Chapter III-V Histo PDF

35
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental (true experimental designs)
dengan rancangan post test only control group design, menggunakan kelompok
kontrol dan kelompok perlakuan, dengan randomisasi sederhana. Hewan
percobaan yang digunakan adalah tikus jantan Wistar yang dibagi secara acak
menjadi 6 kelompok.
3.2 Lokasi dan Waktu
3.2.1 Lokasi Penelitian
Pemeliharaan dan perlakuan pada hewan percobaan dilakukan di Laboratorium
Farmasi Universitas Sumatera Utara (USU), Medan. Pemeriksaan KGD dengan
Spektrofotometer dilakukan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran USU.
Sedangkan pembuatan sediaan HE dan imunohistokimia dengan antibodi anti-
insulin pada jaringan pankreas dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi
Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor (IPB).
3.2.2 Waktu Penelitian
Penelitian ini berlangsung selama 12 minggu, dari bulan November 2013 sampai
dengan Januari 2014.
3.3 Populasi dan Sampel Penelitian
3.3.1 Populasi
Populasi penelitian ini adalah tikus Wistar jantan (Rattus novergicus) dengan
berat badan 150 250 g.
Universitas Sumatera Utara

36
3.3.2 Sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposive sampling. Penentuan besar
sampel dilakukan dengan menggunakan rumus Federer (1963).
Rumus Federer : (n-1) x (t-1) > 15
Keterangan:
n = jumlah sampel tiap kelompok
t = banyaknya kelompok
= (n 1) x (6 1) > 15
= (n 1) x 5 > 15
= 5n 5 > 15
= 5n > 20
= n > 4, dengan demikian, setiap kelompok terdapat minimal 4 ekor tikus Wistar
jantan. Untuk mencegah kekurangan sampel akibat kematian, peneliti memilih
menggunakan 6 ekor tikus Wistar jantan tiap kelompok dengan jumlah kelompok
sebanyak 6 kelompok sehingga jumlah seluruh subjek penelitian sebanyak 36
ekor. Sampel jaringan untuk pengukuran morfologi sel pankreas akan diambil
secara acak sebanyak 4 ekor setiap kelompoknya. Begitu juga dengan sampel
darah untuk pemeriksaan KGD.
3.4 Variabel Penelitian
3.4.1 Variabel Bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah :
a. Ekstrak etanol jamur tiram Putih (Pleurotus ostreatus) 200 mg/kgBB dan 250
mg/kgBB
b. Streptozotocin 30 mg/kgBB

37
c. Pakan tinggi lemak (high fat diet) berupa kuning telur bebek 1 cc/tikus/hari
3.4.2 Variabel Terikat
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah kadar gula darah (KGD) dan
gambaran sel pankreas secara imunohistokimia.
3.4.3 Variabel Kendali
Variable kendali adalah variabel luar yang dapat dikendalikan melalui
homogenisasi, yaitu:
a. Umur : Tikus berusia 2 - 3 bulan.
b. Variasi genetik : Tikus Wistar (Rattus novergicus)
c. Jenis kelamin : Semua tikus yang digunakan dalam penelitian ini berjenis
kelamin jantan.
d. Suhu lingkungan : Tikus ditempatkan dalam ruangan dengan suhu 2830 C.
e. Jenis makanan : Tikus mendapatkan makanan berupa pakan standar,
diberikan pada tikus dua kali sehari, setiap pagi dan sore hari berupa pellet
dengan dosis 20 g/ekor/hari.
f. Kondisi psikologis : Pengaruh ini dapat dikurangi dengan adanya waktu
adaptasi sebelum percobaan dan pemisahan subyek penelitian dalam kandang
yang terpisah.
3.5 Definisi Operasional
Ada beberapa uraian yang dianggap penting dalam penelitian ini, yaitu :
No Variabel Definisi Operasional Skala
1. Ekstrak etanol Ekstrak yang didapat dengan Nominal

jamur tiram putih menggunakan metode maserasi
(Pleurotus dengan pelarut etanol.
ostreatus)
2. Pakan tinggi Pakan tinggi lemak (HFD) adalah Nominal
lemak (high fat kuning telur bebek sebanyak 1

38
diet) cc/tikus/hari.
3. Streptozotocin STZ dosis rendah adalah STZ Nominal
dosis rendah sebanyak 30 mg/kgBB (Bas et al.,
2012; Parveen et al., 2011) yang
diberikan kepada kelompok P1, P2 dan
P3 dengan jalan injeksi
intraperitoneal.
4. KGD Kadar Gula Darah (KGD) adalah Numerik
kadar glukosa di dalam serum darah.
Pengambilan darah dilakukan dengan
memotong ujung ekor sebanyak 1
mm, lalu darah diambil dengan cara
diteteskan pada stik pemeriksaan
glukosa darah.
5. Sel pankreas Sel pankreas adalah sel yang Numerik
memproduksi hormon insulin untuk
mempertahankan KGD tetap dalam
batas normal yang dihitung pada
sediaan imunohistokimia dengan cara
mengambil 5 pulau Langerhans, lalu
dihitung jumlah total dari area sel ,
lalu dibagi 5.
3.6 Etika Penggunaan Hewan
Penggunaan dan penanganan hewan di laboratorium penelitian dilakukan sesuai
dengan aturan etika penelitian hewan coba yang diatur dalam Deklarasi Helsinki
untuk memperoleh Ethical clearance dari komite etik dan komite ilmiah
penelitian FMIPA Biologi USU Medan.
3.7 Alat dan Bahan
3.7.1 Alat
Alat- alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain:
a. Timbangan digital (Kern) dengan kapasitas 600 gram dengan skala terkecil
0,000 untuk menimbang berat badan tikus.
b. Timbangan digital dengan kapasitas 10 gram dengan skala terkecil 0,0000
untuk menimbang Streptozotocin.

39
c. Kandang tikus (ukuran 50 x 30 x 20 cm3) yang diberi kawat penutup, lengkap
dengan tempat pakan dan minum sebanyak 8 buah sebagai tempat
pemeliharaan tikus.
d. Spuit 1 cc.
e. Gelas ukur untuk mengukur jamur tiram putih.
f. Seperangkat alat ekstraksi untuk mengekstrak jamur tiram putih, antara lain:
oven, alat penggiling, toples maserasi, corong pisah, rotary evaporator, dan
freeze dryer.
g. Jarum sonde untuk memasukkan ekstrak jamur tiram putih melalui oral ke
tikus percobaan.
h. Cawan petri sebagai tempat pengeringan ekstrak.
i. Alat-alat untuk bedah tikus terdiri atas papan wax, jarum, pinset anatomis,
pinset chirurgis, gunting, scalpel, dan penyemprot alkohol.
3.7.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah:
a. Konsentrat pakan yang diperoleh dari PT. Charoen Pokphan, Tanjung
Morawa, Medan, dengan komposisi hasil analisis yang terinci sebagai
berikut: kadar air 14%, protein kasar 18-20%, lemak kasar 4-7%, serat kasar
4-7%, abu 5-7%, kalsium 0,70-1%, fosfor 0,6%.
b. Streptozotocin, produk Nacalai Tesque, Jepang.
c. Buffer citrate dengan pH 4,5 sebagai pelarut Streptozotocin untuk injeksi
intraperitoneal.
d. Pakan tinggi lemak, berupa kuning telur bebek.

40
e. Ekstrak etanol jamur tiram putih, diberikan sesuai dengan dosis yang telah
ditentukan. Jamur tiram putih yang diperoleh dari pusat budidaya jamur tiram
Khalisa Agro Mushroom, beralamat di Jl. Tampok Tanjung Selamat Gg. Seni
no.2, Sunggal Sumatera Utara
f. Etanol 96%.
g. Aquadest.
3.8 Prosedur Penelitian
3.8.1 Persiapan Hewan Percobaan
Tikus diaklimatisasi selama satu minggu dan ditempatkan di dalam kandang
yang terbuat dari bahan plastik (ukuran 50 x 30 x 20 cm3) yang ditutup dengan
kawat kasa. Setiap kandang diisi paling banyak 5 ekor tikus. Tikus yang sakit saat
aklimatisasi segera di ganti dengan tikus lain dengan kriteria yang sama yang
diambil secara acak. Dasar kandang dilapisi dengan sekam padi setebal 0,5 1 cm
dan diganti setiap tiga hari. Cahaya ruangan dikontrol persis 12 jam terang (pukul
06.00 sampai dengan pukul 18.00) dan 12 jam gelap (pukul 18.00 sampai dengan
pukul 06.00), sedangkan suhu dan kelembaban ruangan dibiarkan berada pada
kisaran alamiah. Diberikan makanan standard yang sama untuk tiap kelompok,
sedangkan pemberian minuman diberikan secara ad libitum. Pemberian makanan
dan minuman disuplai setiap hari.
Penelitian diawali dengan mempersiapkan tikus Wistar jantan usia 2 3 bulan
sejumlah 36 ekor yang diadaptasi selama 7 hari dengan pemberian pakan standar.
Berat badan tikus ditimbang sebagai data dasar. Tikus kemudian dikelompokkan
secara acak menjadi 6 kelompok, tiap kelompok terdiri dari 6 ekor.

41
3.8.2 Ransum Pakan Standar
Ransum pakan standar adalah makanan bagi semua tikus selama penelitian
dengan dosis 20 g/ekor/hari. Ransum pakan dibuat berdasarkan diet murni dari
PT. Charoen Pokphan, Tanjung Morawa, Medan.
3.8.3 Pemberian Air Minum
Air minum untuk semua tikus adalah aquadest. Air minum diberikan ad libitum.
3.8.4 Pembagian Kelompok dan Pemberian Perlakuan
Pembagian kelompok dan pemberian perlakuan pada penelitian ini adalah:
a. Tikus sebanyak 36 ekor dibagi dalam enam kelompok secara random
sehingga dalam satu kelompok terdiri atas enam ekor tikus. Pembagian
kelompoknya adalah :
i. Kelompok P0 = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi
minum aquadest, pakan biasa selama 56 hari, dan suntikan citrate
buffer pada hari ke 15 dan 22.
ii. Kelompok P1 = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi
perlakuan diet tinggi lemak selama 14 hari, lalu diberikan suntikan STZ
dosis rendah 30 mg/kgBB pada hari ke 15 & 22.
iii. Kelompok P2 = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi
perlakuan diet tinggi lemak bersamaan dengan ekstrak etanol jamur
tiram putih 200 mg/kgBB selama 2 minggu, yang kemudian diberikan
suntikan STZ dosis rendah 30 mg/kgBB pada hari ke 15 dan 22, lalu
pemberian ekstrak etanol jamur tiram putih terus dilanjutkan sampai 1
minggu setelahnya.

42
iv. Kelompok P3 = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi
perlakuan diet tinggi lemak bersamaan dengan ekstrak etanol jamur
tiram putih 250 mg/kgBB selama 2 minggu, yang kemudian diberikan
suntikan STZ dosis rendah 30 mg/kgBB pada hari ke 15 dan 22, lalu
pemberian ekstrak etanol jamur tiram putih terus dilanjutkan sampai 1
minggu setelahnya.
v. Kelompok P4 = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi
dosis rendah 30 mg/kgBB pada hari ke 15 dan 22, lalu diberikan ekstrak
etanol jamur tiram putih sebanyak 200 mg/kgBB selama 28 hari.
vi. Kelompok P5 = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi
dosis rendah 30 mg/kgBB pada hari ke 15 dan 22, lalu diberikan ekstrak
etanol jamur tiram putih sebanyak 250 mg/kgBB selama 28 hari.
b. Pemberian pakan tinggi lemak (kuning telur bebek) dilakukan dengan cara
pencekokan dan dilakukan setiap hari pada pukul 09.00 WIB.
c. Pemberian ekstrak etanol jamur tiram putih dilakukan dengan cara
pencekokan dan dilakukan setiap hari pada pukul 14.00 WIB.
d. Penyuntikan STZ dosis rendah (30 mg/kgBB) dilakukan dengan sebelumnya
tikus dipuasakan semalaman, lalu pagi pada pukul 09.00 WIB sebelum
pemberian pakan tinggi lemak dilakukan penyuntikan STZ intraperitoneal.
e. Selama 7 hari tikus diadaptasikan dengan lingkungan tempat penelitian dan
diberi makanan standar untuk tikus.
f. Berat badan awal tikus ditimbang.

43
g. Setelah 58 hari perlakuan, dilakukan dislokasi leher tikus. Abdomen dibuka
dengan insisi mid-line, dilakukan pemisahan pankreas, lalu pankreas
direndam didalam formalin buffer untuk selanjutnya dilakukan pembuatan
sediaan histologi.
h. Dilakukan analisis dari data-data KGD dan gambaran imunohistokimia area
sel beta pankreas.
3.8.5 Pembuatan Ekstrak Etanol Jamur Tiram Putih (Pleurotus ostreatus)
3.8.5.1.Proses pengambilan bahan
Bahan yang digunakan adalah jamur Pleurotus ostreatus yang masih segar dan
baru dipanen. Pengambilan bahan dilakukan dengan cara purposif tanpa
membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan diperoleh
dari pusat budidaya jamur tiram Khalisa Agro Mushroom, beralamat di Jl.
Tampok Tanjung Selamat Gg. Seni no.2, Sunggal Sumatera Utara.
3.8.5.2.Proses pembuatan ekstrak
Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif
dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai.
Kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk
yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah
ditetapkan. Ekstrak cair adalah sediaan cair simplisia nabati, yang mengandung
etanol sebagai pelarut atau sebagai pengawet atau sebagai pelarut dan pengawet.
Ekstrak cair yang cenderung membentuk endapan dapat didiamkan dan disaring
atau bagian yang bening dienaptuangkan. Beningan yang diperoleh memenuhi
persyaratan farmakope. Ekstrak cair dapat dibuat dari ekstrak yang sesuai.
(Depkes, 1995)

44
Berikut prosedur pembuatan ekstrak etanol jamur tiram putih hingga dalam
bentuk suspensi yang siap diberikan kepada tikus :
1. Sebanyak 25 kg jamur tiram putih pasca panen, keseluruhan bagian jamur
dipotong-potong tipis lalu dikeringkan. Pengeringan menggunakan oven pada
suhu 38 40 0C sampai potongan buah benar-benar kering (rapuh). Lamanya
waktu yang dibutuhkan untuk pengeringan sekitar 4-5 hari. Berat jamur setelah
dikeringkan sekitar 2874 g.
2. Jamur yang telah benar-benar kering ini dihaluskan dengan menggunakan alat
penggiling. Hasil penggilingan diperoleh serbuk (simplisia) sekitar 1421,5 g.
Simplisia ini kemudian diekstrak dengan menggunakan metode maserasi.
3. Maserasi dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 1000 g simplisia
direndam di dalam 4 liter larutan etanol 96% yang sebelumnya telah didestilasi.
Perendaman dilakukan selama 3 hari 3 malam sambil sesekali diaduk. Setelah 3
hari, campuran simplisia dan pelarut kemudian disaring kedalam penyaring.
Residu yang dihasilkan dari penyaringan tersebut direndam kembali dengan
pelarut yang sama sebanyak 4 liter selama 3 hari 3 malam, kemudian disaring
kembali. Siklus ini diulang sekali lagi dengan cara yang sama. Filtrat yang
diperoleh dari hasil penyaringan, diuapkan menggunakan rotary evaporator pada
kisaran temperatur 40 60 0C, dan diperolehlah ekstrak kental jamur PO
sebanyak 540,2 g.
4. Selanjutnya ekstrak kental ini dikeringkan dengan menggunakan freeze dryer
untuk menguapkan pelarut yang masih tersisa, hingga diperoleh ekstrak kering
jamur PO sebanyak 254,3 g. Selanjutnya ekstrak kering akan dijadikan suspensi
dengan pelarut Na-CMC 1%.

45
5. Pembuatan larutan Na-CMC 1%. Na-CMC ditimbang seberat 20 g dan
dilarutkan dalam 400 mL aquadest. Na-CMC dibiarkan mengambang diatas
aquadest selama kurang lebih 15 menit sambil diaduk. Setelah terbentuk massa
yang homogen (merata) ditambahkan air ke dalam massa tersebut hingga
diperoleh volume 2000 mL sambil terus diaduk.
6. Pembuatan suspensi ekstrak etanol jamur PO (Suspensi 4 %). Pembuatan
suspensi ekstrak etanol jamur dilakukan setiap hari. Ekstrak kering jamur PO
ditimbang sebanyak 0,6 g dan dimasukkan ke dalam lumpang. Kemudian
ditambahkan 10 mL larutan Na-CMC 1% sedikit demi sedikit sambil dilakukan
penggerusan supaya didapatkan larutan yang homogen. Larutan yang sudah
homogen selanjutnya dipindahkan ke dalam gelas ukur dan ditambahkan lagi Na-
CMC hingga volume akhir 15 ml. Suspensi ini kemudian diberikan secara oral ke
tikus dengan dosis 200 mg/kgBB dan 250 mg/kgBB tikus.
3.8.6 Penentuan Dosis
1. Perhitungan dosis ekstrak etanol jamur tiram puti
Dosis ektrak jamur tiram putih yang digunakan untuk berbagai kondisi
patologis adalah antara 200-250 mg/kg BB tikus (Isai et al. 2009). Dosis
ekstrak jamur tiram putih yang digunakan pada penelitian ini adalah sebesar
200 mg/kg BB dan 250 mg/kgBB. Tikus ditimbang berat badannya setiap
minggu, dan larutan ekstrak etanol jamur tiram putih akan diberikan sesuai
dengan berat badan masing-masing tikus. Perhitungan dosis mingguan
dilakukan dengan mempertimbangkan besar kadar air pada ekstrak jamur PO
yang digunakan pada penelitian ini yaitu sekitar 8%.
2. Perhitungan dosis kuning telur bebek

46
Kuning telur bebek diberikan sebanyak 1 cc/tikus/hari dengan melihat
kapasitas lambung tikus yang bisa menampung 3-5 cc. Pada penelitian
sebelumnya dengan dosis 1 cc bisa meningkatkan kadar kolesterol dan berat
badan tikus dalam waktu 2 minggu.
3. Perhitungan dosis STZ
Dosis STZ yang diberikan adalah dosis rendah multipel sebanyak 30 mg/kgBB
yang dilarutkan dalam citrate buffer pH 4,5. Jika seminggu setelah penyuntikan
pertama tidak terjadi kenaikan KGD diatas 140 mg/dL maka dilakukan
penyuntikan ke-2 (Srinivasan et al., 2005).

47
3.8.7 Alur Penelitian
Secara skematis, alur alur penelitian ini ditunjukkan pada Gambar 3.1.
Tikus jantan galur wistar, 36 ekor, 2-3 bulan, BB 150-250 gram
Adaptasi selama 7 hari
Tikus dibagi menjadi 6 kelompok
Kelompok kontrol P0 Kelompok P1 Kelompok P2 Kelompok P3 Kelompok P4 Kelompok P5
Akuades 0,5ml selama Akuades 0,5ml selama Akuades 0,5ml + HFD Akuades 0,5ml + HFD Akuades 0,5ml + HFD Akuades 0,5ml + HFD
56 hari 1 cc/hari 1 cc/hari 1 cc/hari 1 cc/hari
56 hari
+ selama 14 hari selama 14 hari selama 14 hari selama 14 hari
+ HFD 1 cc/hari (dilanjut dengan pakan (dilanjut dengan pakan (dilanjut dengan pakan (dilanjut dengan pakan
selama 14 hari biasa hingga hari ke 56) biasa hingga hari ke 56) biasa hingga hari ke 56) biasa hingga hari ke 56)
Pakan biasa selama 56
(dilanjut dengan pakan + + + +
hari biasa hingga hari ke 56) STZ 30 mg/kgBB IP STZ 30 mg/kgBB IP STZ 30 mg/kgBB IP STZ 30 mg/kgBB IP
+ hari ke 15 & 22 hari ke 15 & 22 hari ke 15 & 22 hari ke 15 & 22
+
STZ 30 mg/kgBB IP + + + +
Suntikan citrate buffer hari ke 15 & 22 Ekstrak PO 200 mg/kg Ekstrak PO 250 Ekstrak PO 200 Ekstrak PO 250
BB mg/kgBB mg/kgBB mg/kgBB
IP hari ke 15 & 22
Sampai hari ke 28 Sampai hari ke 28 Hari ke 29 - hari ke 56 Hari ke 29 - hari ke 56
Pengukuran KGD + pemeriksaan histologi pankreas (data post test)
Analisis data
Gambar 3.1 Alur Penelitian

48
3.9. Prosedur Pemeriksaan
3.9.1. Prosedur pembuatan preparat imunohistokimia
Pemeriksaan sel pankreas dengan membuat preparat imunohistokimia
dengan menggunakan metode paraffin. Tahap-tahap pembuatan preparat adalah
sebagai berikut:
1) Fiksasi
Pankreas yang sudah diambil melalui pembedahan difiksasi dalam larutan
buffer formalin 10%
2) Dehidrasi
Proses dehidrasi dilakukan secara bertahap. Pertama dilakukan dehidrasi
dalam larutan alkohol 50%, 70%, 80%, 95%, 100% dengan lama waktu yang
sama untuk setiap kadar alkohol yaitu 90 menit sebanyak 2 kali
3) Clearing
Pankreas dimasukkan kedalam larutan yang berisi xylol selama 90 menit
4) Infiltrasi
Proses infiltrasi dilakukan dengan memasukkan pankreas kedalam larutan
parafin 90 menit dan dilakukan sebanyak 2 kali. Infiltrasi dilakukan di dalam
oven dengan suhu 60 C
5) Embedding
Pankreas dan larutan paraffin dimasukkan kedalam cetakan blok paraffin dan
dibiarkan selama 3 jam atau sampai paraffin membeku
6) Sectioning
Blok paraffin yang sudah terbentuk dilakukan pemotongan dengan rotary
microtom. Jaringan dipotong dengan ketebalan 3 4 m dan diletakkan diatas

49
object glass poly-L-lysine, kemudian dibiarkan di inkubator selama semalam
pada suhu 40 C
7) Deparafinisasi
Preparat secara berurutan dimasukkan kedalam larutan xylol, alkohol 100%,
alkohol 95%, alkohol 80%, alkohol 70%, alkohol 50%, selama masing-
masing 90 menit sebanyak 2 kali
8) Peroxidase blocking dengan 0.3% H2O2 dalam methanol selama 20 menit
9) Preparat dicuci dengan Phosphat Buffer Saline (PBS) 10% sebanyak 3 x 5
menit.
10) Kemudian dilakukan non-specific blocking dengan 10 % serum normal
selama 30 menit.
11) Kemudian diinkubasi dengan antibody primer (anti insulin) di suhu 4C
selama 18 22 jam
12) Kemudian preparat dicuci dengan Phosphat Buffer Saline (PBS) 10%
sebanyak 3 x 5 menit.
13) Kemudian ditetesi dengan antibodi sekunder (universal antibody) selama 30
menit
14) Kemudian preparat dicuci dengan Phosphat Buffer Saline (PBS) 10%
sebanyak 3 x 5 menit.
15) Kemudian ditetesi dengan Chromogen 3,3 diaminobenzedine selama 5 10
detik.
16) Kemudian dicuci dengan aquadest
17) Diberi counterstain dengan Hematoxylin Mayer 5 10 detik dilanjutkan cuci
dengan air kran mengalir 10 15 menit

50
18) Dehidrasi dengan dimasukkan ke dalam alkohol 80%, alkohol 95%, alkohol
absolut xylol 2 kali
19) Mounting dengan menggunakan E. Z mount.
3.9.2. Prosedur Analisa Preparat Imunohistokimia
Pembacaan preparat imunohistokimia dilakukan dengan modifikasi metode
Rato dkk, menggunakan mikroskop cahaya dengan kamera otomatis (Matsuoka
Nissei, Japan) pada pembesaran 400x. Area yang terwarnai antibodi anti-insulin
(area sel beta) berwarna cokelat. Analisa data menggunakan software imageJ yang
dikembangkan oleh National Institutes of Health (NIH) Amerika Serikat. Analisa
menggunakan perbandingan antara regions of interest (ROI) pada masing-masing
gambar. Caranya adalah sebagai berikut:
- definisi manual dari ROI-1 yaitu pulau Langerhans.
- pengukuran area ROI-1
- definisi area sel beta pankreas ROI-2
- pengukuran ROI-2
Dari hasil tersebut didapatlah persentase sel beta pankreas yang ada dalam sebuah
pulau Langerhans (Rato et. al., 2013). Hasilnya didapatkan dengan
membandingkan antara satu area sel beta pankreas dengan rata-rata keseluruhan
area pulau Langerhans. Persentase pada satu sampel didapatkan dari hasil rata-rata
5 pulau Langerhans pada setiap sampelnya.
3.9.3 Prosedur Pemeriksaan KGD
Pemeriksaan KGD dilakukan dengan menggunakan kit Diasys dan
spektrofotometer. Sebanyak 10 l serum direaksikan dengan 1000 l reagen,
dicampur dengan bantuan vortex selama 1 menit. Pembacaan aktivitas KGD

51
dilakukan pada panjang gelombang 500 nm, pada suhu 20 25 C. Kadar Gula
Darah dalam satuan mg/dL dapat diukur dengan alat spektrofotometer dengan
menggunakan metode GOD-PAP. Glukosa ditentukan setelah oksidasi enzimatis
dengan adanya glukosa oksidase, hidrogen peroksida yang terbentuk akan
bereaksi dengan adanya peroksidase dengan phenol serta 4-aminophenazone
menjadi warna quinoneimine yang berwarna merah violet (Kurniasari, 2004).
Hasil pembacaan dari alat spektrofotometer dicatat, kemudian KGD dihitung
dengan menggunakan rumus di bawah ini :
Perhitungan:
Glucose (mg/dL) = [A sample/A Std/Cal] x Conc.Std/Cal [mg/dl]
3.10 Analisis Data
Analisis data pada penelitian ini berdasarkan data KGD dan jumlah sel
pankreas yang mengalami degenerasi pada seluruh kelompok percobaan. Data
dipresentasikan dalam bentuk rata-rata simpangan baku (rata-rata SD).
Terlebih dahulu dilakukan analisis normalitas data dengan uji normalitas Shapiro-
Wilk karena jumlah sampel < 50 dan uji varians dengan uji Levene. Jika data
berdistribusi normal dan homogen maka dilakukan uji One Way Anova. Bila pada
uji ANOVA diperoleh hasil p < 0,05, maka dilanjutkan dengan melakukan
analisis uji Post Hoc Bonferroni untuk melihat perbedaan antara kelompok
perlakuan.
Jika distribusi data tidak normal dan atau tidak homogen, barulah dilakukan
uji Kruskal Wallis. Untuk melihat perbedaan antara kelompok perlakuan
mengunakan uji Mann Whitney. Semua analisis data dilakukan dengan

52
menggunakan SPSS. Dalam penelitian ini, hanya perbedaan rata-rata pada
0,05 yang dianggap nyata (bermakna/signifikan) (Dahlan, 2009)

53
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Identifikasi dan Skrining Jamur Tiram Putih
Hasil pemeriksaan dan identifikasi jamur tiram putih Pleurotus ostreatus
adalah sebagai barikut (lampiran 1):
Tabel 4.1 Hasil Identifikasi dan Klasifikasi Jamur Tiram
Identifikasi: Klasifikasi:
Tubuh buah putih-krem Kingdom : Fungi
Pilleus berbentuk setengah Phylum : Basidiomycota
lingkaran seperti cakram Class : Agaricomycetes
Tangkai buah tumbuh Order : Agaricales
menyamping Family : Pleurotaceae
Diameter pilleus 5 20 cm Genus : Pleurotus
Miselia berwarna putih Spesies : Pleurotus ostreatus
Hasil skrining fitokimia adalah sebagai berikut (lampiran 2 dan 3):

Tabel 4.2 Hasil Skrining Fitokimia untuk Simplisia dan Ekstrak
Simplisia Ekstrak
Alkaloida : (+) Alkaloida : (-)
Saponin : (+) Saponin : (+)
Flavonoida : (+) Flavonoida : (+)
Triterpen : (+) Triterpen : (+)
Glikosida : (+) Glikosida : (+)
Kadar air : 9,96 % Kadar air : 8 %

54
Tabel 4.3 Hasil Standarisasi Simplisia Jamur Pleurotus ostreatus
Karakterisasi Hasil
Penetapan kadar air 9,96 %
Penetapan kadar sari larut air 44,91%
Penetapan kadar sari larut etanol 3,9 %
Penetapan kadar abu total 10,89 %
Penetapan kadar abu tidak larut asam 1,48 %
4.2 Hasil Penelitian

Berdasarkan pengukuran dari penelitian yang telah dilakukan, didapatkan
beberapa data seperti kadar gula darah (KGD) dan jumlah area sel beta pankreas
tikus wistar jantan. Data yang disajikan akan dipisahkan antara kelompok
preventif dan kelompok kuratif.
4.2.1 Hasil Pengukuran Kelompok Preventif
4.2.1.1 Pengukuran kadar gula darah
Pengukuran kadar gula darah (KGD) menggunakan spektrofotometer
dilakukan untuk menilai tinggi rendahnya kadar gula darah pada tikus wistar
jantan kelompok preventif yang nantinya akan dibandingkan dengan kadar gula
darah pada tikus wistar jantan kelompok kontrol.
Tabel 4.4 Rerata Pengukuran KGD pada Kelompok Preventif (mg/dl)
Kelompok Perlakuan n KGD (mg/dl) ( SD)
P0 4 127,75 20,55
P1 4 463,00 26,46
P2 4 250,75 57,25
P3 4 131,25 10,87
Ket. :
P0 : kontrol negatif (diberi citrate buffer)
P1 : diberi diet tinggi lemak dan STZ dosis rendah

55
P2 : diberi diet tinggi lemak dan STZ dosis rendah bersamaan dengan ekstrak
jamur tiram putih dengan dosis 200 mg/kgBB
Gambar 4.1 Grafik Rerata KGD Tikus pada Kelompok Preventif
Keterangan :
Grafik histogram pada perlakuan berbeda yang diikuti oleh huruf kecil yang sama,
berbeda tidak bermakna pada taraf uji 5% (p<0,05)
P0 : kelompok kontrol negatif (diberi citrate buffer)
Data pada tabel 4.4 diubah kedalam bentuk grafik histogram seperti yang
tertera pada Gambar 4.1. Pada pengujian normalitas (lampiran 5) dan
homogenitas data (lampiran 6), didapati bahwa sebaran data normal dan data
bervariasi secara homogen sehingga dilakukan analisa data dengan uji one way
ANOVA.

56
Dari hasil uji one way ANOVA, disimpulkan bahwa paling tidak terdapat
perbedaan KGD antara dua kelompok perlakuan. Untuk mengetahui kelompok
mana yang mempunyai perbedaan pada hasil pengukuran ini, maka dilanjutkan
dengan analisis Post Hoc Bonferroni (lampiran 7). Hasil uji akan ditunjukkan
dengan perbedaan notasi pada masing-masing kelompok perlakuan.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat perbedaan bermakna antara
kelompok P2 dan P3 jika dibandingkan dengan kelompok P1. Sementara antara P0
dengan P2 memperlihatkan perbedaan yang bermakna, antara kelompok P0 dengan
P3 tidak memperlihatkan perbedaan yang bermakna.
4.2.1.2 Perhitungan luas area sel beta pankreas
Dilakukan pewarnaan khusus imunohistokimia dengan menggunakan antibodi
anti-insulin pada jaringan histologi pankreas tikus wistar jantan kelompok
preventif ini. Pewarnaan imunohistokimia dilakukan untuk melihat berapa jumlah
area sel beta pankreas dalam satu pulau Langerhans, dimana antibodi anti-insulin
mewarnai sel beta pankreas dengan warna cokelat. Gambar 4.2, 4.3, 4.4, dan 4.5
menunjukkan perbedaan gambaran imunohistokimia antibodi anti-insulin
pankreas pada masing-masing kelompok perlakuan preventif. Gambaran potongan
penampang histologi pada kelompok P1 memperlihatkan pulau Langerhans yang
mengecil dan area sel beta yang semakin sedikit, dibandingkan dengan potongan
penampang histologi pada kelompok P0, dimana kelompok P1 diberi diet tinggi
lemak selama 2 minggu dilanjutkan dengan suntikan STZ dosis rendah.
Sedangkan pada kelompok P2 dan P3, terlihat pulau Langerhans dengan ukuran
ireguler dengan jumlah area sel beta yang lebih sedikit dibandingkan kelompok P0
namun masih relatif lebih banyak bila dibandingkan dengan P1.

57
Islet of
Langerhan
s
-cell
area
50 m
Gambar 4.2 Gambaran Imunohistokimia Antibodi Anti-Insulin Pankreas Tikus

Kelompok P0 yang Diberi Citrate Buffer. Pembesaran 10 x 40.
-cell
area
Islet of
Langerhan
s
50 m

Kelompok P1 yang Diberi Diet Tinggi Lemak dan STZ dosis rendah. Pembesaran
10 x 40.

58
-cell
area
Islet of
Langerha
ns
50 m

Kelompok P2 yang Diberi Diet Tinggi Lemak dan STZ dosis rendah bersamaan
dengan Ekstrak Jamur PO 200 mg/kgBB. Pembesaran 10 x 40.
Islet of
-cell Langerhan
area s
50 m

Kelompok P3 yang Diberi Diet Tinggi Lemak dan STZ dosis rendah bersamaan
dengan Ekstrak Jamur PO 250 mg/kgBB. Pembesaran 10 x 40.

59
Jumlah area sel beta pankreas pada satu sampel dihitung dengan cara mencari
rata-rata 5 pulau Langerhans dari satu sediaan jaringan pankreas yang diamati di
bawah mikroskop dengan pembesaran 400x.
Tabel 4.5 Rerata Perhitungan Area Sel Beta pada Kelompok Preventif (%)
Kelompok Perlakuan n Area Sel Beta (%) ( SD)
P0 4 74,38 10,61
P1 4 23,04 3,69
P2 4 49,16 14,13
P3 4 62,10 7,25
Keterangan :
Gambar 4.6 Grafik Rerata Jumlah Area Sel Beta Pankreas pada Kelompok
Preventif

60
Keterangan :
homogenitas data (lampiran 9), didapati bahwa sebaran data normal dan bervariasi
secara homogen. Dengan demikian data yang diperoleh memenuhi syarat untuk
dilakukan analisa data dengan uji one way ANOVA.
dengan analisa Post Hoc Bonferroni (lampiran 10). Hasil uji akan ditunjukkan
kelompok P2 dan P3 dengan kelompok P1. Sementara itu antara P0 dengan P2
memperlihatkan perbedaan yang bermakna, antara kelompok P0 dengan P3 tidak
memperlihatkan perbedaan yang bermakna.
4.2.2 Hasil Pengukuran Kelompok Kuratif
4.2.2.1 Pengukuran kadar gula darah
Pengukuran kadar gula darah (KGD) menggunakan spektrofotometer
dilakukan untuk menilai tinggi rendahnya kadar gula darah pada tikus wistar

61
jantan kelompok kuratif yang nantinya akan dibandingkan dengan kadar gula
darah pada tikus wistar jantan kelompok kontrol.
Tabel 4.6 Rerata Pengukuran KGD pada Kelompok Kuratif (mg/dl)
Kelompok Perlakuan n KGD (mg/dl) ( SD)
P0 4 127,75 20,55
P1 4 463,00 26,46
P4 4 314,00 108,18
P5 4 331,00 124,33
Ket. :
P0 : kontrol negatif (diberi citrate buffer)
P4 : diberi diet tinggi lemak dan STZ dosis rendah, lalu diberi ekstrak jamur
tiram putih dengan dosis 200 mg/kgBB
Gambar 4.7 Grafik Rerata KGD Tikus pada Kelompok Kuratif

62
Keterangan :
homogenitas data (lampiran 12), didapati bahwa sebaran data normal namun data
tidak bervariasi secara homogen. Dengan demikian data yang diperoleh tidak
memenuhi syarat untuk dilakukan analisa data dengan uji one way ANOVA.
Maka dilakukanlah transformasi data menggunakan rumus transformasi
logaritma, dengan acuan nilai slope dan power (lampiran 13). Hasil transformasi
data ternyata tidak menjadikan variasi data homogen (lampiran 14) sehingga
dilakukan bootstrap pada data yang ada. Setelah dilakukan bootstrap, didapati
bahwa sebaran data normal dan bervariasi secara homogen. Dengan demikian data
yang diperoleh memenuhi syarat untuk dilakukan analisa data dengan uji one way
ANOVA (lampiran 15).
dengan analisa Post Hoc Bonferroni (lampiran 16). Hasil uji akan ditunjukkan
Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan bermakna
antara kelompok P4 jika dibandingkan dengan kelompok P0, namun antara

63
kelompok P5 dengan P0 terdapat perbedaan yang bermakna. Sementara antara P1
dengan P4 dan P5 tidak memperlihatkan perbedaan yang bermakna. Demikian juga
antara P4 dan P5 tidak ditemukan adanya perbedaan yang bermakna.
4.2.2.2 Perhitungan Luas Area Sel Beta Pankreas
Dilakukan pewarnaan khusus imunohistokimia dengan menggunakan antibodi
anti-insulin pada jaringan histologi pankreas tikus wistar jantan kelompok kuratif
ini. Pewarnaan imunohistokimia dilakukan untuk melihat berapa jumlah area sel
beta pankreas dalam satu pulau Langerhans, dimana antibodi anti-insulin
mewarnai sel beta pankreas dengan warna cokelat. Gambar 4.8, 4.9, 4.10, dan
4.11 menunjukkan perbedaan gambaran imunohistokimia antibodi anti-insulin
pankreas pada masing-masing kelompok perlakuan kuratif. Gambaran potongan
penampang histologi pada kelompok P1 memperlihatkan pulau Langerhans yang
mengecil dan area sel beta yang semakin sedikit, dibandingkan dengan potongan
penampang histologi pada kelompok P0 yang diberi diet tinggi lemak selama 2
minggu dilanjutkan dengan suntikan STZ dosis rendah. Sedangkan pada
kelompok P4 dan P5, terlihat pulau Langerhans dengan ukuran ireguler dan jumlah
area sel beta yang sedikit dan hampir sama dibandingkan dengan kelompok P1.

64
Islet of
Langerhan
s
-cell
area
50 m

Kelompok P0 yang Diberi Citrate Buffer. Pembesaran 10 x 40.
-cell
area
Islet of
Langerhan
s
50 m

Kelompok P1 yang Diberi Diet Tinggi Lemak dan STZ dosis rendah. Pembesaran
10 x 40.

65
Islet of
Langerha -cell
ns area
50 m

Kelompok P4 yang Diberi Diet Tinggi Lemak dan STZ dosis rendah, lalu diberi
Ekstrak Jamur PO 200 mg/kgBB. Pembesaran 10 x 40.
Islet of
-cell Langerhan
area s
50 m

Kelompok P4 yang Diberi Diet Tinggi Lemak dan STZ dosis rendah, lalu diberi
Ekstrak Jamur PO 250 mg/kgBB. Pembesaran 10 x 40.

66
Jumlah area sel beta pankreas pada satu sampel dihitung dengan cara mencari
rata-rata 5 pulau Langerhans dari satu sediaan jaringan pankreas yang diamati di
bawah mikroskop dengan pembesaran 400x.
Tabel 4.7 Rerata Perhitungan Area Sel Beta pada Kelompok Kuratif (%)
Kelompok Perlakuan n Area Sel Beta (%) ( SD)
P0 4 74,38 10,61
P1 4 23,04 3,69
P4 4 28,63 5,41
P5 4 32,37 6,53
Keterangan :
Gambar 4.12 Grafik Rerata Jumlah Area Sel Beta Pankreas pada Kelompok
Kuratif (%)

67
Keterangan :
homogenitas data (lampiran 18), didapati bahwa sebaran data normal dan
bervariasi secara homogen. Dengan demikian data yang diperoleh memenuhi
syarat untuk dilakukan analisa data dengan uji one way ANOVA.
dengan analisa Post Hoc Bonferroni. Hasil uji akan ditunjukkan dengan
perbedaan notasi pada masing-masing kelompok perlakuan.
kelompok P4 dan P5 dengan kelompok P0. Sementara itu antara P1 dengan P2 dan
P3 tidak memperlihatkan perbedaan yang bermakna, begitu pula antara kelompok
perlakuan P4 dengan P5 juga tidak memperlihatkan perbedaan yang bermakna.
4.3 Pembahasan Hasil Penelitian
Kerusakan area sel beta pankreas paling parah terjadi pada kelompok P1 yang
diberi diet tinggi lemak dan STZ dosis rendah. Hal ini sejalan dengan peningkatan
KGD yang bermakna pada kelompok P1 dibandingkan dengan kelompok lainnya.

68
Hasil ini juga sejalan dengan yang dikemukakan oleh Srinivasan (2005) bahwa
pemberian diet tinggi lemak selama 2 minggu yang dilanjutkan dengan suntikan
STZ dosis 35 mg/kgBB, memberikan gambaran paling mirip DM tipe 2 pada
hewan coba. Senada dengan yang dilakukan oleh Zhang dkk, juga membuktikan
pada hewan coba yang sebelumnya diberikan diet tinggi lemak lalu diberikan
injeksi STZ dosis 30 mg/kgBB sebanyak 2 kali merupakan cara yang lebih stabil
untuk membentuk DM tipe 2 pada hewan coba (Zhang et al., 2008).
Streptozotocin yang disintesis dari Streptomycetes achromogenes telah lama
digunakan sebagai zat penginduksi diabetes. Cara kerjanya melalui GLUT2
menyebabkan alkilasi DNA yang pada akhirnya menyebabkan kerusakan DNA.
Kerusakan DNA nantinya akan menyebabkan hambatan sintesis dan sekresi
insulin (Szkudelski, 2001). Berdasarkan penelitian Kakkar dkk, tikus yang
diinduksi STZ mengalami peningkatan pada aktivitas enzim antioksidan, dimana
oxidative stress menyebabkan kerusakan jaringan pankreas dan menyebabkan
diabetes mellitus (Kakkar et al., 1998)
Kerusakan area sel beta pankreas pada kelompok preventif P2 dan P3 terlihat
lebih sedikit dibandingkan dengan kelompok P1 (p < 0,05). Dimana jumlah area
sel beta P3 tidak berbeda secara bermakna dibandingkan dengan P0. Hasil ini juga
didukung oleh data pemeriksaan KGD pada ketiga kelompok tersebut. Sejalan
dengan penelitian Nosalova dkk (2001) bahwa pemberian ekstrak pleuran dari
PO dapat meningkatkan aktivitas enzim antioksidan, yang mengurangi kadar
glutathione kolon yang nantinya mengurangi lesi prakanker di kolon (Noslov
et al., 2001). Hal senada juga terjadi pada penelitian yang dilakukan oleh
Jayakumar dkk (2006), dimana dilakukan pemberian ekstrak jamur PO pada tikus

69
wistar yang kemudian diinduksi dengan CCl4-. Saat dilakukan pemeriksaan enzim
antioksidan hepar, kelompok yang mendapat ekstrak PO memperlihatkan
peningkatan enzim antioksidan yang signifikan (Jayakumar et al., 2006).
Hasil karakterisasi jamur tiram memperlihatkan adanya senyawa polifenol
yang terkandung didalam jamur tiram yaitu flavonoid (lampiran 2 dan 3).
Senyawa polifenol merupakan senyawa antioksidan utama yang ditemukan pada
PO (Iwalokun & Usen, 2007; Chirinang & Intarapichet, 2009). Konsentrasi
senyawa polifenol paling banyak yang terdapat dalam PO adalah protocatechuic
acid (PCA) (Alam et al., 2010; Reis et al., 2012), diikuti oleh gallic acid dan
chlorogenic acid (CGA). Senyawa polifenol sebagai antioksidan menghambat
aktivitas penangkalan-radikal bebas secara luas sebagai donor hidrogen atau
sebagai alat donor-elektron, juga sebagai pengikat ion logam (Alam et al., 2010).
Kerusakan area sel beta pankreas pada kelompok kuratif P4 dan P5 terlihat
tidak jauh berbeda dari kelompok P1. Begitu juga dengan KGD pada kelompok P4
dan P5 yang juga tidak jauh berbeda dari KGD pada kelompok P1. Streptozotocin
melalui GLUT2 menyebabkan alkilasi DNA yang pada akhirnya menyebabkan
kerusakan DNA. Kerusakan DNA nantinya akan menyebabkan hambatan sintesis
dan sekresi insulin (Szkudelski, 2001). Pada hasil analisa area sel beta pankreas
kelompok P4 dan P5, memperlihatkan jumlah area sel beta yang sedikit sebagai
akibat dari perlakuan diet tinggi lemak dan suntikan STZ dosis rendah. Dan
meskipun sudah diberikan ekstrak PO sebagai perlakuan kuratif, hanya memberi
sedikit perbedaan tidak bermakna dengan kelompok kontrol positif P1. Hal ini
memberikan gambaran kepada kita bahwa ekstrak PO yang diberikan sebagai

70
perlakuan kuratif tidak memiliki kemampuan memperbaiki sel beta pankreas
secara bermakna.
Berdasarkan penjelasan di atas maka dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol
jamur PO dapat mencegah kerusakan sel beta pankreas namun tidak dapat
memperbaiki sel beta pankreas yang sudah rusak.

71
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
1. Jumlah area sel beta pankreas yang mengalami kerusakan pada kelompok
preventif (dosis 200 mg/kgBB dan 250 mg/kgBB) lebih sedikit secara
bermakna (p < 0,05) dibandingkan dengan kelompok kontrol positif yang
diberi pakan tinggi lemak dan streptozotocin dosis rendah
2. KGD pada kelompok preventif lebih rendah secara bermakna (p < 0,05)
dibandingkan dengan kelompok kontrol positif yang diberi pakan tinggi
lemak dan streptozotocin dosis rendah
3. Jumlah area sel beta pankreas yang mengalami kerusakan pada kelompok
kuratif (dosis 200 mg/kgBB dan 250 mg/kgBB) tidak berbeda secara
bermakna (p > 0,05) dibandingkan dengan kelompok kontrol positif yang
diberi pakan tinggi lemak dan streptozotocin dosis rendah
4. KGD pada kelompok kuratif tidak berbeda secara bermakna (p > 0,05)
dibandingkan dengan kelompok kontrol positif yang diberi pakan tinggi
lemak dan streptozotocin dosis rendah.
Kesimpulan dari penelitian ini adalah jamur tiram putih (Pleurotus ostreatus)
dapat mencegah terjadinya kerusakan sel beta pankreas, namun jamur ini tidak
bisa memperbaiki kerusakan sel beta pankreas pada tikus wistar jantan Diabetes
Mellitus tipe 2 yang diberi pakan tinggi lemak dan STZ dosis rendah
5.2. Saran
Untuk dapat menjelaskan hal-hal lain yang terkait penelitian ini dan guna
aplikasi lanjut nantinya, maka peneliti menyarankan agar:
1. Ada baiknya dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai komponen apa
saja yang terdapat pada jamur tiram putih (Pleurotus ostreatus) ini yang
bisa mencegah terjadinya kerusakan sel beta pankreas dengan metode
Bioassay Directed Isolation

72
2. Ada baiknya dilakukan penelitian lanjutan untuk membuktikan efek
kuratif jamur tiram putih terhadap sel beta pankreas menggunakan metode
dan waktu yang berbeda dari penelitian ini
3. Dilakukan penelitian lanjutan untuk pengembangan jamur tiram putih
(Pleurotus ostreatus) sebagai bahan obat yang aman digunakan untuk
manusia

Chapter III-V Histo PDF

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Chapter III-V Histo PDF

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

35

3.1 Jenis Penelitian

Penelitian ini adalah penelitian eksperimental (true experimental designs)

kontrol dan kelompok perlakuan, dengan randomisasi sederhana. Hewan

3.2 Lokasi dan Waktu

3.2.1 Lokasi Penelitian

Pemeliharaan dan perlakuan pada hewan percobaan dilakukan di Laboratorium

Farmasi Universitas Sumatera Utara (USU), Medan. Pemeriksaan KGD dengan

Spektrofotometer dilakukan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran USU.

Sedangkan pembuatan sediaan HE dan imunohistokimia dengan antibodi anti-

insulin pada jaringan pankreas dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi

Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor (IPB).

3.2.2 Waktu Penelitian

dengan Januari 2014.

3.3 Populasi dan Sampel Penelitian

berat badan 150 250 g.

Universitas Sumatera Utara

Pengambilan sampel dilakukan secara purposive sampling. Penentuan besar

sampel dilakukan dengan menggunakan rumus Federer (1963).

Rumus Federer : (n-1) x (t-1) > 15

n = jumlah sampel tiap kelompok

jantan. Untuk mencegah kekurangan sampel akibat kematian, peneliti memilih

sebanyak 6 kelompok sehingga jumlah seluruh subjek penelitian sebanyak 36

darah untuk pemeriksaan KGD.

3.4 Variabel Penelitian

3.4.1 Variabel Bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah :

Universitas Sumatera Utara

3.4.2 Variabel Terikat

gambaran sel pankreas secara imunohistokimia.

3.4.3 Variabel Kendali

Variable kendali adalah variabel luar yang dapat dikendalikan melalui

a. Umur : Tikus berusia 2 - 3 bulan.

b. Variasi genetik : Tikus Wistar (Rattus novergicus)

d. Suhu lingkungan : Tikus ditempatkan dalam ruangan dengan suhu 2830 C.

e. Jenis makanan : Tikus mendapatkan makanan berupa pakan standar,

dengan dosis 20 g/ekor/hari.

f. Kondisi psikologis : Pengaruh ini dapat dikurangi dengan adanya waktu

adaptasi sebelum percobaan dan pemisahan subyek penelitian dalam kandang

3.5 Definisi Operasional

No Variabel Definisi Operasional Skala

1. Ekstrak etanol Ekstrak yang didapat dengan Nominal

Universitas Sumatera Utara

Penggunaan dan penanganan hewan di laboratorium penelitian dilakukan sesuai

penelitian FMIPA Biologi USU Medan.

3.7 Alat dan Bahan

Alat- alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain:

0,000 untuk menimbang berat badan tikus.

b. Timbangan digital dengan kapasitas 10 gram dengan skala terkecil 0,0000

untuk menimbang Streptozotocin.

Universitas Sumatera Utara

c. Kandang tikus (ukuran 50 x 30 x 20 cm3) yang diberi kawat penutup, lengkap

dengan tempat pakan dan minum sebanyak 8 buah sebagai tempat

e. Gelas ukur untuk mengukur jamur tiram putih.

h. Cawan petri sebagai tempat pengeringan ekstrak.

pinset chirurgis, gunting, scalpel, dan penyemprot alkohol.

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

a. Konsentrat pakan yang diperoleh dari PT. Charoen Pokphan, Tanjung

Morawa, Medan, dengan komposisi hasil analisis yang terinci sebagai

4-7%, abu 5-7%, kalsium 0,70-1%, fosfor 0,6%.

b. Streptozotocin, produk Nacalai Tesque, Jepang.

c. Buffer citrate dengan pH 4,5 sebagai pelarut Streptozotocin untuk injeksi

d. Pakan tinggi lemak, berupa kuning telur bebek.