bagian molekul-molekul tereksitasi yang berelaksasi ke
keadaan dasar melalui fluoresensi. spesifik seperti
absorptivitas.
Intensitas Fluoresensi dipengaruhi oleh :

konsentrasi analit
efisiensi kuantum
intensitas sumber sinar radiasi yang
mengenai molekul sampel
absorptivitas analit
 FAKTOR YANG MEMPENGARUHI
FLUORESENSI

SUHU
PELARUT
pH
OKSIGEN TERLARUT
KEKAKUAN STRUKTUR
 SUHU

Kelebihan energi
Tabrakan antar
Kenaikan molekul yg
molekul atau
tereksitasi
suhu dengan molekul
dilepaskan ke
pelarut
molekul pelarut

Efisiensi
Konversi
Fluoresensi
keluar
berkurang
 PELARUT
Jika pelarut mengandung
Intensitas fluoresensi atom-atom yang berat (Br, I,
makin besar jika pelarut dll) maka interaksi antara
makin polar. Semakin gerakan spin dengan gerakan
polar pelarut akan orbital elektron-elektron
menurunkan energi ikatan lebih banyak terjadi
proses transisi * sehingga akan memperbesar
sehingga energi transisi ini laju lintasan antar sistem atau
lebih kecil dibandingkan mempermudah pembentukan
energi transisi n* triplet dan kebolehjadian
akibatnya intensitas fluoresensi lebih kecil serta
fluoresensi semakin besar. kebolehjadian fosforesensi
menjadi lebih besar.
 pH
pH berpengaruh pada letak keseimbangan antara bentuk
terionisasi dan bentuk tak terionisasi. Sifat fluoresensi dari
kedua bentuk itu berbeda.
Contoh:
Fenol dalam suasana asam akan berada dalam bentuk
molekul utuh dengan antara 285-365 nm, =18 M-1cm-1.
Dalam suasana basa fenol akan terionisasi membentuk ion
fenolat dengan antara 310-400 nm, =10 M-1cm-1
Anilin yang bersifat basa lemah dalam larutan basa berada
dalam bentuk molekul utuh dan dalam larutan asam
mengalami protonasi sehingga tidak memiliki auksokrom.
 OKSIGEN TERLARUT
Intensitas fluoresensi akan diperkecil jika ada gas
oksigen. Ini terjadi karena adanya proses oksidasi
yang timbul yang disebabkan oleh pengaruh cahaya
(fotochemically induced oxidation). Pengurangan
intensitas fluoresensi disebut pemadaman sendiri
(quenching).
Molekul oksigen bersifat paramagnetik yang dapat
mempengaruhi dan mempermudah lintasan antar
sistem sehingga kecil kemungkinan fluoresensi dan
besar keboleh jadian fosforesensi.
 KEKAKUAN STRUKTUR
Fluoresensi dapat terjadi dengan baik jika molekul-molekul
memiliki struktur yang kaku (rigid)
Contoh: fluoren dan bifenil berbeda pada adanya gugus
metilen yang menghubungkan dua gugus fenil (pada
fluoren) sehingga fluoren memiliki efisiensi kuantum yang
besar mendekati 1 dibandingkan dengan bifenil dengan
efisiensi kuantum yang lebih kecil (sekitar 0,2).

Fluoren Bifenil
 SENYAWA YANG BERFLUORESENSI
Senyawa yang berfluoresensi umumnya
mempunyai gugus aromatis dengan energi
yang rendah
Kebanyakan hidrokarbon aromatis yang tidak
tersubstitusi dapat berfluoresensi
fluoresensi meningkat dg meningkatnya
jumlah cincin dan derajat kondensasi
EDG (OH-, -NH2, OCH3) yang terikat pada
sistem dapatmenaikkan intensitas
fluoresensi
 Sampel cell

Excitation Transmitted
filter Light

Light Excitation
Fluorecent
source (prymary)
(emitted)
filter
light

Fluorecence
(secondary)
filter

Phototube
Photomultiplier tube
Komponen-Komponen
Spektrofluorometer
Spektrofotometer
Dari gambar dapat dilihat bahwa komponen
spektrofluorometer hampir sama dengan
komponen spektrofotometer.
Perbedaan antara keduanya yakni
Spektrofluorometer memiliki dua
monokromator dimana salah satu digunakan
untuk panjang gelombang eksitasi dan yang
lainnya digunakan untuk panjang gelombang
emisi.
Komponen Utama Spektrofluoresen

1) Source of light
2) Excitation filter
3) Sample holder
4) Emission filter
5) Detector
Source of light

Two types of light sources:

Xenon lamp: nyala lampu terjadi karen ionisasi
gas Xe dengan tegangan tinggi, kemudian arus
dan tegangan dipertahankan 7,5A, 20 V(750W).
Nyala lampu mencakup panjang gelombang UV-
Vis.
Lampu Merkuri: Intensitas cahaya ini
terkonsentrasi pada 254 dan 365 nm yang
bermanfaat sebagai radiasi eksitasi.
Excitation- and emission filter

1.The simplest filter fluorimeters use fixed filters

to isolate both the excited and emitted
wavelengths.
2.More sophisticated fluorescence spectro
meteres use monochromators to select both
the excitation and emission wavelengths.
3.Hence both emission and excitation spectra
can be recorded.
Detectors

All commercial fluorescence instruments use

photomultiplier tubes as detectors and a wide
variety of types are available.
Sample and sample holder

1.The majority of fluorescence assays are carried

out in solution.
2.The final measurement being made upon the
sample contained in a cuvette
Information obatained from measurements

1.Emission and excitation spectra

2.Concetration (at low concentrations the
fluorescence intensity is proportional to the
concentration of the fluorophore)
KEUNTUNGAN METODE
SPEKTROFLUOROMETRI

SENSITIF
SPESIFIK
RENTANG KONSENTRASI YANG LEBAR
SEDERHANA DAN CEPAT
MURAH
Keuntungan dari analisis fluoresensi

Kepekaan yang baik karena :

1. Intensitas dapat diperbesar dengan
menggunakan sumber eksitasi yang tepat
2. Detektor yang digunakan sangat peka
3. Pengukuran energi emisi lebih tepat daripada
energi terabsorbsi
4. Limit deteksi rendah
kelompok analisis obat secara
fluoresensi
Obat yang mempunyai sifat fluoresensi
alamiah dalam hal ini tidak diperlukan
tambahan pereaksi
Contoh : Quinine
Larutan obat ini mengabsorbsi sinar UV
dan mengemisi sinar Vis
kelompok analisis obat secara
fluoresensi
Turunan obat yang dibentuk dengan pengikatan
dengan senyawa berfluoresensi
Contoh : Asam amino diikat oleh syclorida [ 5
(dimethylamino) naphtalene-1-sulfonyl-chloride]
dansyl asam amino yang intensitas fluoresensinya
tinggi
kelompok analisis obat secara
fluoresensi
Vitamin B1 dalam sediaan Farmasi atau makanandapat ditetapkan
secara spektrofluorimetri setelah dioksidasi menjadi tiokrom yang
mudah berfluoresensi

H3C

H3C
Metode spektrofluorometri
Spektrofotometri fluoresensi merupakan suatu proseduryang
menggunakan pengukuran intensitas cahaya fluoresensi yang
dipancarkan oleh zat uji dibandingkan dengan yang
dipancarkan oleh suatu baku tertentu.
Pada umumnya cahaya yang diemisikan oleh
larutan berfluoresensi mempunyai intensitas maksimum pada
panjang gelombang yang biasanya 20 nm hingga 30 nm lebih
panjang dari panjang gelombang radiasi eksitasi(gelombang
pita penyerapan sinar yang membangkitkannya).
 TAHAPAN ANALISIS

PREPARASI TENTUKAN EKSITASI

SAMPEL DAN EMISI

HITUNG KADAR BUAT KURVA

DALAM SAMPEL BAKU
 Preparasi sediaan obat

1. Sampel tablet yang akan dianalisis harus representatif, Contoh :

Menurut Farmakope, untuk analisis tablet parasetamol dibutuhkan
sampel sebanyak 20 tablet parasetamol 500 mg
2. Sediaan cair : dapat dilakukan pengukuran secara langsung, atau
diencerkan atau dipekatkan terlebih dahulu dengan pelarut organik
3. Sediaan steril (injeksi) : dapat dilakukan pengukuran secara langsung
4. Sediaan semi padat Isolasi obat dalam salep harus ditunjukkan pada
dasar salepnya :
a. Salep lemak bulu domba alkohol, salep hidrofil, salep lanolin
biasanya dilarutkan dalam kloroform atau eter
b Salep Polietilen glikol, dilarutkan dalam etanol atau air
 PERHATIAN

Pada prinsipnya, semua pengukuran dengan

menggunakan instrumen spektroskopi, maka syarat
pertama adalah harus larut dalam larutan pembawa
yang digunakan
Untuk sediaan obat multikomponen, maka
instrumen spektroskopi harus dapat membedakan
masing-masing komponen tersebut, berdasarkan nilai
panjang gelombang
Pada larutan dengan konsentrasi
tinggi,sebagian besar cahaya diserap
lapisan larutan yang paling dulu kontak
dengan radiasi eksitasi, sehingga
fluoresensi hanya terjadi pada bagian
yang menyerap cahaya tersebut. Dengan
demikian, pada analisis kuantitatif harus
digunakan larutan yang encer (serapan
tidak lebih dari 0,02) supaya dapat
memenuhi persamaan fluoresensi
 MENENTUKAN EKSITASI DAN EMISI

Lar. cuplikan masukkan kedalam kuvet spektrofotometer

Atur monokromator eksitasi pada suatu didaerah u.v.
(misal A). Kemudian monokromator emisi diputar sampai
diperoleh intensitas yang maksimal misal B nm (B : emisi)
Atur monokromator, emisi pada B nm dan sekarang
monokromator eksitasi yang diubah sampai diperoleh
intensitas yang maksimum misal A nm (A nm = eksitasi)
Monokromator eksitasi diatur pada A nm dan buat spektra
emisi dengan merecord intensitas sebagai fungsi dari
panjang gelombang () akan diperoleh harga yang
mempunyai intensitas maksimal misal : B nm
Maka eksitasi : A nm
emisi : B nm
Latihan Soal
Dilakukan analisis ibuprofen dalam sediaan sirup. Data larutan
standar yang diperoleh adalah sebagai berikut :
Intensitas
Standar 0,2 ppm 18,428
Standar 0,4 ppm 32,257
Standar 0,6 ppm 34,166
Standar 0,8 ppm 43,496
Standar 1,0 ppm 52,185
Sampel 49,637

Preparasi sampel : dipipet sirup ibuprofen sebanyak 1 ml

kemudian dilarutkan dalam NH4OH 0,2 M sampai volume 100ml.
Kemudian larutan tersebut dipipet sebanyak 1 ml dan diencerkan
sampai volume 250 ml.
 Berapakah persen akurasi ibuprofen dalam
sediaan sirup jika dalam label tertulis
kandungan ibuprofen 120 mg/5 ml
 Latihan Soal
Suatu senyawa griseofulvin standar disiapkan pada pH 7,
intensitas fluoresensinya diukur pada eksitasi dan emisi
masing-masing pada 295 nm dan 450 nm serta memberikan
data sebagai berikut :
Konsentrasi (ng/mL) 10 20 30 40
Intensitas fluoresensi 20 42,5 64,5 85

Preparasi sampel : ditimbang sampel sejumlah 35,96 mg

kemudian dilarutkan sampai volume 100 ml, kemudian
diambil 1 ml larutan tersebut dan diencerkan sampai 100 ml.
Setelah itu diambil lagi larutan terakhir sebanyak 1 ml dan
diencerkan lagi sampai 100 ml.
a. Berapa kandungan griseofulvin dalam
tablet jika diketahui intensitas fluoresensi
sampel sebesar 64 dan bobot rata-rata
tablet 310 mg ?
b. Berapa persen akurasi kadarnya jika di
kemasan tertulis setiap tablet mengandung
250 mg griseofulvin ?