Anda di halaman 1dari 74
Pemastian Mutu Produk Steril di Industri Farmasi Marlia Singgih Wibowo, PhD. School of Pharmacy Institut

Pemastian Mutu Produk Steril

di Industri Farmasi

Marlia Singgih Wibowo, PhD. School of Pharmacy

Institut Teknologi Bandung

PENDAHULUAN

USP General Chapters : berisi chapter-

chapter tentang berbagai metode analisis

(Tests dan Assays) yang resmi (Official tests

and assays) dan informasi penting yang

berkaitan dengan metode-metode analisis terkait

Produk obat atau bahan baku, eksipien yang

termasuk dalam cakupan Farmakope harus memenuhi persyaratan dalam farmakope

Chapter/ bab dengan nomor diatas 1000

merupakan informasi yang tidak memuat standard ataupun spesifikasi

Bahan/Produk Steril

Bahan baku obat, Bulk, (non-complex Active Drug Substances, Biotechnology-derived Drug Substances, dietary supplement Ingredients)

Produk Obat, Vaksin(non-complex active drug,

biotechnology-derived drug products, Blood- blood products, Gene and Cell Therapy

products, Dietary supplement products)

Compounding Sterile Preparations

Bahan eksipien obat

Alat (devices) , containers,

Alat kesehatan (medical divices)

Jenis analisis yang utama untuk produk steril (USP 30 Chart 10 page 25)

Endotoxin Limits : <85> Bacterial Endotoxins test

Sterility Tests : <71> Sterility tests dan

<1208> Sterility testing-Validation of Isolator Systems

Aseptic processing : <1116> Microbiological Evaluation of Clean Rooms and Other

Controlled Environments, <1208>, <1211>

Sterilization and Sterility Assurance of Compendial Articles

Filtration : <1211>

Assembly : <1116>, <1207> Sterile product

Packaging-Integrity Evaluation

BFS : <1116>

FFS : <1116>

SFS : <1116>

Others : <1072> Desinfectans and Antiseptics,

<1112> Application of Water Activity

Determination to Non-sterile Pharmaceutical Products, <1116>, <1117> Microbiological Best Laboratory Practices

<1223> Validation of Alternative Microbiological Methods

Preparasi sediaan steril di RS atau

health centre lain

Mulai 1 Januari 2004 USP menetapkan bab <797>Pharmaceutical Compounding:

Sterile Preparations

Di published pertama kali pada USP 27 dan NF 22 tahun 2004 sampai saat ini

Bab <797> berisi tentang prosedur, persyaratan dan penetapan standar2 yang dapat diterapkan pada seluruh aktivitas pembuatan produk steril

Penetapan tingkat risiko(Risk-level Determination) pada pembuatan produk steril

Low-risk

Medium Risk

High Risk

Pemastian Mutu produk steril

Bahan baku, intermediate, produk akhir

Production process : teknik aseptik, sterilisasi

akhir

Equipments

Quality Control

Environment : monitoring, validasi

Personnel : skill, training

Documentation : kelengkapan, arsip

Sales : monitoring, evaluasi

QA Program

Monitoring

Evaluating

Correcting

Improving

Maintaining

Fokus pembahasan

Uji Sterilitas

Uji Endotoksin

UJI STERILITAS

Pembuatan produk farmasi steril

Pembuatan produk farmasi steril

Tujuan uji sterilitas:

Untuk menetapkan apakah bahan farmakope yang harus steril memenuhi

syarat berkenaan dengan uji sterilitas

seperti yang tertera pada masing-masing

monografi

Suatu produk dikatakan STERIL

Bila memenuhi persyaratan dalam uji sterilitas

Kemungkinan hasil positif dapat terjadi karena teknik yang salah atau kontaminasi

lingkungan pada waktu pengujian.

Mikroba yang Digunakan:

(1) Bacillus subtilis (ATCC No. 6633) (2) Candida albicans (ATCC No. 10321) (3) Bacteroides vulgatus (ATCC No. 8482)

(1) Bacillus subtilis (ATCC No. 6633) (2) Candida albicans (ATCC No. 10321) (3) Bacteroides vulgatus (ATCC
(1) Bacillus subtilis (ATCC No. 6633) (2) Candida albicans (ATCC No. 10321) (3) Bacteroides vulgatus (ATCC
(1) Bacillus subtilis (ATCC No. 6633) (2) Candida albicans (ATCC No. 10321) (3) Bacteroides vulgatus (ATCC

Ketentuan hasil:

Jika terdapat kontaminasi mikroba dengan menggunakan prosedur farmakope, maka ditentukan bahwa bahan tersebut tidak

memenuhi syarat.

Jika terdapat kegagalan menunjukkan adanya kontaminasi mikroba dengan menggunakan prosedur dalam farmakope, maka ditentukan bahwa bahan tersebut memenuhi syarat.

Media yang digunakan :

Media yang digunakan mempunyai sifat merangsang pertumbuhan bagi mikroba yaitu:

Fluid Thioglycolate Medium (FTM) dan / atau

Alternative Thioglycolate Medium (ATM)

Soybean-Casein Digest Medium (SCDM)

Cairan Pengencer dan pembilas :

Cairan A

Cairan D = Cairan A + 1mL polisorbat 80/L

Cairan K

Cairan A

1 gram jaringan hewan yg telah diuraikan oleh enzim pepsin, dilarutkan dlm air smp 1 liter,

saring atau sentrifuga, pH diatur 7,1

Jika akan digunakan untuk uji sediaan yang

mengandung senyawa gol.penisilin/sefalosporin

(beta laktam), maka media tsb harus

ditambahkan enzim penisilinase utk proses inaktivasi

Cairan D

Adalah 1 L Cairan A + 1 mL Tween 80 Digunakan bila sediaan mengandung lesitin, atau minyak

Atau utk uji peralatan steril dengan

menggunakan penyaring membran

Cairan K

Cairan yang mengandung Jaringan hewan yg telah diuraikan oleh enzim lambung

(peptic digest), beef extract, dan Tween 80

Semua cairan pembilas harus disterilkan

dengan otoklaf

Penambahan penisilinase

Untuk sediaan mengandung pengawet antimikroba

golongan penisilin

Tetapkan jumlah penisilinase yang diperlukan

dengan menggunakan sediaan penisilinase yang

sebelumnya telah diuji daya penginaktif penisilin atau sefalosporin atau tetapkan jumlah penisilinase yang diperlukan dengan menambahkannya ke

dalam tabung FTM dan sejumlah antibiotik dalam

spesimen uji

1. Inokulasi media dengan 1 ml pengenceran (1 : 1000) biakan 18 jam-24 jam Staphylococcus aureus (ATCC

29737) dalam FTM.

2. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 30 o 35 o

Uji Fertilitas

Tujuan? Untuk memastikan bahwa media yang digunakan dapat menumbuhkan mikroba uji sampai waktu 7 hari

Dilakukan sebelum uji sterilitas thp sampel

Uji Fertilitas

Media

Mikroba Uji

 

Inkubasi

Suhu ( o C)

Kondisi

Fluid Tioglikolat Medium

(1) Bacillus subtilis (ATCC 6633)

30

35

Aerobik

(2) Candida albicans (ATCC10321)

30 35

 

(3) Bacteroides vulgatus

(ATCC8482)

30

35

Tioglikolat

(1) Bacteroides vulgatus

30

35

Anaerobik

alternative

(ATCC8482)

 

Soybean casein digest

(1) Bacillus subtilis (ATCC 6633)

20

25

Aerobik

(2) Candida albicans (ATCC No.

20

25

10321)

 

METODE UJI STERILITAS

INOKULASI LANGSUNG KE

DALAM MEDIA UJI TEKNIK PENYARINGAN MEMBRAN

Hal yang perlu dilakukan sebelum

Prosedur Inokulasi langsung:

Uji Aktivitas Bakteriostatik dan Fungistatik Jika pertumbuhan mikroba uji dalam campuran media bahan secara visual

sebanding dengan pertumbuhan dalam tabung

kontrol, gunakan jumlah bahan dan media

seperti yang tertera pada Tabel jumlah untuk

bahan cair dalam pemilihan spesimen uji dan

masa inkubasi Penetapan perbandingan bahan dan media yang tidak merugikan pertumbuhan mikroba uji

 

Jumlah untuk bahan cair

 
 

Volume minimum tiap media

 
 

Volume minimum

Digunakan untuk inokulasi langsung ke volume yang diambil dari tiap wadah (mL)

Digunakan untuk membrane atau setengah bagian membrane yang

mewakili volume total dari

diambil dari wadah

Jumlah wadah per media

Isi wadah (mL)

untuk tiap media

jumlah wadah yang sesuai

 

(mL)

 

Kurang dari 10

1mL, atau seluruh isi jika kurang dari

15

100

20 (40 jika volume tiap wadah tidak cukup untuk kedua media)

1mL

10

sampai kurang dari

5mL

40

100

20

50

50

sampai kurang dari

10mL

80

100

20

100

50

sampai kurang dari 100 dimaksudkan untuk pemberian intravena

Seluruh isi

-

100

20

100 sampai 500

Seluruh isi

-

100

10

Di atas 500

500mL

-

100

10

Ketentuan Penambahan atau pengurangan dalam menentukan perbandingan bahan dan media

Jika sejumlah tertentu bahan dalam 250mL media masih mempunyai daya bakteriostatik atau fungistatik, kurangi jumlah bahan hingga diperoleh jumlah maksimum yang tidak menghambat pertumbuhan uji dalam 250mL media.

Untuk cairan dan suspensi yang jumlahnya kurang dari 1mL, perbesar jumlah media hingga cukup untuk mengencerkan dan mencegah hambatan pertumbuhan.

Untuk bahan padat yang tidak segera larut atau dapat terdispersi, jika jumlahnya kurang dari 50mg, perbesar jumlah media hingga cukup untuk mengencerkan untuk mencegah hambatan pertumbuhan.

PROSEDUR UJI INOKULASI LANGSUNG

KE DALAM MEDIA UJI

PROSEDUR UJI INOKULASI LANGSUNG KE DALAM MEDIA UJI Untuk: • Cairan • Salep dan minyak yang
PROSEDUR UJI INOKULASI LANGSUNG KE DALAM MEDIA UJI Untuk: • Cairan • Salep dan minyak yang
PROSEDUR UJI INOKULASI LANGSUNG KE DALAM MEDIA UJI Untuk: • Cairan • Salep dan minyak yang
PROSEDUR UJI INOKULASI LANGSUNG KE DALAM MEDIA UJI Untuk: • Cairan • Salep dan minyak yang
PROSEDUR UJI INOKULASI LANGSUNG KE DALAM MEDIA UJI Untuk: • Cairan • Salep dan minyak yang
PROSEDUR UJI INOKULASI LANGSUNG KE DALAM MEDIA UJI Untuk: • Cairan • Salep dan minyak yang
PROSEDUR UJI INOKULASI LANGSUNG KE DALAM MEDIA UJI Untuk: • Cairan • Salep dan minyak yang

Untuk:

Cairan

Salep dan minyak yang

tidak larut dalam isopropil miristat

Zat padat

Kapas murni, perban, pembalut, benang bedah dan bahan

sejenisnya

Alat kesehatan steril

Alat suntik kosong atau terisi steril

Prinsip pengujian:

Prinsip pengujian: B a h a n u j i Catatan: Bahan uji + media Inkubasi

Bahan uji

Catatan:

Prinsip pengujian: B a h a n u j i Catatan: Bahan uji + media Inkubasi

Bahan uji + media

Inkubasi minimal 14 hari dengan pengamatan pada

hari ke 3,4,atau 5, hari ke 7 atau 8, dan pada hari

terakhir pengujian.

Perlakuan awal berbeda untuk masing-masing

produk farmasi dan kesehatan.

Bahan uji merupakan larutan yang pada produk

farmasi dan kesehatan kecuali yang berbentuk cairan digunakan untuk membilas atau mendispersi produk tersebut.

Perlakuan awal untuk berbagai sediaan

Cairan

1. Pindahkan cairan dari wadah uji menggunakan pipet atau jarum suntik steril.

2. Secara aseptik inokulasikan sejumlah tertentu bahan dari tiap wadah uji ke dalam tabung media.

3. Campur cairan dengan media tanpa aerasi berlebihan.

Salep dan minyak yang tidak larut dalam isopropil miristat

Pilih 20 wadah yang mewakili, dibagi atas 2 kelompok terdiri dari 10 wadah, dan diperlakukan tiap kelompok sebagai berikut:

1. Secara aseptik pindahkan 100mg dari tiap wadah dari 10 wadah ke dalam labu berisi 100mL pembawa air steril yang dapat

mendispersi homogen bahan uji dalam seluruh campuran cairan.

2. Campur 10mL alikot dari campuran cairan yang diperoleh dengan 80mL tiap media.

Zat padat

Ambil sejumlah tertentu produk dalam bentuk padat kering (atau yang sudah dibuat larutan atau suspensi dalam cairan pengencer

steril) tidak kurang dari 300mg tiap wadah atau seluruh isi wadah

jika tiap isi kurang dari 300mg.

Inokulasikan ke dalam masing-masing tidak kurang dari 40mL FTM dan SCDM.

Kapas murni, perban, pembalut, benang bedah

dan bahan sejenisnya

Dari setiap kemasan, ambil secara aseptik 2 bagian atau lebih masing-masing 100 sampai 500mg dari bagian paling dalam.

Secara aseptik pindahkan bagian bahan uji ini ke dalam sejumlah

tertentu wadah media yang sesuai dan inkubasi.

Alat kesehatan steril

Untuk alat yang bentuk dan ukurannya memungkinkan dicelupkan

keseluruhan ke dalam tidak lebih dari 1000mL media, uji alat utuh

menggunakan media yang sesuai.

Untuk alat yang mempunyai pipa/saluran

berlubang

1. seperti alat transfusi atau infus atau yang ukurannya menyebabkan pencelupan tidak

dapat dilakukan dan hanya saluran cairannya

yang harus steril, Bilas lumen masing-masing dengan sejumlah FTM dan SCDM hingga

diperoleh kembali tidak kurang dari 15mL

setiap media.

2. Inkubasi dengan tidak kurang dari 100mL masing-masing media.

Prosedur untuk:

Alat suntik kosong atau terisi steril

Uji dilakukan sama seperti uji untuk produk steril dalam ampul atau vial.

Cara inokulasi langsung dapat dilakukan jika

penetapan bakteriostatik dan fungistatik telah

menunjukkan aktivitas yang tidak merugikan

dalam kondisi pengujian.

UJI STERILITAS DENGAN

TEKNIK PENYARINGAN

MEMBRAN

Kegunaan uji sterilitas dengan teknik penyaringan membran

Kegunaan uji sterilitas dengan teknik penyaringan membran • Berguna untuk cairan dan serbuk yang dapat larut

Berguna untuk cairan dan serbuk yang dapat larut

yang bersifat bakteriostatik

atau fungistatik, untuk

memisahkan mikroba kontaminan dari penghambat pertumbuhan.

Berguna untuk bahan

seperti minyak, salep atau

krem yang dapat melarut ke dalam larutan pengencer bukan

bakteriostatik atau bukan

fungistatik.

Berguna untuk uji sterilitas permukaan atau lumen kritis alat-alat kesehatan.

Prosedur awal:

Buat perbandingan yang sama menggunakan sejumlah tertentu bahan uji dan cairan pengencer dan pembilas yang sesuai.

Bilas membran 3 kali, tiap kali dengan 100mL cairan

pengencer dan pembilas.

Pertumbuhan mikroba uji dari membran yang digunakan

untuk menyaring bahan diikuti cairan pengencer dan

pembilas yang telah diinokulasi secara visual sebanding dengan pertumbuhan dari membran yang hanya

digunakan untuk menyaring cairan pengencer dan

pembilas yang telah diinokulasi.

UJI MENGGUNAKAN PENYARINGAN MEMBRAN

Untuk:

Cairan yang dapat bercampur dengan pembawa air

Cairan yang tidak bercampur dengan pembawa air

(kurang dari 100mL per wadah)

Zat padat yang dapat disaring

Salep dan minyak yang larut dalam Isopropil Miristat

Zat padat yang tak dapat disaring

Alat kesehatan

Peralatan: porositas 0,45µm, diameter ±47mm, kecepatan penyaringan 55mL-75mL/mnt pada tekanan 70cmHg.

Penafsiran Hasil Uji Sterilitas

Tahap I Amati adanya pertumbuhan mikroba seperti kekeruhan dan / atau pertumbuhan pada permukaan pada isi semua wadah dalam interval waktu tertentu dan pada akhir periode inkubasi. Jika tidak terjadi pertumbuhan, maka bahan uji memenuhi syarat.

Tahap II

Jumlah spesimen yang diuji minimal 2 kali jumlah tahap I.

Jika tidak ditemukan pertumbuhan mikroba, bahan yang diuji memenuhi syarat. Jika ditemukan pertumbuhan mikroba, bahan yang diuji tidak

memenuhi syarat.

UJI ENDOTOKSIN

UJI ENDOTOKSIN
UJI ENDOTOKSIN
UJI ENDOTOKSIN
UJI ENDOTOKSIN

Pendahuluan

Produk farmasi parenteral

Pendahuluan Produk farmasi parenteral Produk-produk farmasi parenteral harus steril karena pemberian langsung ke sistem

Produk-produk farmasi parenteral harus steril karena pemberian langsung ke sistem sirkulasi pembuluh darah.

Salah satu tahap : Sterilisasi

Produk parenteral terkadang terkontaminasi oleh ENDOTOKSIN

Bagaimana produk parenteral

dapat terkontaminasi endotoksin?

Pada proses sterilisasi produk parenteral

(menggunakan panas), bakteri gram negatif yang mungkin ada dalam produk, akan mati dan

lisis terjadi, endotoksin akan terlepas dan tetap

tinggal di dalam produk

Sifatnya stabil terhadap panas (heat-stable)

Endotoksin dan Pirogen

Endotoksin adalah toksin yang dihasilkan oleh bakteri gram negatif

Pirogen adalah senyawa yang menyebabkan kenaikan

suhu tubuh akibat penggunaan produk farmasi yang diberikan secara intravena

Semua endotoksin bersifat pirogen, tetapi tidak semua senyawa pirogen itu merupakan endotoksin

Endotoksin bakteri terdiri dari Lipopolisakarida (LPS), umumnya terikat pada protein dan fosfolipid. LPS ini

menyusun membran luar bakteri gram negatif.

Struktur LPS

Contoh : LPS dari Salmonella terdiri dari bagian Lipid A yang hidrofob yang terikat

pada suatu daerah inti yang mengandung

molekul KDO (2-keto-3-deoksioktonat)

Struktur LPS Salmonella

Mannose-Abequose

Rhamnose

Galactose

Struktur LPS Salmonella Mannose-Abequose Rhamnose Galactose Rantai samping n Glucose-N-acetylglucosamine Galactose

Rantai samping

n

Glucose-N-acetylglucosamine

Galactose

Glucose-Galactose

Heptulose

Heptulose-P-P-Ethanolamine

KDO

KDO-KDO-P-Ethanolamine

Glucose-Galactose Heptulose Heptulose-P-P-Ethanolamine KDO KDO-KDO-P-Ethanolamine P-GlcN-GlcN-P Lipid A Inti polisakarida

P-GlcN-GlcN-P

Glucose-Galactose Heptulose Heptulose-P-P-Ethanolamine KDO KDO-KDO-P-Ethanolamine P-GlcN-GlcN-P Lipid A Inti polisakarida

Lipid A

Inti polisakarida

Efek endotoksin bagi tubuh

demam

aktivasi sistem sitokin

rusaknya sel-sel endotelial

permeabilitas pembuluh darah berubah

sehingga menyebabkan turunnya tekanan

darah

dll.

Perkembangan regulasi tentang

uji pirogen

Bacterial endotoxin test (BET) merupakan salah satu uji yang penting terhadap produk parenteral dan alat kesehatan

1912 : uji pirogen dilakukan dengan metode kelinci (Rabbit test)

Digunakan dalam USP XII pada tahun 1942

sampai 40 tahun kemudian

1980 : metode baru diterapkan yaitu Limulus

amoebocyte lysate (LAL) test

LAL-test

The Limulus Amebocyte Lysate (LAL)

test adalah uji in vitro untuk deteksi dan

analisis kuantitatif endotoksin bakteri.

LAL diperoleh dari ekstrak cair amebosit Horseshoes crab (Limulus polyphemus

atau Tachypleus tridentatus)

Metode analisis LAL yang dilakukan

mencakup teknik gel-clot dan turbidimetri

kinetik dan kromogenik (kolorimetri)

Mengapa LAL test?

Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah metode alternatif terhadap rabbit

pyrogen test yang difokuskan pada deteksi

senyawa pirogen dalam produk, untuk

menghindari penggunaan hewan/binatang

dalam percobaan

Metode lebih akurat

Limulus amebocyte lysate

Lisat diperoleh dari amubosit kepiting landam kuda (Limulus polyphemus atau Tachypleus tridentatus

Penggunaan LAL untuk deteksi endotoksin berawal dari pengamatan Bang (1956) bahwa infeksi bakteri gram negatif pada Limulus polyphemus menyebabkan

koagulasi intravaskular yang parah.

Th 1964, Levin and Bang kemudian menunjukkan bahwa

penggumpalan itu merupakan hasil reaksi antara

endotoksin dan protein yang dapat menggumpal dalam amubosit.

Solum (1970, 1973) dan Young (1972),

melakukan pemurnian dan karaterisasi protein

yang dapat bergumpal dari reaksi LAL dan

menunjukkan bahwa reaksi dengan endotoksin merupakan reaksi enzimatik.

Reaksi pembentukan gel (clot) spontan antara endotoksin (LPS) bakteri dan protein dalam amebosit.

Reaksi pembentukan gel (clot) spontan

antara endotoksin (LPS) bakteri dan protein dalam amebosit.

Reaksi pembentukan gel (clot) spontan antara endotoksin (LPS) bakteri dan protein dalam amebosit.

Limulus polyphemus (horseshoe crab)

Limulus polyphemus (horseshoe crab)
Horseshoe crab African Wolf Spider
Horseshoe crab
African Wolf Spider
• Pembentukan gel padat pada titik akhir reaksi sebagai hasil reaksi antara LAL dan endotoksin.

Pembentukan gel padat pada titik akhir reaksi sebagai hasil reaksi antara LAL dan endotoksin.

Reagen LAL + larutan uji dalam tabung reaksi dengan volume yang

sama.

Inkubasi 37°C±2°C selama 60 menit±1 menit.

Reaksi (+) : gel stabil dan melekat pada dasar tabung bila dibalikkan 180º.

Reaksi (-) : gel kental,

terlepas dari dasar tabung

bila dibalikkan 180º.

pada dasar tabung bila dibalikkan 180º. • Reaksi (-) : gel kental, terlepas dari dasar tabung

Alat

Tabung reaksi,

pipet ukur, pengocok vorteks,

oven, inkubator.

Alat-alat gelas dibuat

bebas pirogen : oven 200ºC selama 4 jam.

reaksi, pipet ukur, pengocok vorteks, oven, inkubator. Alat-alat gelas dibuat bebas pirogen : oven 200ºC selama

REAGEN LAL

ekstrak amebosit dalam kepiting

landam kuda,

Limulus

polyphemus

(Atlantic horseshoe crab)

REAGEN LAL • ekstrak amebosit dalam kepiting landam kuda, Limulus polyphemus ( Atlantic horseshoe crab)

REAGEN TAL

Tachypleus

Amebocyte Lysate (TAL): ekstraksi Amebocyte Tachypleus

tridentatus

(Japanese

horseshoe crab

atau Chinese

horseshoe crab)

Amebocyte Lysate (TAL): ekstraksi Amebocyte Tachypleus tridentatus ( Japanese horseshoe crab atau Chinese horseshoe crab)

Bahan :

Reagen TAL 0,125

EU/ml ,

Control Standar

Endotoksin (CSE) 10

EU/ml,

Reagent Water (RW),

Sampel : Aqua pro injeksi.

TAL 0,125 EU/ml , • Control Standar Endotoksin (CSE) 10 EU/ml, • Reagent Water (RW), •
TAL 0,125 EU/ml , • Control Standar Endotoksin (CSE) 10 EU/ml, • Reagent Water (RW), •

Tahapan Sebelum Uji LAL terhadap

sampel

Uji konfirmasi kepekaan lisat

Optimasi kondisi percobaan

Verifikasi atau Validasi metode (*sesuai keperluan di Laboratorium uji)

Uji terhadap sampel

• Untuk mengecek kepekaan/sensitivitas reagen TAL, apakah sesuai dengan yang tercantum pada label. • Dibuat

Untuk mengecek kepekaan/sensitivitas

reagen TAL, apakah sesuai dengan yang

tercantum pada label.

Dibuat 4 seri pengenceran (2λ; λ; 0,5λ dan

0,25λ) dari CSE dalam 4 replikasi dan kontrol negatif (RW)

Persyaratan : Kadar rata-rata geometrik titik akhir harus ≥ 0,5λ dan ≤ 2,0λ .

Penyiapan Larutan CSE Penyiapan Kontrol Negatif (LRW) Penyiapan Kontrol Positif (CSE) Penyiapan Sampel 1. Sampel

Penyiapan Larutan CSE

Penyiapan Larutan CSE Penyiapan Kontrol Negatif (LRW) Penyiapan Kontrol Positif (CSE) Penyiapan Sampel 1. Sampel 2.

Penyiapan Kontrol Negatif (LRW)

Penyiapan Larutan CSE Penyiapan Kontrol Negatif (LRW) Penyiapan Kontrol Positif (CSE) Penyiapan Sampel 1. Sampel 2.

Penyiapan Kontrol Positif (CSE)

Kontrol Negatif (LRW) Penyiapan Kontrol Positif (CSE) Penyiapan Sampel 1. Sampel 2. Sampel Tercemar Penyiapan

Penyiapan Sampel

1. Sampel

2. Sampel Tercemar

(CSE) Penyiapan Sampel 1. Sampel 2. Sampel Tercemar Penyiapan Kontrol Sediaan Positif (Sampel + CSE) Penambahan

Penyiapan Kontrol Sediaan Positif (Sampel + CSE)

Tercemar Penyiapan Kontrol Sediaan Positif (Sampel + CSE) Penambahan Reagen LAL Inkubasi 37ºC±1ºC, 60 menit±2 menit
Tercemar Penyiapan Kontrol Sediaan Positif (Sampel + CSE) Penambahan Reagen LAL Inkubasi 37ºC±1ºC, 60 menit±2 menit

Penambahan Reagen LAL

Tercemar Penyiapan Kontrol Sediaan Positif (Sampel + CSE) Penambahan Reagen LAL Inkubasi 37ºC±1ºC, 60 menit±2 menit

Inkubasi 37ºC±1ºC, 60 menit±2 menit

0,1ml 0,1ml 0,2ml 0,5ml 1,0ml 1,0 ml RW 1,5 ml RW 1,4 ml RW 1,5
0,1ml 0,1ml 0,2ml 0,5ml 1,0ml
0,1ml
0,1ml
0,2ml
0,5ml
1,0ml
1,0 ml RW
1,0
ml
RW
1,5 ml RW
1,5
ml
RW
0,1ml 0,1ml 0,2ml 0,5ml 1,0ml 1,0 ml RW 1,5 ml RW 1,4 ml RW 1,5 ml

1,4

ml

RW

0,1ml 0,2ml 0,5ml 1,0ml 1,0 ml RW 1,5 ml RW 1,4 ml RW 1,5 ml RW
1,5 ml RW
1,5
ml
RW

1,0 ml RW

0,2ml

RW 1,5 ml RW 1,4 ml RW 1,5 ml RW 1,0 ml RW 0 , 2
1,8 ml RW
1,8
ml
RW
3,1 ml RW
3,1
ml
RW

8 λ =

4 λ =

2λ =

λ =

0,5 λ =

0,25 λ =

1 EU/ml

0,5EU/ml

0,25

0,125

0,0625

0,03125

 

EU/ml

EU/ml

EU/ml

EU/ml

CSE 10 EU/ml

(10/0,125 x λ

=

80 λ)

Pengenceran Maksimum yang Absah (PMA=MVD)

Batas kadar endotoksin

PMA =

Kepekaan (λ)

0,25 EU/ml

0,125 EU/ml

= 2

Jadi, sampel ini hanya dapat diencerkan maksimal 1: 2

• Optimasi kondisi dilakukan dengan melakukan variasikan suhu dan atau waktu inkubasi.

Optimasi kondisi dilakukan dengan

melakukan variasikan suhu dan atau

waktu inkubasi.

Parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode Parameter Kualitatif (ID) Perhitungan

Parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi

metode

Parameter

Kualitatif (ID)

Perhitungan

Perhitungan Kembali

Perhitunga

Performa

Kembali

Kategori III

n Kembali Kategori III

Analitik

Kategori I

Kuantitatif

Batas Tes

Akurasi

tidak

ya

ya

*

*

Presisi

Tidak

ya

ya

tidak

ya

Spesifisitas

ya

ya

ya

ya

*

Batas Deteksi

ya

tidak

tidak

ya

*

BatasiKuantit

Tidak

tidak

ya

tidak

*

asu

Linearitas

tidak

ya

ya

tidak

*

Rentang

Tidak

Ya

ya

tidak

*

Ketangguhan

ya

ya

ya

ya

ya

* mungkin dibutuhkan, bergantung pada sifat tes yang spesifik

Contoh

LAL Reagent

Sensitivitas : 0,125 EU/ml

Lot No. : Y4661L

Exp. Date : 09 2011

Kemasan : Vial @ 5,2 ml

CSE Potency :

500 NG/Vial (2,5 ml)

Lot No. : EM 84632

Exp. Date : 03 -2012

Kemasan : Vial @ 2,5 ml

ml • CSE Potency : 500 NG/Vial (2,5 ml) • Lot No. : EM 84632 •
 

Hasil Uji Konfirmasi Kepekaan (λ)

 

Repli

K (-)

 

CSE

 

E

Log E

kasi

RW

2λ

λ

0,5λ

0,25λ

(EU/ml)

 
 

1

-

+ +

 

+

-

0,0625

-1,204

 

2

-

+ +

 

-

-

0,125

-0,903

 

3

-

+ +

 

-

-

0,125

-0,903

 

4

-

+ +

 

-

-

0,125

-0,903

 

Jumlah

-3, 913

Perhitungan Rata- Rata Geometrik kadar Titik Akhir

GM = antilog Σe/f

Σe

= jumlah logaritma kadar titik akhir dari seri pengenceran yang digunakan

f

= jumlah replikasi GM = antilog -3,913/4 = 0,105 EU/ml

Persyaratan : Kadar rata-rata geometrik titik akhir harus ≥ 0,5λ dan ≤ 2,0λ . (≥ 0,0625EU/ml dan ≤ 0,25EU/ml)

Kesimpulan : Memenuhi syarat

Hasil Pengujian dengan LAL

Re

K (-)

Kontrol Positif

Kontrol

 

Sampel

pli

RW

Sediaan

               

kas

 

2λ

λ

0,5λ

0,25

Positif

Neat

1:2

1:4

1:8

i

λ

Pengujian 1

 

1

-

+ +

   

- -

+ +

   

+ +

+

2

-

+ +

   

- -

+ +

   

+ +

+

Pengujian 2

 

1

-

+ +

   

+ -

+ +

   

+ +

+

2

-

+ +

   

- -

+ +

   

+ +

+

Pengujian 3

 

1

 

- +

+

 

+ -

+ +

   

+ +

+

2

 

- +

+

 

- -

+ +

   

+ +

+

1:16

-

-

-

-

-

-

Hasil Pengujian dengan TAL

Rep

K (-)

Kontrol Positif

Kontrol

 

Sampel

 

li

RW

Sediaan

 
               

kasi

 

2λ

λ

0,5λ

0,25λ

Positif

Neat

1:2

1:4

1:8

Pengujian 1

 

1

 

- +

-

-

 

- +

+ +

 

-

-

2

 

- +

-

-

 

- +

+ +

 

-

-

Pengujian 2

 

1

-

+ -

 

-

 

- +

+ +

 

-

-

2

-

+ -

 

-

 

- +

+ +

 

-

-

Pengujian 3

 

1

 

- +

-

-

 

- +

+ +

 

-

-

2

 

- +

-

-

 

- +

+ +

 

-

-

Pengujian 4

 

1

 

- +

-

-

 

- +

+ +

 

-

-

2

 

- +

-

-

 

- +

+ +

 

-

-

Pengujian dengan Toksinometer
Pengujian dengan Toksinometer
Alat
Alat

Teknik Kinetik-Turbidimetri

Endotoxin mengaktifkan enzim pada LAL menghasilkan gelatinasi

coagulin dalam LAL,

sehingga meningkatkan turbiditas sampel

Perubahan transitans selama

kurun waktu tertentu diukur

(kinetik) utk mengukur waktu gelatinasi dari awal smp akhir reaksi.

Gelation time (waktu

gelatinasi) secara langsung berhubungan dengan jumlah endotoksin dalam sampel

Hasil Pengujian
Hasil Pengujian

Kurva Baku

 

Run Time (Menit)

Pengenceran

Tg

Mean Tg

¼λ

48,2

47,80

47,4

½λ

43,2

43,30

43,4

λ

35,0

35,00

35,0

2λ

29,0

29,10

29,2

35,0 35,00 35,0 2 λ 29,0 29,10 29,2 Persamaan : Log (Tg) = -0,2400 Log (C)

Persamaan :

Log (Tg) = -0,2400 Log (C) + 1,326

r = -0,9909

Persyaratan nilai r ≥-0,980

(USP 30 : 112)

Hasil Pengujian
Hasil Pengujian

Sampel uji diicemari dengan endotoksin :

- Sampel neat = 0,4761 EU/ml

- Sampel 1 : 2

= ½ x 0,4761 EU/ml = 0,2381

Pen

 

Sampel

   

guji

 

Neat

 

1:2

an

T

[

]

Rata-

Rata-

%

T

[

]

Rata-

Rata-

%

 

rata

rata

recov

 

rata T

rata

recove

T

[

]

ery

[

]

ry

1

26,0

0,4258

25,9

0,4320

90,73

30,6

0,2154

31,2

0,2001

84,04

25,8

0,4382

31,8

0,1848

2

25,0

0,3931

25,0

0,3931

82,57

28,4

0,2560

29,0

0,2393

100,50

25,0

0,3931

29,6

0,2227

Persyaratan % recovery metode turbidimetri adalah 50% - 200% (USP 30 : 113)

Terima kasih