INTRODUCCIN

La tincin de Gram es de gran importancia en microbiologa porque permite diferenciar dos grupos
de bacterias (Gram+ y Gram-) segn se comporten antes esta tincin. El fundamento radica en las
diferencias de su pared celular, mientras la bacterias Gram+ tienen pared gruesa, las bacterias
Gram- la tiene ms delgada, logrando la distincin con diferentes colorantes. Por otro lado, la
tincin Ziehl Neelsen es una tcnica de tincin rpida y econmica, este mtodo se basa en que
ciertas paredes de algunas bacterias contienen cidos grasos que les confieren la propiedad de
resistir la coloracin con alcohol-acido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esta
razn se denominan acido alcohol resistencia o BAAR. En el siguiente informe se conocer y
explicar el fundamento y procedimiento de cada uno de estas tinciones.

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 MARCO TERICO
Tincin de Gram
Esta tincin desarrollada por el doctor Christian Gram en 1884, es hoy la ms utilizada en los
laboratorios de microbiologa y permite, de acuerdo a la estructura y grosor de la pared
bacteriana, agrupar a las bacteria en Gram positivas y Gram negativas. La Gram positivas poseen
una capa gruesa de peptidoglucano y carecen de membrana externa, mientras la Gram negativas
tienen una capa ms delgada de peptidoglucano y poseen una membrana externa.

Algunas bacterias se clasifican como Gram variable, pues simultneamente presentan tincin de
Gram positivas y de Gram negativas, aun bajo condiciones ptimas de cultivo. Sin embargo, en su
estructura poseen una pared de Gram positivas, aunque la capa de peptidoglucano es ms delgada
que la mayora de Gram positivas.

Esta tincin adems, correlaciona con propiedades como como endotoxinas, susceptibilidad a
antibiticos, sensibilidad o resistencia a sales biliares, punto isoelctrico y tensin superficial.

Existen variaciones de esta tcnica, pero en trminos generales, la tincin Gram involucra varios
pasos:

1) Tincin inicial:
Las clulas se tien con cristal violeta, lo cual es el colorante primario. En este paso todas
las clulas se ties de morado.
2) Mordente:
Se adiciona yoduro (lugol) que reacciona con cristal violeta y forma un complejo violeta-
yoduro. En este punto todas las clulas continan de color morado.
3) Decoloracin:
Se adiciona un solvente no polar, el cual acta lavando el complejo cristal violeta-yoduro
de las clulas Gram negativas. De esta manera las bacterias Gram positivas continan
moradas y las Gram negativas quedan incoloras. Este es el paso critico de esta tincin,
pues si se exagera, se decolora las Gram positivas y si se hace muy dbil, no decolora las
Gram negativas.
4) Contratincin:
Se vuelve a teir con safranina o fucsina, de manera que las bacterias Gram negativas, que
haban sido decoloradas, se tien de rosado a fucsia segn el colorante empleado; en
tanto, las bacterias Gram positivas no se afectan con la contratincin y permanecen
moradas debido a lo intenso de esta coloracin.

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Tincin de Ziehl Neelsen
Esta es una de las tinciones ms utilizadas en el laboratorio para la identificacin de
Mycobacterium spp. (Agente causantes de tuberculosis y lepras). A pesar de la sensibilidad de la
tincin en la deteccin de la M. tuberculosis con respecto al cultivo oscila entre 42% y 43%, se
emplea universalmente dado su bajo costo y facilidad. Su sensibilidad aumenta cuando se analiza
ms de una muestra de un mismo paciente, asi mismo, vara segn los mtodos de
decontaminacin y concentracin de las muestras.

Esta tincin es til para extendidos hechos a partir de una muestra clnica, como puede ser esputo,
el macerado de un rgano, una impregnacin por aposicin con un rgano o un extendido de una
suspensin de bacterias de un cultivo. Tambin se utiliza una modificacin de esta tincin para
cortes histolgicos.

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 PARTE EXPERIMENTAL
En la prctica realizada se hizo solo con la tincin Gram. Sin embargo, el profesor encargado nos
dio una muestra de M. tuberculosis hecha con la tincin de Ziehl Neelsen.

Tincin Gram

Materiales:
- Placas con colonias de Staphylococcus, Enterococcus, Basillus, E. coli
Proteus y Salmonella.
- Laminas portaobjeto limpio y desengrasado.
- Mechero bunsen
- Microscopio con lente de inmersin
- Cristal violeta, lugol, alcohol-acetona, safranina
- Piseta con agua destilada
- Papel lente y alcohol isoproplico
Procedimiento:
- Desengrasar el portaobjeto con una gota de alcohol y secarlo con un
pedazo de algodn.
- Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjeto,
flamear el asa de siembra y tomar en condiciones aspticas una pequea
cantidad de cultivo bacteriano. Dejar que se extienda y dejar secar al aire.
- Fijar al calor, pasando la lmina de la llama de un mechero.
- Cubrir la superficie con cristal violeta y dejar en contacto durante un
minuto. Lavar con abundante agua.
- Cubrir con lugol durante un minuto. Lavar con abundante agua.
- Inclinar el portaobjeto y dejar gotear el alcohol acetona hasta que el
preparado deje de perder color. Lavar con abundante agua.
- Cubrir con fucsina un minuto. Lavar con abundante agua.
- Dejar secar y observar en el microscopio con una pequea gota de aceite
de inmersin.

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 RESULTADOS
o Tincin Gram
A) Bacterias Gram positivas: al aadir el reactivo cristal violeta se puede observar que las
bacterias son de color morado.

Bacillus

Staphylococcus

B) Bacterias Gram negativas: al aadir el reactivo fucsina, estas bacterias se ven color
rosadas o fucsia en el microscopio.

Salmonella.

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 DISCUSIN
Despus de realizar los pasos de la tincin Gram se pudo observar la diferencia de las bacterias
Gram positivas y Gram negativas. Las primeras se observaron de color morado ya que estas
retienen el complejo cristal violeta-yoduro, por el contrario, las bacterias Gram negativas se
observan de color rosado o fucsia debido a la absorcin de safranina o fucsina. En algunos casos,
despus de haber hecho todo el procedimiento de tincin Gram, las bacterias Gram positivas se
observan parcialmente o completamente rosadas debido a la edad del cultivo, las clulas viejas
tienden a perder su capacidad de retener el complejo cristal violeta-yoduro y por lo tanto se vern
rosadas.

Aunque esta tcnica parece simple, su realizacin con un alto grado de confiabilidad requiere
prctica y experiencia por lo que el estudiante tendr la oportunidad de practicarla en numerosas
oportunidades.

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 CUESTIONARIO
I. Que factores influyen en una correcta tincin Gram?

Adems de una excesiva decoloracin, otro factor que puede influir en que las
bacterias Gram positivas se observen parcial o completamente rosadas, es la edad del
cultivo, las clulas tienden a perder su capacidad de retencin del complejo cristal
violeta-yoduro y por lo tanto las bacterias se vern rosadas. Otro factor de variabilidad
podra ser condiciones de estrs durante el cultivo, que genera forma Gram negativas
no viables, dentro de un cultivo de Gram positivas.

II. Que funciones tiene el lugol y el alcohol acetona en la tincin Gram?

Se adiciona el lugol para que ste reaccione con el cristal violeta y forme un complejo
para que las bacterias Gram positivas, con pared celular gruesa, puedan retenerlo; y el
alcohol acetona se usa para que se d la salida del colorante cristal violeta de las
bacterias Gram negativas.

III. Para qu se utiliza el aceite de inmersin?

La funcin del aceite de inmersin es restringir el movimiento de la muestra, adems

de evitar el rozamiento entre el cubre objetos y el objetivo, generalmente se lo utiliza
cuando vamos a observar con el objetivo 100x. Otra funcin del aceite de inmersin es
evitar que la luz se desve; al contrario lo que se pretende es que la luz llegue
concentrada hacia la muestra.

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 BIBLIOGRAFA
-Eduardo Santambrosio. Tincion y observacin de microorganismos (2009). Documento de
internet disponible en
https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practico4.pdf

-Evelyn Rodrguez Cavallini. Bacteriologa general: Principios y prcticas de laboratorio. Pg. (63-
68).

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