Anda di halaman 1dari 140

BAB 1.

IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN ALKALOIDA

I. TUJUAN

Mahasiswa mampu melakukan identifikasi senyawa golongan alkaloida dalam tanaman.

II. TINJAUAN PUSTAKA

a. Klasifikasi Lada Hitam


Menurut Tjitrosoepomo (2007) klasifikasi tanaman lada adalah sebagai berikut:
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Subdivisi : Angiospermae
Class : Dicotyledoeae
Ordo : Piperales
Familia : Piperaceae
Genus : Piper
Spesies : Piper nigrum L.
b. Ciri-ciri Tanaman Lada Hitam
Lada merupakan tanaman tahunan yang memanjat dari keluarga Piperaceae (Balittri,
2007). Tanaman lada memiliki akar tunggang dengan akar utama dapat menembus tanah
sampai kedalaman 1-2 meter. Batang tanaman lada berbuku-buku dan berbentuk sulur
yang dapat dikelompokkan menjadi empat macam sulur yaitu sulur gantung, sulur panjat,
sulur buah dan sulur tanah. Daun lada merupakan daun tunggal dengan duduk daun
berseling dan tumbuh pada setiap buku. Warna daun hijau muda pada waktu muda dan
daun tua berwarna hijau mengkilap pada permukaan atas. Pertulangan daun melengkung
dengan tepi daun bergelombang atau rata. Bunga-bunga terdapat pada cabang horizontal
yang tersusun dalam bulir atau untai. Buah lada termasuk buah buni berbentuk bulat
berwarna hijau dan pada waktu masak berwarna merah. Biji lada berwarna pitih coklat
dengan permukaan licin (Gambar 1) (Wahid, 1996)

1
Gambar 1. Tanaman Lada (Parthasarathy et al., 2008)

c. Kandungan Kimia dan Manfaat Buah Lada

Buah lada hitam mengandung bahan aktif seperti amida fenolat, asam fenolat, dan
flavonoid yang bersifat antioksidan sangat kuat. Selain mengandung bahan-bahan
antioksidan, lada hitam juga mengandung piperin yang diketahui berkhasiat sebagai obat
analgesik, antipiretik, anti inflamasi, serta memperlancar proses pencernaan (Meghwal
dan Goswami, 2012).
Kandungan lada hitam sangat beranekaragam dan piperin merupakan kandungan
utama (Gambar 2) serta kavisin yang merupakan isomer dari piperin. Piperin adalah
senyawa alkaloid (Evan, 1997) yang paling banyak terkandung dalam lada hitam dan
semua tanaman yang termasuk dalam famili Piperaceae. Senyawa amida (piperin) berupa
kristal berbentuk jarum, berwarna kuning, tidak berbau, tidak berasa, lama-kelamaan
pedas, larut dalam etanol, asam cuka, benzena, dan kloroform (Amaliana, 2008). Piperin
memiliki manfaat sebagai anti-inflamasi, antiarthritik (Bang et al., 2009; Sudjarwo,
2005), analgesik (Sudjarwo, 2005), depresan sistem safaf pusat dan anticonvulsan
(Deepthi et al., 2012). Kombinasi zat-zat yang terkandung mengakibatkan lada hitam
memiliki rasa pedas, berbau khas dan aromatik. Kandungan zat yang memberikan warna,
bau dan aroma dalam lada hitam adalah -terpinol, acetophenone, hexonal, nerol,
nerolidol, 1,8 cineol, dihydrocarveol, citral, -pinene dan piperolnol (Murthy dan
Bhattacharya, 2008). Lada hitam juga mengandung alkaloid, flavonoid, dan komposisi
aromatik, dan senyawa amida (Agbor et al., 2006).

Gambar 2. Struktur senyawa piperin (Epstein, 1993)

Flavonoid merupakan golongan metabolit sekunder yang terbesar dalam dunia


tumbuhan dan termasuk golongan polifenol. Senyawa flavonoid adalah senyawa polifenol
yang mempunyai 15 atom karbon, terdiri dari 2 cincin benzena yang dihubungkan
menjadi satu oleh rantai yang terdiri dari 3 atom karbon yang juga dapat ditulis sebagai
sistem C6 C3 C6. Flavonoid berperan sebagai antioksidan dengan cara mendonasikan
atom hidrogennya atau melalui kemampuannya mengkelat logam, berada dalam bentuk
glukosida (mengandung rantai samping glukosa) atau dalam bentuk bebas yang disebut

2
aglikon (Cuppett et al.,1954). Adapun kerangka dasar flavonoid dapat dilihat pada
Gambar 3.

Gambar 3. Kerangka dasar flavonoid (White and Xing, 1954)


Sebuah studi mengenai analisis struktur persenyawaan genus Piperaceae, telah
diidentifikasi 5 amida fenolat dari Piper nigrum, 7 senyawa dari P. retrofractum dan 2
senyawa dari P. baccatum. Semua senyawa amida fenolat tersebut memiliki aktivitas
antioksidan yang lebih efektif daripada antioksidan alami yaitu tokoferol. Satu
senyawa amida fenolat yakni feruperine memiliki aktivitas antioksidan yang sama
tingginya dengan antioksidan sintetik butil hidroksi anisol (BHA) dan butil hidroksi
toluena (BHT). Contoh senyawa amida fenolat antara lain acetyl coumaperine, N-Trans-
feruloyl piperidine, N-Trans-feruloyl tyramine,dan piperic acid . (Gambar 4) (Nakatani et
al.,1986).

Gambar 4. Struktur senyawa piperic acid (Nakatani et al.,1986)


Asam fenolat merupakan salah satu jenis metabolit sekunder yang banyak ditemukan
dalam berbagai jenis tumbuhan. Turunan asam hidroksibenzoat dan asam hidroksisinamat
adalah jenis asam fenolat yang banyak terdapat pada tumbuhan. Contoh senyawa asam
fenolat adalah asam p-kumarat (Gambar 5). Seperti senyawa flavonoid, asam fenolat
menetralkan radikal bebas dengan melepaskan proton (atom hidrogen) (Mattila dan
Helstrom, 2006).

3
Gambar 5. Asam pkumarat (Mattila dan Helstrom, 2006)
Kandungan kimia lain dalam lada hitam adalah saponin, minyak atsiri, kavisin, resin,
zat putih telur, amilum, piperilin, piperolein, poperanin, piperonal, dihdrokarveol,
kanyofillene oksida, kariptone, trans piocarrol, dan minyak lada. Lada hitam banyak
dimanfaatkan sebagai rempah-rempah dan obat. Lada juga memiliki manfaat untuk
kesehatan, antara lain melancarkan pencernaan dengan meningkatkan sekresi asam
lambung (Zeladmin, 2012), melonggarkan saluran pernapasan,dan melancarkan aliran
darah di sekitar kepala. Lada hitam termasuk bahan alami yang berpotensi sebagai
afrodisiak. Hal ini disebabkan kandungan piperin yang meningkatkan gairah seks
(Yunita, 2010).

d. Senyawa Alkaloid

Alkaloid adalah suatu golongan senyawa organik yang terbanyak ditemukan dialam.
Hampir seluruh senyawa alkaloida berasal dari tumbuh-tumbuhan dan tersebar luas
dalam berbagai jenis tumbuhan. Semua alkaloida mengandung paling sedikit satu atom
nitrogen yang biasanya bersifat basa dan sebagian besar atom nitrogen ini merupakan
bagian dari cincin heterosiklik. Hampir semua alkaloida yang ditemukan dialam
mempunyai keaktifan biologis tertentu, ada yang sangat beracun tetapi adapula yang
sangat berguna dalam pengobatan. Misalnya kuinin, morfin dan strikhnin, adalah
alkaloida yang terkenal dan mempunyai efek fisiologis dan psikologis. Alkaloida dapat
ditemukan dalam berbagai tumbuhan seperti biji, daun, ranting dan kulit batang.
Alkaloida umumnya ditemukan didalam kadar yang kecil dan harus dipisahkan dari
campuran senyawa yang rumit yang berasal dari jaringan tumbuhan. Banyak alkaloid
merupakan turunan asam amino lisin, ornitin, fenilalanin, asam nikotin, dan asam
antranilat. Asam aminodisintesis dalam tanaman dengan proses dekarboksilasi menjadi
amina, amina kemudian dirubah menjadi aldehida oleh amina oksida. Alkaloid biasanya
pahit dan sangat beracun.Alkaloid ini diklasifikasikan lagi berdasarkan tipe dasar kimia
pada nitrogen yang terkandung dalam bentuk heterosiklik. Klasifikasi alkaloid tersebut
meliputi pirrolizidine alkaloids, peperidine alkaloids, pyridine alkaloids, indole alkaloids,
quinolizidine alkaloids, steroidalkaloids, policyclic diterpene alkaloids, indolizidine
alkaloids, tryptamine alkaloids, tropane alkaloids, fescue alkaloid dan miscellaneous
alkaloid. Peranan alkaloid dalam jaringan tanaman tidak pasti, mereka telah dikenal
sebagai produk metabolik atau substansi.

Alkaloid dapat digolongkan sebagai berikut :


a. Alkaloid sejati
Alkaloid sejati adalah senyawa yang mengandung nitrogen pada struktur heterosiklik,
struktur kompleks, distribusi terbatas yang menurut beberapa ahli hanya ada pada
tumbuhan. Alkaloid sejati ditemukan dalam bentuk garamnya dan dibentuk dari asam
amino sebagai bahan dasar biosintesis.
b. Pseudoalkaloid
Pseudoalkaloid memiliki sifat seperti alkaloid sejati tetapi tidak diturunkan dari asam
amino.Contoh : isoprenoid, terpenoid (coniin), dan alkaloid steroidal (paravallarine).

4
c. Protoalkaloid
Protoalkaloid adalah senyawa amin sederhana dengan nitrogen tidak berada pada
cincin heterosiklik. Contoh : mescaline, betanin, dan serotonin.(Swastini, Dewa
Ayu.2007).

Sifat-SifatAlkaloid
a. Mengandung atom nitrogen yang umumnya berasal dari asam amino.
b. Umumnya berupa Kristal atau serbuk amorf.
c. Alkaloid yang berbentuk cair yaitu konini, nikotin dan spartein.
d. Dalam tumbuhan berada dalam bentuk bebas, dalam bentuk N-oksida atau dalam
bentuk garamnya.
e. Umumnya mempunyai rasa yang pahit.
f. Alkaloid dalam bentuk bebas tidak larut dalam air, tetapi larut dalam kloroform, eter
dan pelarut organik lainnya yang bersifat relative non polar.
g. Alkaloid dalam bentuk garamnya mudah larut dalam air.
h. Alkaloid bebas bersifat basa karena adanya pasangan elektron bebas pada atom N-
nya.
i. Alkaloid dapat membentuk endapan dengan bentuk iodide dari Hg, Au dan logam
berat lainnya (dasar untuk identifikasi alkaloid).

e. Identifikasi Senyawa Alkaloid

1. Berdasarkan sifat spesifik.


Alkaloid dalam larutan HCl dengan pereaksi Mayer dan Bouchardhat membentuk
endapan yang larut dalam alkohol berlebih. Protein juga memberikan endapan, tetapi
tidak larut dalam dalam alkohol berlebih.
2. Berdasarkan bentuk basa dan garam-nya / Pengocokan
Alkaloid sebagai basanya tidak larut dalam air, sebagai garamnya larut baik dalam
air. Sebaiknya pelarut yang digunakan adalah pelarut organik : eter dan kloroform.
Pengocokan dilakukan pada pH : 2, 7, 10 dan 14. Sebelum pengocokan, larutan harus
dibasakan dulu, biasanya menggunakan natrium hidroksida, amonia pekat, kadang-
kadang digunakan natrium karbonat dan kalsium hidroksida.
3. Reaksi Gugus Fungsionil
a. Gugus Amin Sekunder
Reaksi SIMON: larutan alkaloida + 1% asetaldehid + larutan na. nitroprussida = biru-
ungu. Hasil cepat ditunjukkan oleh Conilin, Pelletierin dan Cystisin. Hasil lambat
ditunjukkan oleh Efedrin, Beta eucain, Emetin, Colchisin dan Physostigmin.
b. Gugus Metoksi
Larutan dalam Asam Sulfat + Kalium Permanganat = terjadi formaldehid, dinyatakan
dengan reaksi SCHIFF. Kelebihan Kalium Permanganat dihilangkan dengan Asam
Oksalat. Hasil positif untuk Brucin, Narkotin, koden, Chiksin, Kotarnin, Papaverin,
Kinidin, Emetin, Tebain, dan lain-lain.
c. Gugus Alkohol Sekunder
Reaksi SANCHES : Alkaloida + Larutan 0,3% Vanilin dalam HCl pekat, dipanaskan

5
diatas tangas air = merah-ungu. Hasil positif untuk Morfin, Heroin, Veratrin, Kodein,
Pronin, Dionin, dan Parakonidin.
d. Gugus Formilen
Reaksi WEBER & TOLLENS : Alkaloida + larutan Floroglusin 1% dalam Asam
Sulfat (1:1), panaskan = merah.
Reaksi LABAT : lkaloida + Asam Gallat + asam Sulfat pekat, dipanaskan diatas
tangas air = hijau-biru.Hasil positif untuk Berberin, Hidrastin, Kotarnin, Narsein,
Hidrastinin, narkotin, dan Piperin.
4. Pereaksi untuk analisa lainnya
a. Iodium-asam hidroklorida
Merupakan pereaksi untuk golongan Xanthin. Digunakan untuk pereaksi penyemprot
pada lempeng KLT (Kromatografi Lapis Tipis) dimana akan memberikan hasil
dengan noda ungu-biru sampai coklat merah.
b. Iodoplatinat
Pereaksi untuk alkaloid, juga sebagai pereaksi penyemprot pada lempeng KLT
dimana hasilnya alkaloid akan tampak sebagai noda ungu sampai biru-kelabu.
c. Pereaksi Meyer (Larutan kalium Tetraiodomerkurat) Merupakan
pereaksi pengendap untuk alkaloid.
f. Pemisahan KLT

Thin Layer Chromatography (TLC)


Kromatografi lapis tipis adalah salah satu contoh kromatografi planar. Fase diamnya
(Stationary Phase) berbentuk lapisan tipis yang melekat pada gelas/kaca, plastik,
aluminium. Sedangkan fase geraknya (Mobile Phase) berupa cairan atau campuran
cairan, biasanya pelarut organi dan kadangkadang juga air. Fase diam yang berupa
lapisan tipis ini dapat dibuat dengan membentangkan /meratakan fase diam
(adsorbent=penjerap=sorbent) diatas plat/lempeng kaca plastik ataupun aluminium.
Digunakan untuk pemisahan zat secara cepat dengan menggunakan zat penyerap berupa
serbuk halus yang dilapiskan serba rat pada lempeng kaca. Lempeng yang dilapis dapat
dianggap sebagai kolom kromatografi terbuka dan pemisahan didasarkan pada
penyerapan pembagian atau gabungannya tergantung dari zat penyerap pembagian atau
gabungannya tergantung dari jenis zat penyerap dan cara pembuatan lapisan zat penyerap
dan jenis zat pelarut. KLT dengan penyerap penukar ion dapat digunakan untuk
pemisahan senyawa polar.

Fase diam

Sifat fase diam yang satu dengan fase diam yang lain berbeda karena strukturnya,
ukurannya, kemurniannya, zat tambahan sebagai pengikat dll. Fasa diam yang digunakan
TLC tidak sama dengan yang digunakan untuk kromatografi kolom, terutama karena
ukuran dan zat yang ditambahkan. Fase diam dijual dengan spesifikasi tertentu, iaitu
ukuran (diameter) dalam mesh atau j^m dan untuk kegunaannya (mis: untuk TLC atau
kromatografi kolom). Beberapa fase diam yang banyak dijual dipasaran.

6
Silika gel
Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam
perdagangan dijual dengan variasi ukuran (diameter) 10-40m. Makin kecil diameter
akan makin lambat kecepatan alir fase geraknya dengan demikian mempengaruhi
kualitas pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi dari 300-1000 m2/g. Bersifat
higroskopis, pada kelembaban relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%. Macam-macam
silka gel yang dijual dipasaran, Silika gel dengan pengikat. Pada umumnya digunakan
pengikat gypsum, (CaSO4 5-15%). Jenis ini diberi nama Silika gel G. Ada juga
menggunakan pengikat pati (starch) dan dikenal Silika gel S, penggunaan pati sebagai
pengikat mengganggu penggunaan asam sulfat sebagai pereaksi penentuan bercak.Silika
gel dengan pengikat dan indicator flouresensi. Jenis silica gel ini sama seperti silika gel
diatas dengan tambahan zat berfluoresensi bila diperiksa dibawah lampu UV A, panjang
atau pendek. Sebagai indicator digunakan timah kadmium sulfida atau mangan-timah
silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF atau Silika gel GF254 (berflouresensi pada 254 ,
nm). Silika gel tanpa pengikat, dikenal dengan nama Silika gel H atau Silika gel N. Silika
gel tanpa pengikat tetapi dengan indicator flouresensi. Silika gel untuk keperluan
pemisahan preparative.

Fase gerak
Yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik. Dapat digunakan
satu macam pelarut organic saja ataupun campuran. Bilamana fase gerak merupakan
campuran pelarut organik dengan air maka mekanisme pemisahan adalah partisi.
Pemilihan pelarut organic ini sangat penting karena akan menentukan keberhasilan
pemisahan. Pendekatan polaritas adalah yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut.
Senyawa polar akan lebih mudah terelusi oleh fase gerak yang bersifat polar dari pada
fase gerak yang non polar. Sebaliknya, senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh fase
gerak non polar dari pada fase gerak yang polar.

Pembuatan plat (lempeng) silica gel


30 Gram phase diam berbentuk serbuk (dengan diameter tertentu dijual dengan merk
dagang tertentu misalnya Silica gel GF 254) dibuat bubur dengan air atau pelarut lain
sejumlah tertentu (lihat tabel 2) diratakan diatas 4-5 lempeng kaca ukuran 20X20 cm,
dalam waktu tidak lebih dari 4 menit. Perataan ini dapat menggunakan alat perata Stahl-
Desaga untuk plat kaca ukuran 20X20 cm, 20X10 cm dengan ketebalan dapat diatur
0,25-2,0 mm. Bila ukuran plat lebih kecil dapat dibuat dengan mencelupkan ke dalam
bubur adsorbent. Setelah lapisan bubur ini mengering diruangan kemudian dipanaskan di
dalam oven pada 100-120C selama 60 menit, dengan tujuan semua air akan menguap.
Proses pengeringan atau penghilangan air disebut proses mengaktifkan plat kromatografi
(fase diam), selanjutnya didalam rak penyimpan plat-plat ini dimasukkan kedalam
dexicator. Sehingga pada waktu penyimpanan plat-plat tadi tidak menyerap lembab (air)
dari udara. Dengan demikian mekanisme pemisahan komponen (senyawa-senyawa) yang
ditahan fase diam adalah mekanisme absorption.

7
Penyiapan dan penotolan sampel

Sampel atau cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai (hampir pelarut organik
dapat digunakan dan biasanya dipilih yang mudah menguap), air digunakan hanya bila
tidak dapat dicari pelarut organik yang sesuai. Untuk keperluan analisis kuantitatif
sample harus ditimbang demikian juga pelarut yang digunakan. Kemudian larutan
sample disimpan dalam wadah yang tertutup rapat untuk menghindari penguapan. Pada
umumnya ditotolkan 1-20 l larutan yang mengandung 50-100 g sample tiap bercak
untuk kromatografi absorbsi dan 5-2Qg sample untuk kromatografi partisi. Penotolan
dapat dilakukan dengan gelas kapiler yang dibuat sendiri atau dengan pipet mikro. Untuk
keperluan kuantitatif digunakan quantitative microsyringe. Kepada plat TLC
konvensional (20X20 cm, 5X20 cm, tebal 0,2 mm) sample ditotolkan sebagai bercak
bulat atau garis, 1,5-2,0 cm dari tepi bawah. Untuk memudahkan penotolan dibuat garis
lemah dengan pensil, disebut garis awal. Pada garis awal ini biasanya ditotolkan bercak-
bercak dengan garis tengah 3-6 mm, bercak-bercak tadi diusahakan diameternya
seragam. Penotolan bercak pada plat TLC dapat dilakukan berulang-ulang dan haras
berhati-hati dijaga plat tidak rusak. Penotolan sample yang terlalu banyak (over loaded)
menyebabkan bercak hasil pengembanganberbentuk tidak bulat (asimetri) dan perubahan
harga Rf. Bila totolan sample telah kering maka plat siap untuk dielusi / dikembangkan.

8
III. SKEMA KERJA

a. Preparasi Sampel

Panaskan diatas
penangas air selama
2-3 menit, sambil di
aduk.

Ekstrak lada hitam Masukkan dalam beaker + etanol ad


Sebanyak 0,9 gram. larut + 5 ml HCI 2N.

Kemudian saring dan ambil


Aduk sampai rata Setelah dingin di tambah
filtratnya.
. 0,3 gram NaCl.

.
IA IB IC
Masukkan ke tabung reaksi.
Ditambah 5 ml HCI 2N, Filtrat
dibagi
b. menjadi 3 bagian.

9
b. Reaksi Pengendapan

Larutan IC Sebagai Blanko

Larutan IA Larutan IB

Ditambah
Ditambah pereaksi Wagner.
pereaksi Mayer.

Jika ada endapan atau keruh

Ada Alkaloid

10
c. Kromatografi Lapis Tipis

Ad Filtrat diuapkan ad
larutan kering dan larutkan
menjadi dengan metanol 1 ml.
basa.

Larutan IC + Ekstraksi dengan 5ml


NH4OH pekat 28 %. kloroform dalam tabung reaksi.

Masukkan plat KLT ke Totolkan pada plat


dalam chamber yang telah KLT.
jenuh. Kemudian lakukan
pemeriksaan KLT.

Jika timbul warna jingga, ada


Alkaloid dalam ekstrak.

11
IV. BAGAN ALIR
a. Preparasi sampel
Ekstrak lada hitam sebanyak 0,9 gram + etanol ad larut + 5 ml HCL 2N dalam beaker.

Panaskan diatas penangas air selama 2-3 menit, sambil di aduk.

Kemudian dinginkan, setelah dingin + 0,3 gram NaCl, diaduk


rata kemudian disaring.

Ambil filtrat + 5 ml HCL 2N. Filtrat dibagi menjadi 3 bagian


dalam 3 tabung reaksi dan disebut sebagai larutan IA, IB dan IC.

b. Reaksi pengendapan

Larutan IA + pereaksi Mayer, larutan IB + pereaksi Wagner dan larutan IC sebagai blanko.

Jika ada endapan atau keruh AdaAlkaloid

12
c. Kromatografi Lapis Tipis

Larutan IC + NH4OH pekat 28% ad larutan menjadi basa.

Ekstraksi dengan 5 ml kloroform (dalam tabung reaksi).

Filtrat (Fase CHCL3) diuapkan ad kering, kemudian larutkan dalam metanol 1 ml.
Totolkan ke plat KLT dan masukkan kedalam chamber yang telah jenuh.

Pemeriksaan KLT

Jika timbul warna Ada alkaloid dalam ekstrak


jingga

13
V. HASIL
a. Reaksi Pengendapan

Sampel sebelum ditambahkan


dengan pereaksi Mayer dan
pereaksi Wagner

Sampel telah ditambahkan


dengan pereaksi Mayer dan
pereaksi Wagner muncul
endapan

b. Metode KLT
Totolan larutan I C pada sinar
UV 254 nm

Tototan larutan IC pada sinar


UV 365 nm setelah eluasi

Tampak noda berwarna jingga


setelah disemprot pereaksi
dragendroff secara visual.

14
VI. PEMBAHASAN
Hasil identifikasi senyawa alkaloid pada ekstrak Piper nigrum L. dengan
menggunakan reaksi pengendapan dengan pereaksi Mayer dan pereaksi Wagner
didapatkan hasil yang positif ditandai dengan adanya kekeruhan pada tabung IA dan IB
sehingga disimpulkan disimpulkan ekstrak Piper nigrum L. mengandung senyawa
alkaloid. Sebelum sampel ditambahkan dengan pereaksi sampel terlebih dahulu
ditambahkan dengan HCl karena alkaloid bersifat basa sehinggan biasanya diekstrak
dengan pelarut asam (Harborne) lalu ditambahkan dengan NaCl. Hal ini bertujuan
untuk menghilangkan protein. Adanya protein yang mengendap pada penambahan
pereaksi yang mengandung logam berat (pereaksi Mayer) dapat memberikan reaksi
positif palsu pada beberapa senyawa. (Santos et al., 1998)
Hasil identifikasi senyawa alkaloid pada ekstrak Piper nigrum L. dengan metode KLT
didapatkan 1 noda berwarna kuning. Saat diamati pada sinar UV 254 nm noda berwarna
kuning dan pada sinar UV 365 nm noda berwarna ungu. Setelah itu plat disemprot
dengan penampak noda yaitu pereaksi dragendroff nampak noda menjadi berwarna
jingga. Kedua metode identifikasi diatas menunjukkan bahwa sampel berupa ekstrak
Piper nigrum L. positif mengandung senyawa alkaloid.

15
BAB 2. IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN GLIKOSIDA
SAPONIN, TRITERPENOID, DAN STEROID

I. TUJUAN
Mahasiswa mampu melakukan identifikasi senyawa golongan glikosida saponin, triterpenoid
dan steroid dalam tanaman.

II. TINJAUAN PUSTAKA


a. Klasifikasi Klerak :
Kingdom : Plantae
Divisio : Spermatophyta
Sub Divisio : Angiospermae
Kelas : Eudikotiledon
Sub Kelas : Rosidae
Ordo : Sapindales
Famili : Sapindaceae
Sub Famili : Sapindoideae
Genus : Sapindus
Spesies : Sapindus rarak DC
Sinonim : Sapindus delavayi (China, India)
Sapindus detergens (syn. var. Soapnut, Ritha)
Sapindus emarginatus Vahl (Southern Asia)
Sapindus laurifolius Vahl Ritha (India)
Sapindustomentosus (China)
Sapindusvitiensis A.Gray (American Samoa, Samoa, Fiji)
b. Ciri-ciri Tanaman Klerak
Tumbuhan klerak berbentuk pohon dan rata-rata memiliki tinggi 10 m
walaupun bisa mencapai 42 meter dengan diameter 1 meter, Karenanya pohon klerak
besar dengan kualitas kayu yang setara kayu jati banyak ditebang karena memiliki
nilai ekonomis. Bentuk daunnya bulat telur berujung runcing, bertepi rata, bertangkai
pendek dan berwarna hijau. Biji terbungkus kulit cukup keras bulat seperti kelereng,
kalau sudah masak warnanya coklat kehitaman. Permukaan buah licin dan mengkilat.

16
Gambar 2. Buah klerak kering
c. Kandungan Buah Klerak
Biji klerak mengandung bahan aktif alkaloid, triterpen, steroid dan saponin.
Saponin pada klerak suatu alkaloid beracun dan bermanfaat, saponin inilah yang
menghasilkan busa dan berfungsi sebagai bahan pencuci dan dapat pula dimanfaatkan
sebagai pembersih berbagai peralatan dapur, lantai, bahkan memandikan dan
membersihkan binatang peliharaan. Kandungan racun biji klerak juga berpotensi
sebagai insektisida. Kulit buah klerak dapat digunakan untuk wajah untuk mengurangi
jerawat dan kudis. Buah klerak relatif mudah didapatkan biasanya dijual di pasar-
pasar tradisional.

Tabel 1. Persentase senyawa aktif pada klerak

No. Senyawa Aktif Persentase Senyawa


Aktif
1 Saponin 12 %
2 Alkaloid 1%
3 Ateroid 0,036 %
4 Triterpen 0,029 %
Sumber : Nevi Yanti, 2009
d. Senyawa Glikosida

Glikosida merupakan senyawa yang mengandung komponen gula dan bukan


gula. Komponen gula dikenal dengan nama glikon dan komponen bukan gula dikenal
sebagai aglikon. Dari segi biologi, glikosida memiliki peranan penting di dalam
kehidupan tumbuhan dan terlibat di dalam pertumbuhan dan perlindungan tumbuhan
tersebut. Beberapa glikosida mengandung lebih dari satu jenis gula dalam bentuk
disakarida atau trisakarida. Semua glikosida alam dapat terhidrolisis menjadi gula dan
bukan gula dengan cara mendidihkannya bersama asam mineral. Biasanya, glikosida

17
juga dapat terhidrolisis dengan mudah oleh enzim yang terdapat dalam jaringan
tumbuhan yang sama.

Dan segi pandang biologi, glikosida berperan dalam tumbuhan terlibat dalam
fungsi pengaturan-penga-turan, perlindungan, dan kesehatan, sedangkan untuk
manusia ada yang digunakan datam pengobatan. Dalam segi pengobatan, glikosida
menyumbang hampir setiap kelas pengobatan, misalnya sebagai obat jantung
(kardiotonika) contohmya: glikosida digitalis, strophantus, squill, corivallaria,
apocynum, dll. ; sebagai obat pencahar (laxantia), misalnya antrakinon dalam sena,
aloe, kelembak, kaskara sagrada, frangula, dll.; sebagai penyedap atau lokal iritan,
misalnya alilisotiosianat; seba-gai analgesika, misalnya gaulterin dan gondopuro
meng-hasilkan metilsalisilat.

Klasifikasi (penggolongan) glikosida sanat sukar. Bila ditinjau dan gulanya


akan dijumpai gula yang strukturnya belum jelas; sedangkan bila ditinjau dan
aglikonnya akan dijumpai hampir semua olonqan konstituen tumbuhan, misalnya
tanin, stenol, terpenoid, antosian, flavonoid dsb. Bila ditinjau dan segi pengobatan
akan tenjadi beberapa glikosida yang diabaikan, padahal penting dalam farmakognosi.
Dalam tumbuhan sering dijumpai gula Iebih dari satu, misalnya di- dan trisakarida.
Gula yang umum adalah D-glukosa, sering dijumpai pula ramnosa. Gula yang tidak
umum misalnya digitoksosa, digitalosa, simarosa dsb.

Pengelompokan glikosida berdasarkan struktur bukan gula terbagi atas :


glikosida jantung, glikosida antrakinon, glikosida saponin, glikosida sianogenik,
glikosida isotiosianat, glikosida flavonol, glikosida alkohol, glikosida alkohol,
glikosida aldehida, glikosida lakton, glikosida fenol dan tanin (Tyler et al, 1988).

Pengelompokan glikosida berdasarkan ikatan antara glikon dan aglikon dapat dibagi
menjadi empat, yaitu:

1. O-glikosida, jika glikon dan aglikonnya dihubungkan oleh atom O, contohnya :


salisin.
2. S-glikosida, jika glikon dan aglikonnya dihubungkan oleh atom S,contohnya :
sinigrin.
3. N-glikosida, jika glikon dan aglikonnya dihubungkan oleh atom N, contohnya
kronotosida.
4. C-glikosida, jika glikon dan aglikonnya dihubungkan oleh atom C, contohnya :
barbaloin (Farnsworth, 1966).

e. Senyawa Saponin

Saponin merupakan senyawa dalam bentuk glikosida yang tersebar luas pada
tumbuhan tingkat tinggi. Saponin membentuk larutan koloidal dalam air dan
membentuk busa yang mantap jika dikocok dan tidak hilang dengan penambahan
asam. Saponin merupakan senyawa glikosida triterpenoida ataupun glikosida steroida
yang merupakan senyawa aktif permukaan dan bersifat seperti sabun serta dapat

18
dideteksi berdasarkan kemampuannya membentuk busa dan menghemolisa sel darah
merah. Pola glikosida saponin kadang-kadang rumit, banyak saponin yang
mempunyai satuan gula sampai lima dan komponen yang umum ialah asam
glukuronat (Harborne, 1996).

Glikosida saponin adalah glikosida yang aglikonnya berupa sapogenin.


Saponin tersebar luas di antara tanaman tinggi, keberadan saponin sangat mudah
ditandai dengan pembentukan larutan koloidal dengan air yang apabila dikocok
menimbulkan buih yang stabil. Saponin merupakan senyawa berasa pahit menusuk
dan dapat menyebabkan bersin dan bersifat racun bagi hewan berdarah dingin, banyak
di antaranya digunakan sebagai racun ikan (Gunawan dan Mulyani, 2004).

Senyawa saponin dapat pula diidentifikasi dari warna yang dihasilkannya


dengan pereaksi Liebermann-Burchard. Warna biru-hijau menunjukkan saponin
steroida, dan warna merah, merah muda, atau ungu menunjukkan saponin
triterpenoida (Farnsworth, 1966)

Saponin memiliki berat molekul tinggi, dan berdasarkan struktur aglikonnya,


saponin dapat dibedakan menjadi dua macam, yaitu tipe steroida dan tipe
triterpenoida. Kedua senyawa ini memiliki hubungan glikosidik pada atom C-3 dan
memiliki asal usul biogenetika yang sama lewat asam mevalonat dan satuan-satuan
isoprenoid (Gunawan dan Mulyani, 2004).

Tipe aglikon senyawa saponin dapat dilihat pada gambar dibawah ini
(Farnsworth,1966):

a. Saponin steroida terdapat pada tumbuhan monokotil maupun dikotil,


contohnya diosgenin yang terdapat pada Dioscorea hispida, dan hecogenin yang
terdapat pada Agave americana (Gunawan dan Mulyani, 2004).
b. Saponin Triterpenoida
Saponin triterpenoida banyak terdapat pada tumbuhan dikotil seperti: gipsogenin
terdapat pada Gypsophylla sp., dan asam glisiretat terdapat pada Glycyrrhiza glabra
(Gunawan dan Mulyani, 2004).

Banyak penelitian yang dilakukan oleh lembaga pemerintah, industri, dan


perguruan tinggi untuk mencari sumber saponin steroid guna prazat (precursor)
pembu-atan p11 KB, untuk prazat kortison dipilih yang memiliki gugus hidroksil pada
posisi 3- dan 11- karena akan Iebih mudah diubah menjadi kortison. Nampaknya yang
digunakan sebagai sumber prazat kortison dan turunannya adalah (1) diosgenin dan
botogenin dan marga Dioscorea , (2) hekogenin, manogenin, dan gitogenin dan marga
Agave, (3) sitosterol dan minyak nabati, dan (4) sarsapogenin dan smilagenin dan
jenis SmiIax. Anggota-anggota familia Liliaceae, Amaryllidaceae, dan Dioscoreaceae
yang semua kelas merupakan Monocotyledonae, sedangkan pada kelas Dicotyledonae
nampaknya hanya suku Apocynaceae yang manjanjikan, utamanya jenis
Strophanthus. Akhir-akhir ditemukan sumber lain untuk steroid, yaitu pada rimpang

19
dan biji Costus speciosus (pacing) suku Zingiberaceae mengan-dung diosqenin dan
buah beberapa jenis Solanum (suku Solanaceae), misalnya Solanum khasianum
mengandung solasodina. Biosintesis glikosida saponin.
Glikosida saponin dibagi dua golongan tergantung pada aglikonnya
(sapogeninnya), yaitu saponin netral atau saponin steroid dan saponin asam yang
berupa triterpenoid. Untuk steroid dan triterpenoid biosintesis lewat jalur asetat dan
mevalonat, sebelum terjadi siklisasi terbentuk skualena. Untuk steroid, misalnya hasil
akhir berupa kolesterol atau inti steroid spiroketal (mis. diosgenin) atau triterpenoid
pentasiklik (mis. 1-amyrin).

f. Identifikasi Senyawa
Uji Buih
1. Ekstrak sebanyak 0,2 gram dimasukkan tabung reaksi, kemudian ditambah air
suling 10 ml, dikocok kuat-kuat selama kira-kira 30 detik.
2. Tes buih positif mengandung saponin bila terjadi buih yang stabil selama lebih
dari 30 menit dengan tinggi 3 cm di atas permukaan cairan.
Reaksi Warna
1. Preparasi sampel :
0,5 gram ekstrak dilarutkan dalam 15 ml etanol, lalu dibagi menjadi tiga
bagian masing-masing 5 ml, disebut larutan IIA, IIB, dan IIC.
Uji Liebermann-Burchard
1. Larutan IIA digunakan sebagai blanko, larutan IIB sebanyak 5 ml ditambah 3
tetes asam asetat anhidrat dan 5 tetes H2SO4 pekat, amati perubahan warna
yang terjadi. Kemudian kocok perlahan dan amati terjadinya perubahan warna.
2. Terjadinya warna hijau biru menunjukkan adanya saponin steroid, warna
merah ungu menunjukkan adanya saponin triterpeniod/ steroid jenuh.
Uji Salkowski
1. Larutan IIA digunakan sebagai blanko, larutan IIC sebanyak 5ml ditambah 1-2
ml H2SO4 pekat melalui dinding tabung reaksi.
2. Adanya steroid tak jenuh ditandai dengan timbulnya cincin warna merah.
Kromatografi Lapis Tipis
1. Identifikasi sapogenin steroid/ triterpenoid
- Ekstrak sebanyak 0,5 gram ditambah 5 ml HCl 2N, didihkan dan tutup dengan
corong berisi kapas basah selama 50 menit untuk menghidrolisis saponin.
- Setelah dingin, tambahkan ammonia sampai basa, kemudian ekstraksi dengan 4-
5ml n-heksana sebanyak 2x, lalu uapkan sampai tinggal 0,5ml, totolkan pada
plat KLT.
Fase diam : Kiesel Gel 254
Fase gerak : n-heksana-etil asetat (4:1)
Penampak noda : Anisaldehida asam sulfat (dengan pemanasan)
- Adanya sapogenin ditunjukkan dengan terjadinya warna merah ungu (ungu)
untuk anesaldehida asam sulfat

20
2. Identifikasi terpenoid/ steroid bebas secara KLT
- Sedikit ekstrak ditambah beberapa tetes n-heksana, diaduk sampai larut,
totolkan pada fase diam.
- Uji kromatografi lapis tipis ini menggunakan:
Fase diam : Kiesel Gel 254
Fase gerak : n-heksana-etil asetat (4:1)
Penampak noda : Amisaldehida asam sulfat (dengan pemanasan)
- Adanya terpenoid/ steroid ditunjukkan dengan terjadinya warna merah
ungu atau ungu.

g. Pemisahan KLT
Thin Layer Chromatography (TLC)
Kromatografi lapis tipis adalah salah satu contoh kromatografi planar. Fase diamnya
(Stationary Phase) berbentuk lapisan tipis yang melekat pada gelas/kaca, plastik,
aluminium. Sedangkan fase geraknya (Mobile Phase) berupa cairan atau campuran
cairan, biasanya pelarut organi dan kadangkadang juga air. Fase diam yang berupa
lapisan tipis ini dapat dibuat dengan membentangkan /meratakan fase diam
(adsorbent=penjerap=sorbent) diatas plat/lempeng kaca plastik ataupun
aluminium.Digunakan untuk pemisahan zat secara cepat dengan menggunakan zat
penyerap berupa serbuk halus yang dilapiskan serba rat pada lempeng kaca. Lempeng
yang dilapis dapat dianggap sebagai kolom kromatografi terbuka dan pemisahan
didasarkan pada penyerapan pembagian atau gabungannya tergantung dari zat penyerap
pembagian atau gabungannya tergantung dari jenis zat penyerap dan cara pembuatan
lapisan zat penyerap dan jenis zat pelarut. KLT dengan penyerap penukar ion dapat
digunakan untuk pemisahan senyawa polar.

Fase diam

Sifat fase diam yang satu dengan fase diam yang lain berbeda karena strukturnya,
ukurannya, kemurniannya, zat tambahan sebagai pengikat dll. Fasa diam yang digunakan
TLC tidak sama dengan yang digunakan untuk kromatografi kolom, terutama karena
ukuran dan zat yang ditambahkan. Fase diam dijual dengan spesifikasi tertentu, iaitu
ukuran (diameter) dalam mesh atau j^m dan untuk kegunaannya (mis: untuk TLC atau
kromatografi kolom). Beberapa fase diam yang banyak dijual dipasaran.

Silika gel
Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam
perdagangan dijual dengan variasi ukuran (diameter) 10-40m. Makin kecil diameter
akan makin lambat kecepatan alir fase geraknya dengan demikian mempengaruhi
kualitas pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi dari 300-1000 m2/g. Bersifat
higroskopis, pada kelembaban relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%. Macam-macam
silka gel yang dijual dipasaran, Silika gel dengan pengikat. Pada umumnya digunakan
pengikat gypsum, (CaSO4 5-15%). Jenis ini diberi nama Silika gel G. Ada juga
menggunakan pengikat pati (starch) dan dikenal Silika gel S, penggunaan pati sebagai

21
pengikat mengganggu penggunaan asam sulfat sebagai pereaksi penentuan bercak.Silika
gel dengan pengikat dan indicator flouresensi. Jenis silica gel ini sama seperti silika gel
diatas dengan tambahan zat berfluoresensi bila diperiksa dibawah lampu UV A, panjang
atau pendek. Sebagai indicator digunakan timah kadmium sulfida atau mangan-timah
silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF atau Silika gel GF254 (berflouresensi pada 254 ,
nm). Silika gel tanpa pengikat, dikenal dengan nama Silika gel H atau Silika gel N. Silika
gel tanpa pengikat tetapi dengan indicator flouresensi. Silika gel untuk keperluan
pemisahan preparatif.

Fase gerak
Merupakan gas pembawa yang ditempatkan dalam tabung bertekanan tinggi (rata-rata
40 psi) untuk menghasilkan kecepatan aliran gas 10-100cm3/menit. Gas pembawa harus
murni (tidak mengandung uap air, hidrokarbon, atau gas- gas lain). Yang populer adalah
nitrogen, gas argon, gas helium, dan gas hidrogen. Penggunaanya tergantung pada jenis
detektor yang digunakan, ketersediaan gas, dan biaya/harga. Yang digunakan sebagai
fase gerak biasanya adalah pelarut organik. Dapat digunakan satu macam pelarut organic
saja ataupun campuran. Bilamana fase gerak merupakan campuran pelarut organik
dengan air maka mekanisme pemisahan adalah partisi. Pemilihan pelarut organic ini
sangat penting karena akan menentukan keberhasilan pemisahan. Pendekatanpolaritas
adalah yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut. Senyawa polar akan lebih mudah
terelusi oleh fase gerak yang bersifat polar dari pada fase gerak yang non polar.
Sebaliknya, senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh fase gerak non polar dari pada
fase gerak yang polar. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang
dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam,
dan sifat komponen-komponen sampel (Rohman, 2007).

Teknik Elusi (Pengembangan)


Ada tiga macam teknik elusi, yaitu pengembangan secara ascending, descending, dan
radial atau horizontal. Teknik ascending merupakan cara yang paling sederhana. Kertas
atau lapis tipis sesudah diberi sampel, tepinya setinggi kurang lebih 2,5cm dicelupkan
pada eluen yang ditempatkan di dalam bejana. Eluen akan meresap pada kertas atau
bahan penyangga dan bergerak naik secara kapileri sampai pada ketinggian yang
dikehendaki. Teknik descending merupakan kebalikan dari teknik ascending. Eluen
dialirkan dari tepi kertas bagian atas dimana sampel diaplikasikan. Eluen akan bergerak
mengalir (meresap) ke bawah melalui kertas atau bahan penyangga secara perlahan-lahan
sampai batas yang dikehendaki. Jika dibanding dengan teknik ascending, maka teknik
descending lebih cepat elusinya oleh karena faktor gravitasi berpengaruh pada kecepatan
aliran eluen dan gerakan komponen yang memisah.
Ada pun metoda pengembangannya ada dua cara, yaitu metode satu arah (one way
direction) dan metoda dua arah (two ways direction). Pada metoda satu arah, kertas atau
lapis tipis dikembangkan melalui satu sisinya di mana sampel dimuatkan. Sedangkan
pada metoda dua arah, kertas atau lapis tipis yang telah dikembangkan, dilakukan
pengembangan sekali lagi melalui tepi siku-siku kertas atau lapis tipisAda satu hal yang

22
perlu mendapat perhatian pada teknik descending, yaitu cara mengalirkan eluen dan atas
ke bawah. ini dapat ditempuh dengan menghubungkan kertas atau lapis tipis dengan
kertas saring yang dicelupkan pada tangki atau bejana penyedia eluen. Pada teknik radial
atau horizontal, sampel diteteskan di sekitar pusat kertas atau lapis tipis. Eluen dialirkan
tepat melalui tengah-tengah kertas sehingga peresapan atau gerakan eluen akan
menyebar ke arah radial. Ada pun metoda pengembangannya ada dua cara, yaitu metode
satu arah (one way direction) dan metoda dua arah (two ways direction). Pada metoda
satu arah, kertas atau lapis tipis dikembangkan melalui satu sisinya di mana sampel
dimuatkan. Sedangkan pada metoda dua arah, kertas atau lapis tipis yang telah
dikembangkan, dilakukan pengembangan sekali lagi melalui tepi siku-siku kertas atau
lapis tipis.

Pelarut
Pelarut adalah bahan yang ditambahkan untuk membentuk suatu fase yang berbeda
dari bahan yang dipisahkan.Pelarut menyebabkan pori-pori bahan mengembang sehingga
zat yang berada di dalam bahan berdifusi keluar permukaan partikel bahan.Pemisahan
tercapai jika komponen yang dipisahkan larut dalam pelarut sedangkan komponen yang
lainnya masih tetap berada dalam bahan asalnya.Kelarutan zat dalam pelarut dipengaruhi
oleh tingkat kepolaran pelarutnya. Zat yang polar hanya larut dalam pelarut polar,
sedangkan zat nonpolar hanya larut dalampelarut non polar (Dwiariet. al.,2008).
Terdapat kecenderungan kuat bagi senyawa polar larut dalam pelarut polar atau non-
polar.Berdasarkan sifat kepolarannya, suatu bahan digolongkan menjadi bahan polar dan
non polar. Suatu bahan bersifat polar bercirikan molekulnya mengandung ikatan ganda,
gugus karbonil dan atom elektronegatif sedangkan bahan non polar molekulnya biasanya
mengandung cincin aromatik, gugus lipofilik atau molekulnya tidak mengandung ikatan
ganda, gugus karbonil dan atom elektronegatif (Houghton dan Raman, 1989). Tingkat
polaritas pelarut yaitu seperti tabel dibawah ini :

Tabel 1.Indeks Polaritas Pelarut


Pelarut Indeks Polaritas
Pentana 0
1,1,2triklorotrifluoroetana 0
Siklopentana 0,1
Heptana 0,1
Heksana 0,1
Iso oktana 0,1
Petroleum eter 0,1
Sikloheksana 0,2
N-butilklorida 1,0
Toluena 2,4
Metal t-butil eter 2,5
O-xylena 2,5
Klorobenzena 2,7
O-diklorobenzena 2,7
Etil eter 2,8
Diklorometana 3,1
Etilen diklorida 3,5

23
N butil alkohol 3,9
Isopropil alkohol 3,9
N-butil asetat 4,0
Isobutil alkohol 4,0
Metal isoamil keton 4,0
N-propil alkohol 4,0
Tetrahidrofuran 4,0
Kloroform 4,1
Metal isobutyl keton 4,2
Etil asetat 4,4
Metal n-propil keton 4,5
Metal etil keton 4,7
1,4-dioxina 4,8
Aseton 5,1
Methanol 5,1
Piridin 5,3
2-metoksietanol 5,5
Asetonitrit 5,8
Propilen karbonat 6,1
N-n dimetilformamida 6,4
Dimeil asetamida 6,5
N-metilpirolidon 6,7
Dimetilsulfoksida 7,2

Pembuatan plat (lempeng) silica gel


30 Gram fase diam berbentuk serbuk (dengan diameter tertentu dijual dengan merk
dagang tertentu misalnya Silica gel GF 254) dibuat bubur dengan air atau pelarut lain
sejumlah tertentu (lihat tabel 2) diratakan diatas 4-5 lempeng kaca ukuran 20X20 cm,
dalam waktu tidak lebih dari 4 menit. Perataan ini dapat menggunakan alat perata Stahl-
Desaga untuk plat kaca ukuran 20X20 cm, 20X10 cm dengan ketebalan dapat diatur
0,25-2,0 mm. Bila ukuran plat lebih kecil dapat dibuat dengan mencelupkan ke dalam
bubur adsorbent. Setelah lapisan bubur ini mengering diruangan kemudian dipanaskan di
dalam oven pada 100-120C selama 60 menit, dengan tujuan semua air akan menguap.
Proses pengeringan atau penghilangan air disebut proses mengaktifkan plat kromatografi
(fase diam), selanjutnya didalam rak penyimpan plat-plat ini dimasukkan kedalam
dexicator. Sehingga pada waktu penyimpanan plat-plat tadi tidak menyerap lembab (air)
dari udara. Dengan demikian mekanisme pemisahan komponen (senyawa-senyawa) yang
ditahan fase diam adalah mekanisme absorption.

Penyiapan dan penotolan sampel


Sampel atau cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai (hampir pelarut organik
dapat digunakan dan biasanya dipilih yang mudah menguap), air digunakan hanya bila
tidak dapat dicari pelarut organik yang sesuai. Untuk keperluan analisis kuantitatif
sample harus ditimbang demikian juga pelarut yang digunakan. Kemudian larutan
sample disimpan dalam wadah yang tertutup rapat untuk menghindari penguapan. Pada

24
umumnya ditotolkan 1-20 l larutan yang mengandung 50-100 g sample tiap bercak
untuk kromatografi absorbsi dan 5-2Qg sample untuk kromatografi partisi. Penotolan
dapat dilakukan dengan gelas kapiler yang dibuat sendiri atau dengan pipet mikro. Untuk
keperluan kuantitatif digunakan quantitative microsyringe. Kepada plat TLC
konvensional (20X20 cm, 5X20 cm, tebal 0,2 mm) sample ditotolkan sebagai bercak
bulat atau garis, 1,5-2,0 cm dari tepi bawah. Untuk memudahkan penotolan dibuat garis
lemah dengan pensil, disebut garis awal. Pada garis awal ini biasanya ditotolkan bercak-
bercak dengan garis tengah 3-6 mm, bercak-bercak tadi diusahakan diameternya
seragam. Penotolan bercak pada plat TLC dapat dilakukan berulang-ulang dan haras
berhati-hati dijaga plat tidak rusak. Penotolan sample yang terlalu banyak (over loaded)
menyebabkan bercak hasil pengembanganberbentuk tidak bulat (asimetri) dan perubahan
harga Rf. Bila totolan sample telah kering maka plat siap untuk dielusi / dikembangkan.

25
III. BAGAN ALIR
A. Uji Buih

Ekstrak sebanyak 0,2 gram


masukkandalamtabungreaksi

Ditambah air suling 10 ml, dikocok kuat-kuat selama kira-kira 30 detik

Tes buih mengandung saponin bila terjadi buih yang stabil selama lebih dari 30 menit
dengan tinggi 3 cm di atas permukaan cairan

B. ReaksiWarna

1. Preparasi sampel
0,5 gram ekstrakdilarutkandalam 15 ml etanol

Lalu dibagi menjadi tiga bagian masing-masing 5 ml, disebut sebagai


larutan II A, II B dan II C

2. Uji Liebermann-Burchard
a.
Larutan IIA digunakan sebagai blanko, larutan IIB sebanyak 5 ml ditambah
3 tetes asam asetat anhidrat dan 5 tetes H2SO4 pekat

Amati perubahan warna yang terjadi. Kemudian kocok perlahan dan


amati terjadinya perubahan warna.

b.
Terjadinya warna hijau biru menunjukkan adanya saponin steroid, warna
merah ungu menunjukkan adanya saponin triterpeniod/ steroid jenuh.

3. Uji Salkowski

Larutan IIA digunakan sebagai blanko, larutan IIC sebanyak 5ml ditambah
1-2 ml H2SO4 pekat melalui dinding tabung reaksi.

Adanya steroid tak jenuh ditandai dengan timbulnya cincin warna merah.

26
C. Kromatografi Lapis Tipis

1. Identifikasi sapogenin steroid/triterpenoid

Ekstrak sebanyak 0,5 gram ditambah 5 ml HCl 2N, didihkan dan tutup dengan corong berisi
kapas basah selama 50 menit untuk menghidrolis saponin

Setelah dingin, tambahkan ammonia sampai basa, kemudian ekstraksi dengan 4-5 ml n-heksana
sebanyak 2x, lalu uapkan sampai tinggal 0,5 ml dan totolkan pada plat KLT

Adanya sapogenin ditunjukkan dengan terjadinya warna merah ungu (ungu) untuk
anesaldehida asam sulfat

2. Identifikasi terpenoid/steroid bebas secara KLT


Sedikit ekstrak ditambah beberapa tetes etanol, diaduk sampai larut, totolkan pada fase diam

Uji kromatografi lapis tipis

Adanya terpenoid/steroid ditunjukkan dengan terjadinyawarna merah ungu atau ungu

27
IV. SKEMA KERJA

a. Uji Buih
0,2 gram ekstrak Tes Buih positif mengandung
saponin bila terjadi buih yang
+ air suling 10 ml stabil Selama lebih dari 30
+ dikocok kuat-kuat
menit dengan tinggi 3 cm
selama kira-kira 30 diatas permukaan cairan
detik.

b. Reaksi Warna

0,5 gram ekstrak

di larutkan dalam 15 ml etanol

Filtrat dibagi 3 bagian


Masing-masing 5 ml

IIA IIB IIC

1. Uji Liberman-Burchard
+ 3 tetes asam asetat anhidrat
+ 5 tetes H2SO4 pekat
Amati perubahan warna yang terjadi (Kocok Perlahan) :
Hijau Biru Saponin Steroid
Merah Ungu Saponin Triterpenoid
Kuning muda Triterpenoid / Steroid Jenuh
IIA(Blanko) IIB (5 ml)

2. Uji Salkowski

+ 1-2 ml H2SO4 pekat melalui tabung reaksi.


Jika terdapat cincin berwarna merah menunjukkan
adanya Steroid tak jenuh

IIA(Blanko) IIC (5 ml)

28
c. Kromatografi Lapis Tipis
1. Identifikasi Sapogenin Steroid/Triterpenoid
0,5 gram ekstrak
+ 5 ml HCl 2N
Didihkan dg Corong berisi kapas basah Adanya sapogenin
selama 50 menit untuk menghidrolis ditunjukan dengan
saponin terjadinya warna merah
Setelah dingin + Amnonia basa ungu (ungu) untuk
anesaldehida asam sulfat
Ekstraksi dg 4-5 ml n-Heksana
sebanyak 2 kali
Uapkan sampai tinggal 0,5 ml
Totolkan pada Plat KLT

2. Identifikasi Terpenoid/Steroid bebas secara KLT


Sedikit ekstrak Adanya terpenoid/steroid
+ Beberapa tetes n-heksan ditunjukan dengan
Diaduk sampai larut. terjadinya warna merah
Totolkan pada fase diam ungu atau ungu

29
V. HASIL
1. Tes Buih
Hasilnya positif karena tinggi buih 6 cm selama lebih dari 30 menit.

2. Reaksi Warna
a. Uji Liebermann-Burchard
Larutan IIB yang berisi ekstrak Sapindus rarak DC positif mengandung saponin
triterpenoid karena menghasilkan warna merah ungu.

Larutan IIB
b. Uji Salkowski
Larutan IIC berisi ekstrak Sapindus rarak DC positif mengandung steroid tak jenuh
karena menghasilkan cincin warna merah dibawah dasar tabung.

30
3. Tes Kromatografi Lapis Tipis
a. Identifikasi sapogenin steroid/triterpenoid
Diamati pada sinar UV 365 menghasilkan warna merah ungu (ungu) yang berarti
menunjukkan adanya sapogenin steroid sehingga ekstrak Sapindus rarak DC positif
mengandung sapogenin steroid dan menghasilkan 2 spot noda dengan Rf yaitu 2/8 =
0,25 cm dan 4,8/8 = 0,6 cm serta menggunakan penampak noda Anisaldehida asam
sulfat.

Sinar UV 365

b. Identifikasi terpenoid/steroid bebas secara KLT


Diamati pada sinar UV 365 menghasilkan warna ungu pada plat KLT yang berarti
menunjukkan adanya terpenoid atau steroid sehingga ekstrak Sapindus rarak DC
positif mengandung terpenoid dan menghasilkan 2 spot noda dengan Rf yaitu 1,5/8 =
0,1875cm dan 8/8 = 1cm serta menggunakan penampak noda Anisaldehida asam
sulfat.

31
VI. PEMBAHASAN
Pada praktikum ini yaitu mengidentifikasi senyawa golongan glikosida saponon,
triterpenoid dan steroid pada Ekstrak Sapindus rarak DC atau klerak. Tahap pertama yaitu
Uji buih yang mana diambil ekstrak sebanyak 0,2 gram ditambah air suling 10 ml, dikocok
kuat-kuat selama kira-kira 30 detik dalam tabung reaksi. Tes buih dikatakan positif apabila
buih stabil selama lebih dari 30 menit dengan tinggi 3 cm di atas permukaan cairan, pada tes
ini hasilnya positif karena buih sebelum menit ke-30 tingginya 7 cm dan setelah 30 menit
tingginya 6 cm, ini berarti buih stabil selama lebih dari 30 menit karena tinggi buih lebih dari
3 cm. Tahap kedua yaitu reaksi warna, yang mana kita harus melakukan preparasi
sampel,dengan mereaksikan 0,5 gram ekstrak yang dilarutkan dalam 15 ml etanol, kemudian
dibagi menjadi 3 bagian dengan masing-masing 5 ml yaitu sebagai larutan IIA, IIB, dan IIC.
Selanjutnya dilakukan uji Liebermann-Burchard yaitu larutan IIA sebagai blanko, larutan IIB
ditambah 3 tetes asam asetat anhidrat dan 5 tetes H2SO4 pekat, amati perubahan warna dan
kocok perlahan. Pada tes ini menghasilkan warna merah ungu yang berarti bahwa larutan IIB
menunjukkan adanya saponin triterpenoid. Kemudian dilakukan uji Salkowski yaitu larutan
IIA tetap sebagai blanko dan larutan IIC ditambah 1 ml H2SO4 pekat atau H2SO4 pekat 1
pipet pada dinding tabung, amati perubahan warna yang terjadi dan pada tahap ini
menghasilkan cincin warna merah yang berarti bahwa larutan IIC menunjukkan adanya
steroid tak jenuh.

Tahap ketiga yaitu Kromatografi lapis Tipis, pada tahap ini dilakukan dua identifikasi
yaitu yang pertama identifikasi sapogenin steroid/triterpenoid. Pada identifikasi ini, ekstrak
sebanyak 0,5 gram ditambah 5 ml HCI 2N , didihkan dan tutup dengan corong kapas nasah
selama 50 menit untuk menghidrolisis saponin. Setelah dingin ditambah ammonia sampai
basa, untuk mengetahui larutan tersebut basa yaitu dengan meneteskan larutan tersebut ke
kertas lakmus merah, apabila kertas lakmus merah berubah menjadi biru maka larutan
tersebut sudah basa. Kemudian setelah larutan tersebut basa ekstraksi dengan 5 ml n-heksana
sebanyak 2 kali, lalu diuapkan sampai tinggal 0,5 ml dan totolkan pada plat KLT.Setelah itu
masukkan plat KLT kedalam chamber untuk dijenuhkan, lalu setelah di eluasi keringkan
dilemari asam kemudian lihat pada sinar UV 254 dan UV 365. Selanjutnya plat KLT tersebut
diberi penampak noda (Anisaldehida asam sulfat) kemudian dipanaskan diatas hotplate dan
amati pada sinar UV 365, pada saat diamati pada sinar UV 365 menghasilkan warna merah
ungu (ungu) yang berarti menunjukkan adanya sapogenin steroid dan menghasilkan 2 spot
noda dengan Rf yaitu 2/8 = 0,25 cm dan 4,8/8 = 0,6 cm.

32
Identifikasi yang kedua yaitu identifikasi terpenoid/steroid bebas secara KLT. Pada
identifikasi ini sedikit ekstrak ditambah 1 ml n-heksan, diaduk sampai larut kemudian
masukkan dalam vial dan uapkan. Selanjutnya ditotolkan pada plat KLT sebanyak 9 totolan
dalam 3 pipa kapiler, amati pada sinar UV 254 sampai totolan terlihat gelap, apabila belum
gelap pada saat diamati di sinar UV 254 ulangi penotolan dan kelompok kami melakukan
penotolan sebanyak 18 kali totolan, baru totolan terlihat gelap. Kemudian dimasukkan
kedalam chamber untuk dieluasi, lalu setelah dieluasi amati pada sinar UV 254 dan UV 365
dan pada saat diamati pada sinar UV 254 dan UV 365, spot noda masih kelihatan gelap dan
dihasilkan 2 spot noda. Selanjutnya dicelupkan pada penampak noda (Anisaldehida asam
sulfat) dan dipanaskan diatas hotplate, lalu diamati pada sinar UV 365 menghasilkan warna
ungu pada plat KLT yang berarti menunjukkan adanya terpenoid atau steroid dan
menghasilkan 2 spot noda dengan Rf yaitu 1,5/8 = 0,1875cm dan 8/8 = 1cm.

Sehingga dapat disimpulkan bahwa pada Uji Buih positif mengandung saponin, pada Uji
Liebermann-Burchard menunjukkan adanya saponin triterpenoid karena menghasilkan warna
merah ungu, pada Uji Salkowski positif steroid tak jenuh karena terdapat cincin warna merah,
dan pada identifikasi sapogenin steroid/triterpenoid positif ada sapogenin karena
menghasilkan warna merah ungu pada plat KLT yang diamati pada sinar UV 365 serta pada
identifikasi terpenoid/steroid bebas secara KLT positif ada terpenoid karena menghasilkan
warna ungu pada saat diamati disinar UV 365. Sehingga pada ekstrak Sapindus rarak DC
terdapat senyawa golongan glikosida saponin, triterpenoid dan steroid.

33
BAB 3. IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN FLAVONOIDA

I. TUJUAN

Mahasiswamampumelakukan identifikasi senyawa golongan flavonoid dalamtanaman..

II. TINJAUAN PUSTAKA

a. Klasifikasi Jambu Biji


Jambu biji berasal dari Amerika tropik, tumbuh pada tanah yang gembur maupun liat,
pada tempat terbuka dan mengandung air cukup banyak. Pohon ini banyak ditanam
sebagai pohon buah-buahan. Namun, sering tumbuh liar dan dapat ditemukan pada
ketinggian 1-1.200 m dpl. Jambu biji berbunga sepanjang tahun (Hapsoh, 2011).

Secara botanis tanaman jambu biji diklasifikasikan sebagai berikut :


Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Class : Dicotyledoneae
Ordo : Myrtales
Famili : Myrtaceae
Genus : Psidium
Spesies : Psidium guajava L.
Nama Lokal : Jambu Biji
b. Morfologi Tumbuhan Jambu Biji
Jambu biji perdu atau pohon kecil, tinggi 2-10 m, percabangan banyak. Batangnya
berkayu, keras, kulit batang licin, mengelupas, berwarna cokelat kehijauan. Daun
tunggal, bertangkai pendek, letak berhadapan, daun muda berambut halus, permukaan
atas daun tua licin. Helaian daun berbentuk bulat telur agak jorong,ujung tumpul,
pangkal membulat, tepi rata agak melekuk ke atas, pertulangan menyirip, panjang 6-14
cm, lebar 3-6 cm, berwarna hijau. Bunga tunggal, bertangkai, keluar dari ketiak daun,
berkumpul 1-3 bunga, berwarna putih. Buahnya buah buni, berbentuk bulat sampai
bulat telur, berwarna hijau sampai hijau kekuningan. Daging buah tebal, buah yang
masak bertekstur lunak, berwarna putih kekuningan atau merah jambu. Biji buah
banyak mengumpul di tengah, kecil-kecil. Keras, berwarna kuning kecoklatan
(Hapsoh, 2011).

34
c. Manfaat Tumbuhan Jambu Biji
Tanaman jambu biji atau Psidium guajava L. Termasuk familia Myrtaceae, banyak
tumbuh di daerah-daerah di tanah air kita. Penduduk terlalu mementingkan buahnya,
sedangkan daun-daunnya hanya sebagian kecil saja yang memperhatikannya, padahal
mempunyai nilai obat yang baik, terutama untuk menyembuhkan sakit: diare dan
astringensia (Kartasapoetra, 1992).
Jambu biji memiliki beberapa kelebihan, antara lain buahnya dapat dimakan sebagai
buah segar, dapat diolah menjadi berbagai bentuk makanan dan minuman. Selain itu,
buah jambu biji bermanfaat untuk pengobatan (terapi) bermacam-macam penyakit,
seperti memperlancar pencernaan, menurunkan kolesterol, antioksidan, menghilangkan
rasa lelah dan lesu, demam berdarah, dan sariawan. Selain buahnya, bagian tanaman
lainnya, seperti daun, kulit akar maupun akarnya, dan buahnya yang masih muda juga
berkhasiat obat untuk menyembuhkan penyakit disentri, keputihan, sariawan, kurap,
diare, pingsan, radang lambung, gusi bengkak, dan peradangan mulut, serta kulit
terbakar sinar matahari (Cahyono B, 2010).
Ekstrak etanol daun jambu biji juga telah dilakukan penelitian terhadap uji aktivitas
anti oksidannya (Soebagio,et al. 2007) dan uji aktivitasnya sebagai anti bakteri
penyebab diare (Adyana, et al. 2004).
Daun jambu biji mempunyai manfaat bagi kesehatan yaitu sebagai antiinflamasi,
antidiare, analgesik, antibakteri, antidiabetes, antihipertensi, mengurangi demam dan
penambah trombosit (Kirtikar dan Bashu., 1998). Daun jambu biji putih telah terbukti
secara klinis menghambat pertumbuhan rotavirus yang menyebabkan enteritis pada
anak-anak dan menyembuhkan kejang dan penyakit diare akut (Lozoya et al., 2002;
Wei et al., 2000).
d. Kandungan Kimia Daun Jambu Biji
Kandungan kimia pada daun jambu biji (Psidium guajava L.) menurut Taiz dan
Zeiger (2002) yaitu terpen, fenolik, dan senyawa mengandung nitrogen terutama
alkaloid. Kandungan kimia tersebut merupakan bagian dari sistem pertahanan diri yang
berperan sebagai pelindung dari serangan infeksi mikroba patogen dan mencegah
pemakanan oleh herbivora. Hasil fitokimia dalam ekstrak daun jambu biji putih adalah
senyawa flavonoid, tanin, triterpenoid, saponin, steroid, dan alkaloid (Arya, et
al.,2012).
Flavonoid adalah senyawa yang terdiri dari dari 15 atom karbon yang umumnya
tersebar di dunia tumbuhan. Quercetin adalah zat sejenis flavonoid yang ditemukan
dalam buah-buahan, sayuran, daun dan biji-bijian. Hal ini juga dapat digunakan
sebagai bahan dalam suplemen minuman atau makanan. Saponin adalah jenis glikosida
yang banyak ditemukan dalam tumbuhan. Saponin memiliki karakteristik berupa buih.
Sehingga ketika direaksikan dengan air dan dikocok maka akan terbentuk buih yang
dapat bertahan lama. Minyak atsiri adalah kelompok besar minyak nabati yang
berwujud cairan kental pada suhu ruang namun mudah menguap sehingga memberikan
aroma yang khas. Minyak atsiri merupakan bahan dasar dari wangi-wangian atau

35
minyak gosok (untuk pengobatan) alami. Tanin merupakan substansi yang tersebar
luas dalam tanaman dan digunakan sebagai energi dalam proses metabolisme dalam
bentuk oksidasi, Tanin juga sebagai sumber asam pada buah. Alkaloid adalah sebuah
golongan senyawa basa bernitrogen yang kebanyakan heterosiklik dan terdapat didunia
tumbuhan (tetapi ini tidak mengecualikan senyawa yang berasal dari hewan).
e. Golongansenyawa flavonoid

Kerangka C6-C3-C6 flavonoid


Flavonoid memiliki 15 atom padaintinya, dasarnyatersusundarikonfigurasi
C6-C3-C6 yaitu 2 cincinaromatikdandihubungkanolehtiga atom karbon yang
membentukatautidakmembentukcincinketiga. Flavonoid
adalahgolonganmetabolitsekunder yang
bnyakterdapatpadabagiantanamansepertiakar, batang, daun, bunga, buah,
danbiji.Flavoloidmerupakankelompoksenyawapolifenolterbesar di
alamsebagaipigmendaritumbuhan yang
memilikiberbagaifungsidiantaranyamenarikserangga, mengaturtumbuhan,
melawanpenyakit, melindungidariseranggabinatang.Lebihdari 2000 flavonoid
yang berasaldaritumbuhan yang telahdiidentifikasi, namunadatigakelompok yang
umumdipelajari, yaituantosianin, flavonol,danflavon. Flavonoid seringterdapat di
sel epidermis.Sebagianbesar flavonoid
terhimpundivakuolaseltumbuhanwalaupumtempatsintesisnyaada di
luarvakuola.Flavonoid merupakansenyawa polar
karenamemilikisejumlahgugushidroksil yang tidaktersubstitusi.Pelarut polar
sepertietanol, metanol, etilasetat,
ataucampurandaripelaruttersebutdapatdigunakanuntukmengekstrak flavonoid
darijaringantumbuhan( Rijke, 2005).
Flavonoid dapat berperan sebagai antioksidan. Aktivitas antioksidatif
flavonoid bersumber pada kemampuan mengkelat logam. Senyawa ini dapat
digunakan sebagai anti mikroba, obat infeksi pada luka, anti jamur, anti virus, anti
kanker, dan anti tumor. Selain itu flavonoid juga dapat digunakan sebagai anti
bakteri, anti alergi, sitotoksik, dan anti hipertensi (Sriningsih, 2008).

f. IdentifikasiSenyawa
a. Preparasi sampel
1. 0.3 gram ekstrak dikocok dengan 3 ml n-heksana berkali-kali dalam tabung
reaksi sampai ekstrak n-heksan tidak berwarna.

36
2. Residu dilarutkan dalam 20 ml etanoldan dibagi menjadi 4 bagian, masing-
masing disebut sebagai larutan IIIA, IIIB, dan IIIC.
b. Reaksi warna
1. Uji Bate-Smith dan Metcalf
Larutan IIIA sebagai blanko, larutan IIIB ditambah 0.5 ml HCl pekat dan
diamati perubahan warna yang terjadi, kemudian dipanaskan di atas
penangas air dan di amati lagi perubahan warna yang terjadi.
Bila perlahan-lahan menjadi warna merah terang atau ungu menunjukkan
adanya senyawa leukoantosianin (dibandingkan dengan blanko)
2. Uji Wilstater
Larutan IIIA sebagai blanko, larutan IIIC ditambah 0.5 ml HCl pekat dan 4
potong magnesium.
Diamati perubahan warna yang terjadi, diencerkan dengan 2 mL air suling,
kemudian ditambah 1 mL butanol.
Diamati warna yang terjadi disetiap lapisan. Perubahan warna jingga
menunjukkan adanya flavon, merah pucat menunjukkan adanya flavonol,
merah tua menunjukkan adanya flavanon.
c. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
1. Larutan IIIB ditotolkan pada fase diam.
2. Uji kromatografi lapis tipis menggunakan :
Fase diam : lapisan tipis selulosa (diganti Kiesel gel GF 254)
Fase gerak : CHCL3 : Aseton : Asam Formiat (6 :6 : 1 )
Penampak noda : pereaksi sitrat borat atau
uap ammonia atau
asam sulfat 10 %
3. Adanya flavonoid ditunjukkan dengan timbunya noda berwarna kuning
intensif.
4. Noda kuning yang ditimbulkan oleh uap ammonia akan hilang secara perlahan
ketika ammonianya menguap meninggalkan noda.
5. Sedangkan noda kuning yang ditimbukan oleh pereaksi sitrat-borat sifatnya
permanen.

g. Pemisahan KLT
Thin Layer Chromatography (TLC)
Kromatografi lapis tipis adalah salah satu contoh kromatografi planar. Fase
diamnya (Stationary Phase) berbentuk lapisan tipis yang melekat pada gelas/kaca,
plastik, aluminium. Sedangkan fase geraknya (Mobile Phase) berupa cairan atau
campuran cairan, biasanya pelarut organi dan kadangkadang juga air. Fase diam yang
berupa lapisan tipis ini dapat dibuat dengan membentangkan /meratakan fase diam
(adsorbent=penjerap=sorbent) diatas plat/lempeng kaca plastik ataupun
aluminium.Digunakan untuk pemisahan zat secara cepat dengan menggunakan zat
penyerap berupa serbuk halus yang dilapiskan serba rat pada lempeng kaca. Lempeng
yang dilapis dapat dianggap sebagai kolom kromatografi terbuka dan pemisahan

37
didasarkan pada penyerapan pembagian atau gabungannya tergantung dari zat
penyerap pembagian atau gabungannya tergantung dari jenis zat penyerap dan cara
pembuatan lapisan zat penyerap dan jenis zat pelarut. KLT dengan penyerap penukar
ion dapat digunakan untuk pemisahan senyawa polar.
Fase diam
Sifat fase diam yang satu dengan fase diam yang lain berbeda karena strukturnya,
ukurannya, kemurniannya, zat tambahan sebagai pengikat dll. Fasa diam yang digunakan
TLC tidak sama dengan yang digunakan untuk kromatografi kolom, terutama karena
ukuran dan zat yang ditambahkan. Fase diam dijual dengan spesifikasi tertentu, iaitu
ukuran (diameter) dalam mesh atau j^m dan untuk kegunaannya (mis: untuk TLC atau
kromatografi kolom). Beberapa fase diam yang banyak dijual dipasaran.
Silika gel
Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam
perdagangan dijual dengan variasi ukuran (diameter) 10-40m. Makin kecil diameter
akan makin lambat kecepatan alir fase geraknya dengan demikian mempengaruhi
kualitas pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi dari 300-1000 m2/g. Bersifat
higroskopis, pada kelembaban relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%. Macam-macam
silka gel yang dijual dipasaran, Silika gel dengan pengikat. Pada umumnya digunakan
pengikat gypsum, (CaSO4 5-15%). Jenis ini diberi nama Silika gel G. Ada juga
menggunakan pengikat pati (starch) dan dikenal Silika gel S, penggunaan pati sebagai
pengikat mengganggu penggunaan asam sulfat sebagai pereaksi penentuan bercak.Silika
gel dengan pengikat dan indicator flouresensi. Jenis silica gel ini sama seperti silika gel
diatas dengan tambahan zat berfluoresensi bila diperiksa dibawah lampu UV A, panjang
atau pendek. Sebagai indicator digunakan timah kadmium sulfida atau mangan-timah
silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF atau Silika gel GF254 (berflouresensi pada 254 ,
nm). Silika gel tanpa pengikat, dikenal dengan nama Silika gel H atau Silika gel N. Silika
gel tanpa pengikat tetapi dengan indicator flouresensi. Silika gel untuk keperluan
pemisahan preparatif.

Fase gerak
Yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik. Dapat digunakan
satu macam pelarut organic saja ataupun campuran. Bilamana fase gerak merupakan
campuran pelarut organik dengan air maka mekanisme pemisahan adalah partisi.
Pemilihan pelarut organic ini sangat penting karena akan menentukan keberhasilan
pemisahan. Pendekatanpolaritas adalah yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut.
Senyawa polar akan lebih mudah terelusi oleh fase gerak yang bersifat polar dari pada
fase gerak yang non polar. Sebaliknya, senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh fase
gerak non polar dari pada fase gerak yang polar.

Pembuatan plat (lempeng) silica gel


30 Gram fase diam berbentuk serbuk (dengan diameter tertentu dijual dengan merk
dagang tertentu misalnya Silica gel GF 254) dibuat bubur dengan air atau pelarut lain
sejumlah tertentu (lihat tabel 2) diratakan diatas 4-5 lempeng kaca ukuran 20X20 cm,
dalam waktu tidak lebih dari 4 menit. Perataan ini dapat menggunakan alat perata Stahl-

38
Desaga untuk plat kaca ukuran 20X20 cm, 20X10 cm dengan ketebalan dapat diatur
0,25-2,0 mm. Bila ukuran plat lebih kecil dapat dibuat dengan mencelupkan ke dalam
bubur adsorbent. Setelah lapisan bubur ini mengering diruangan kemudian dipanaskan di
dalam oven pada 100-120C selama 60 menit, dengan tujuan semua air akan menguap.
Proses pengeringan atau penghilangan air disebut proses mengaktifkan plat kromatografi
(fase diam), selanjutnya didalam rak penyimpan plat-plat ini dimasukkan kedalam
dexicator. Sehingga pada waktu penyimpanan plat-plat tadi tidak menyerap lembab (air)
dari udara. Dengan demikian mekanisme pemisahan komponen (senyawa-senyawa) yang
ditahan fase diam adalah mekanisme absorption.

Penyiapan dan penotolan sampel


Sampel atau cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai (hampir pelarut organik
dapat digunakan dan biasanya dipilih yang mudah menguap), air digunakan hanya bila
tidak dapat dicari pelarut organik yang sesuai. Untuk keperluan analisis kuantitatif
sample harus ditimbang demikian juga pelarut yang digunakan. Kemudian larutan
sample disimpan dalam wadah yang tertutup rapat untuk menghindari penguapan. Pada
umumnya ditotolkan 1-20 l larutan yang mengandung 50-100 g sample tiap bercak
untuk kromatografi absorbsi dan 5-2Qg sample untuk kromatografi partisi. Penotolan
dapat dilakukan dengan gelas kapiler yang dibuat sendiri atau dengan pipet mikro. Untuk
keperluan kuantitatif digunakan quantitative microsyringe. Kepada plat TLC
konvensional (20X20 cm, 5X20 cm, tebal 0,2 mm) sample ditotolkan sebagai bercak

39
III. BAGAN ALIR

b. Preparasi sampel

0,3 gram ekstrak dikocok + 3 ml n-heksana berkali-kali dalam tabung reaksi

Sampai ekstrak h-heksan tidak berwarna

Residu dilarutkan dalam 20 mL etanol. Kemudian dibagi


menjadi 4 bagian, dan disebut sebagai larutan IA, IB,
dan IC

d. Reaksi warna
1. Uji Bate-Smith dan Metcalf

Larutan IIIA sebagai blanko, larutan IIIB + 0,5 ml HCl pekat, diamati perubahan
warna

Kemudian dipanaskan di atas penangas air, diamati lagi perubahan warna

Bila perlahan-lahan menjadi warna merah terang atau ungu adanya senyawa
leukoantosianin (dibandingkan dengan blanko)

40
2. Uji Wilstater

Larutan IIIA sebagai blanko, larutan IIIC + 0,5 ml HCl pekat + 4 potong magnesium

Diamati perubahan warna, diencerkan dengan 2 mL air suling + 1 ml butanol

Diamati warna yang terjadi setiap lapisan. Perubahan warna jingga adanya
flavon, merah pucat adanya flavonol, merah tua adanya flavanon.

e. Kromatografi Lapis Tipis

Larutan IIID ditotolkan pada fase diam

Pemeriksaan KLT

Adanya Flavonoid timbul noda berwarna kuning intensif

Noda kuning ditimbulkan oleh uap ammonia, akan hilang secara


perlahan, ketika amonianya menguap meninggalkan noda

Sedangkan noda kuning, ditimbulkan oleh pereaksi sitrat-borat


sifatnya permanen.

41
IV. SKEMA KERJA

a. Preparasi sampel

+ 0,3 gram ekstrak Residu dilarutkan


dalam 20 ml
+ 3 ml n-heksana
etanol dan dibagi 4
Dikocok berkali-kali bagian. Masing-
dalam tabung utan masing
reaksi ad tidak sebagai larutan
berwarna. IIIA, IIIB, IIIC

b. Reaksi warna
1. Uji bate Smith dan Metchaf
Bila perlahan-lahan
Larutan IIIB + 0,5 ml HCL menjadi warna
Larutan merah terang atau
pekat diamati perubahan
IIIA ungu menunjukan
warna yang terjadi,
sebagai kemudian dipanaskan di adanya senyawa
blanko penangas air dan amati leukoantosianin
perubahan warna yang (bandingkan
terjadi dengan blanko

42
2. Uji Wilstater
-Larutan IIIC + 0,5 ml HCL pekat dan 4 potong
Larutan magnesiuim.
IIIA
blanko. - diamati perubahan warna yang terjaid, diencerkan
dengan 2 ml air suling. Ditambah 1 ml butanol

- diamati warna yang terjadi di setiap lapisan.


Perubahan warna jingga menunjukan adanya
flavon, merah pucat menunjukan adanya flavonol,
C kromatografi lapis tipis merah tua menunujukan adanya flavonon

Ad Filtrat di uapkan
larutan ad kering dengan
mnejadi metanol.
basa

Masukan plat
Totolkan KLT ke dalam
pada plat chamber yang
KLT telah jenuh.
Kemudian
lakukan
pemeriksaan
KLT

43
V. HASIL

a. Preparasi Sampel

0,3 gram ekstrak dikocok + 3 ml n-heksana berkali-kali dalam tabung reaksi sampai
ekstrak tidak berwarna. Kemudian residu dilarutkan dalam 20 ml etanaol dan dibagi
menjadi 4 bagian yaitu III A, III B, IIIC dan III D.

b. Reaksi Warna

1. Uji Bate Smith dan Metcalf


Larutan IIIB ditambah HCL pekat dan amati perubahan warna, kemudian dipanaskan
diatas penangas air serta amati perubahan warna yang terjadi. Pada uji ini dihasilkan
warna merah terang atau ungu yang berarti larutan IIIB yang berisi ekstrak Psidium
guajava positif mengandung senyawa leukoantosionin yang dibandingkan dengan
blanko yaitu IIIA.

44
2. Uji Wilstater
Larutan IIIC ditambah 0,5 ml HCL pekat dan ditambah Magnesium kemudian tabung
dimiringkan , diamati perubahan warna yang terjadi , jika gelembung dalam tabung
sudah hilang baru diencerkan dengan 2 ml aquades dan 1 ml butanol lewat
dindingnya.Pada uji ini hanya dihasilkan 2 lapisan saja dimana lapisan pertama
berwarna ungu yang berarti dlam larutan IIIC yang berisi ekstrak psidium guajava
positif mengandung senyawa flavon, tapi untuk lapisan kedua negatif mengandung
flavon, flavonolol dan flavanon karena warnanya coklat bening.

c. Kromatografi Lapis Tipis


Larutan IIID dan n heksan yang ada dicawan dimasukkan dilemari asam hingga 1/3
bagian. Setelah tinggal 1/3 bagian baru ditotolkan di plat KLT yang sudah diberi jarak
antar penotolan sekitar 1 cm.
1. Ditotolkan Larutan IIID dan n-heksan diplat kemudian amati pada Sinar UV 254 nm.

45
2. Dieluasi kedalam chamber sampai jenuh, kemudian dikeringkan dilemari asam dan
ditambah penampak noda (asam sulfat 10%), keringkan lagi dilemari asam dan amati di
Sinar UV 254 nm dan Sinar UV 365 nm. Pada Uji ini dihasilkan 1 noda untuk n heksana
dengan nilai Rf yaitu 7,5/8 = 0,94 cm sedangkan untuk larutan IIID noda yang dihasilkan
adalah sama yaitu 7,5/8 = 0,94 cm sehingga dapat disimpulkan bahwa larutan IIID dan n
heksana mengandung flavonoid dikarenakan warna noda yang terbentuk warna kuning
kehijauan tapi kemungkinan terdapat sedikit senyawa lain dalam plat tersebut karena
terdapat warna hijau pada saat diamati dibawah sinar UV. Untuk yang totolan paling besar
itu adalah larutan IIID dan totolan yang kecil adalah n heksana.
Sinar UV 254 nm Sinar UV 365 nm

46
VI. PEMBAHASAN
Uji flavonoid bertujuan untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida di dalam
ekstrak daun Psidium guajava. Flavonoid adalah senyawa polifenol yang mempunyai 15
atom kuinon, terdiri dari 2 cincin benzena yang dihubungkan menjadi rantai linear yang
terdiri dari 3 atom karbon. Penentuan uji flavonoid dilakukan dengan reaksi warna dan
kromatografi lapis tipis (KLT). Sampel berupa ekstrak yang telah dibebaskan dari klorofil
dengan n-heksana, dilarutkan dalam etanol dan dibagi menjadi 4 bagian yaitu larutan IIIA,
IIIB, IIIC dan IIID
Larutan IIIA digunakan sebagai blanko. Larutan IIIB dilakukan pengujian dengan
metode Bate-Smith dan Metcalf yaitu dengan mencampur larutan coba dengan 0,5 ml HCl
kemudian dipanaskan. Terjadi perubahan warna menjadi merah yang menunjukkan adanya
kandungan flavonoid dalam ekstrak Psidium guajava. Pada praktikum yang kami lakukan
untuk percobaan IIIB, percobaan tersebut berhasil menunjukkan adanya senyawa
leukoantosianin dengan ditandai perubahan warna merah dibandingkan dengan warna blanko.
Perubahan tersebut disebabkan karena terbentuknya garam flavilium (Achmad, 1986)

Larutan IIIC dilakukan pengujian dengan metode Wilstater yaitu dengan


menambahkan 0,5 ml HCl pekat ke dalam larutan uji. Penambahan asam akan menyebabkan
perubahan warna ketika reaksi reduksi berlangsung. Kemudian larutan coba ditambahkan
serbuk Mg. Pada proses penambahan ini terjadi reaksi eksoterm yaitu reaksi yang melepaskan
panas yang ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung gas dan pelepasan kalor
pada permukaan tabung reaksi. Gelembung gas yang terbentuk ini adalah gas H2.
Reaksi yang terjadi:

47
Mg + 2HCl Mg2+ + 2Cl- + H2

Produk yang dihasilkan pada reaksi di atas adalah MgCl2 dan H2 dimana MgCl2 berada dalam
kesetimbangan.
Reaksi:
MgCl2(aq) MgCl+ (aq) + Cl-

MgCl+ akan bereaksi dengan gugus karbonil pada flavon yang mengalami resonansi,
sehingga akan terbentuk ikatan baru yaitu pelepasan ikatan rangkap dan pembentukan gugus
hidroksil.
Reaksi yang terjadi merupakan pembentukan ikatan baru dimana adanya MgCl+ mampu
melarutkan flavon sehingga flavonoid dapat dipisahkan dari golongan kimia lain.
Setelah diberi serbuk Mg, larutan coba IIIC diencerkan dengan 2 ml air suling dan 1
ml butanol sehingga terbentuk 2 lapisan antara larutan fase butanol yang ada pada bagian
bawah. Diamati perubahan warna yang terjadi diantara kedua cairan. Terbentuk cincin
berwarna jingga yang menunjukkan adanya senyawa flavon dalam ekstrak Psidium guajava.
Namun hasil yang didapatkan pada kelompok kami tidak membentuk cincin berwarna
jingga. Dikarenakan saat perlakuan sampel tidak sesuai dengan petunjuk praktikum. Dimana
larutan n-butanol dan aquadest dimasukkan lebih dulu kedalam pereaksi kemudian
ditambahkan potongan magnesium, sehingga mengahasilkan warna yang keruh.
Larutan IIID dilakukan uji metode KLT dengan fase diam Kiesel gel 254, fase gerak
kloroform:aseton:asam formiat (6:6:1) dan penampak noda berupa uap amonia. Larutan IIID
dan fase n-heksana ditotolkan pada plat KLT, dimasukkan ke dalam chamber untuk dieluasi.
Terbentuk noda berwarna kuning intensif dengan nilai Rf 0,9375 yang menunjukkan bahwa
ekstrak Psidium guajava mengandung flavonoid

48
VII. KESIMPULAN

1. Uji Bate-Smith dan metcalf, terjadi perubahan warna larutan IIIB menjadi merah yang
menunjukkan adanya kandungan flavonoid dalam ekstrak Psidium guajava.
2. Uji Wilstater, tidak terjadi lapisan berwarna jingga kecoklatan, sehingga kelompok
kami tidak menunjukkan adanya kandungan flavon dalam ekstrak Psidium guajava
3. Uji dengan metode KLT di dapatkan harga Rf dengan harga:
Rf = 7,5 : 8 = 0,9375
Dan menghasilkan penampakan noda berwarna kuning intensif yang menunjukkan
adanya kandungan flavonoid dalam ekstrak Psidium guajava

49
BAB 4. IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN POLIFENOL
DAN TANIN

I. TUJUAN

Mahasiswa mampu melakukan identifikasi senyawa golongan polifenol dan tanin dalam
tanaman..

II. TINJAUAN PUSTAKA

a. Klasifikasi Jambu Biji


Jambu biji berasal dari Amerika tropik, tumbuh pada tanah yang gembur maupun liat, pada
tempat terbuka dan mengandung air cukup banyak. Pohon ini banyak ditanam sebagai pohon
buah-buahan. Namun, sering tumbuh liar dan dapat ditemukan pada ketinggian 1-1.200 m
dpl. Jambu biji berbunga sepanjang tahun (Hapsoh, 2011).

Secara botanis tanaman jambu biji diklasifikasikan sebagai berikut :


Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Class : Dicotyledoneae
Ordo : Myrtales
Famili : Myrtaceae
Genus : Psidium
Spesies : Psidium guajava L.
Nama Lokal : Jambu Biji

50
b. Morfologi Tumbuhan Jambu Biji
Jambu biji perdu atau pohon kecil, tinggi 2-10 m, percabangan banyak. Batangnya
berkayu, keras, kulit batang licin, mengelupas, berwarna cokelat kehijauan. Daun tunggal,
bertangkai pendek, letak berhadapan, daun muda berambut halus, permukaan atas daun tua
licin. Helaian daun berbentuk bulat telur agak jorong,ujung tumpul, pangkal membulat, tepi
rata agak melekuk ke atas, pertulangan menyirip, panjang 6-14 cm, lebar 3-6 cm, berwarna
hijau. Bunga tunggal, bertangkai, keluar dari ketiak daun, berkumpul 1-3 bunga, berwarna
putih. Buahnya buah buni, berbentuk bulat sampai bulat telur, berwarna hijau sampai hijau
kekuningan. Daging buah tebal, buah yang masak bertekstur lunak, berwarna putih
kekuningan atau merah jambu. Biji buah banyak mengumpul di tengah, kecil-kecil. Keras,
berwarna kuning kecoklatan (Hapsoh, 2011).

c. Manfaat Tumbuhan Jambu Biji


Tanaman jambu biji atau Psidium guajava L. Termasuk familia Myrtaceae, banyak
tumbuh di daerah-daerah di tanah air kita. Penduduk terlalu mementingkan buahnya,
sedangkan daun-daunnya hanya sebagian kecil saja yang memperhatikannya, padahal
mempunyai nilai obat yang baik, terutama untuk menyembuhkan sakit: diare dan astringensia
(Kartasapoetra, 1992).
Jambu biji memiliki beberapa kelebihan, antara lain buahnya dapat dimakan sebagai
buah segar, dapat diolah menjadi berbagai bentuk makanan dan minuman. Selain itu, buah
jambu biji bermanfaat untuk pengobatan (terapi) bermacam-macam penyakit, seperti
memperlancar pencernaan, menurunkan kolesterol, antioksidan, menghilangkan rasa lelah
dan lesu, demam berdarah, dan sariawan. Selain buahnya, bagian tanaman lainnya, seperti
daun, kulit akar maupun akarnya, dan buahnya yang masih muda juga berkhasiat obat untuk
menyembuhkan penyakit disentri, keputihan, sariawan, kurap, diare, pingsan, radang
lambung, gusi bengkak, dan peradangan mulut, serta kulit terbakar sinar matahari (Cahyono
B, 2010).
Ekstrak etanol daun jambu biji juga telah dilakukan penelitian terhadap uji aktivitas
anti oksidannya (Soebagio,et al. 2007) dan uji aktivitasnya sebagai anti bakteri penyebab
diare (Adyana, et al. 2004).
Daun jambu biji mempunyai manfaat bagi kesehatan yaitu sebagai antiinflamasi,
antidiare, analgesik, antibakteri, antidiabetes, antihipertensi, mengurangi demam dan
penambah trombosit (Kirtikar dan Bashu., 1998). Daun jambu biji putih telah terbukti secara

51
klinis menghambat pertumbuhan rotavirus yang menyebabkan enteritis pada anak-anak dan
menyembuhkan kejang dan penyakit diare akut (Lozoya et al., 2002; Wei et al., 2000).

d. Kandungan Kimia Daun Jambu Biji


Kandungan kimia pada daun jambu biji (Psidium guajava L.) menurut Taiz dan
Zeiger (2002) yaitu terpen, fenolik, dan senyawa mengandung nitrogen terutama alkaloid.
Kandungan kimia tersebut merupakan bagian dari sistem pertahanan diri yang berperan
sebagai pelindung dari serangan infeksi mikroba patogen dan mencegah pemakanan oleh
herbivora. Hasil fitokimia dalam ekstrak daun jambu biji putih adalah senyawa flavonoid,
tanin, triterpenoid, saponin, steroid, dan alkaloid (Arya, et al.,2012).
Flavonoid adalah senyawa yang terdiri dari dari 15 atom karbon yang umumnya
tersebar di dunia tumbuhan. Quercetin adalah zat sejenis flavonoid yang ditemukan dalam
buah-buahan, sayuran, daun dan biji-bijian. Hal ini juga dapat digunakan sebagai bahan
dalam suplemen minuman atau makanan. Saponin adalah jenis glikosida yang banyak
ditemukan dalam tumbuhan. Saponin memiliki karakteristik berupa buih. Sehingga ketika
direaksikan dengan air dan dikocok maka akan terbentuk buih yang dapat bertahan lama.
Minyak atsiri adalah kelompok besar minyak nabati yang berwujud cairan kental pada suhu
ruang namun mudah menguap sehingga memberikan aroma yang khas. Minyak atsiri
merupakan bahan dasar dari wangi-wangian atau minyak gosok (untuk pengobatan) alami.
Tanin merupakan substansi yang tersebar luas dalam tanaman dan digunakan sebagai energi
dalam proses metabolisme dalam bentuk oksidasi, Tanin juga sebagai sumber asam pada
buah. Alkaloid adalah sebuah golongan senyawa basa bernitrogen yang kebanyakan
heterosiklik dan terdapat didunia tumbuhan (tetapi ini tidak mengecualikan senyawa yang
berasal dari hewan).

e. Senyawa Golongan Tanin


Dalam metabolisme sekunder yang terjadi pada tumbuhan akan menghasilkan
beberapa senyawa yang tidak digunakan sebagai cadangan energi melainkan untuk
menunjang kelangsungan hidupnya seperti untuk pertahanan dari predator. Beberapa senyawa
seperti alkaloid, triterpen dan golongan phenol merupakan senyawa-senyawayang dihasilkan
dari metabolisme sekunder. Golongan fenol dicirikan oleh adanyacincin aromatik dengan
satu atau dua gugus hidroksil. Kelompok fenol terdiri dari ribuan senyawa, meliputi
flavonoid, fenilpropanoid, asam fenolat, antosianin, pigmen kuinon, melanin, lignin, dan
tanin, yang tersebar luas di berbagai jenis tumbuhan.

52
Tanin merupakan zat organik yang sangat kompleks dan terdiri dari senyawa fenolik.
Istilah tanin pertama sekali diaplikasikan pada tahun 1796 oleh Seguil. Tanin terdiri dari
sekelompok zat zat kompleks terdapat secara meluas dalam dunia tumbuh tumbuhan,
antara lain terdapat pada bagian kulit kayu, batang, daun dan buah buahan. Ada beberapa
jenis tumbuh tumbuhan atau tanaman yang dapat menghasilkan tanin, antara lain : tanaman
pinang, tanaman akasia, gabus, bakau, pinus dan gambir. Tanin juga yang dihasilkan dari
tumbuh tumbuhan mempunyai ukuran partikel dengan range besar. Tanin ini disebut juga
asam tanat, galotanin atau asam galotanat.
Tanin merupakan salah satu jenis senyawa yang termasuk ke dalam golongan
polifenol. Senyawa tanin ini banyak di jumpai pada tumbuhan. Tanin dahulu digunakan untuk
menyamakkan kulit hewan karena sifatnya yang dapat mengikat protein. Selain itu juga tanin
dapat mengikat alkaloid dan glatin.Tanin adalah kelas utama dari metabolit sekunder yang
tersebar luas pada tanaman. Tanin merupakan polifenol yang larut dalam air dengan berat
molekul biasanya berkisar 1000-3000 (Waterman dan Mole tahun 1994, Kraus dll., 2003).
Menurut definisi, tanin mampu menjadi pengompleks dan kemudian mempercepat
pengendapan protein serta dapat mengikat makromolekul lainnya (Zucker, 1983). Tanin
merupakan campuran senyawa polifenol yang jika semakin banyak jumlah gugus fenolik
maka semakin besar ukuran molekul tanin.Pada mikroskop, tanin biasanya tampak sebagai
massa butiran bahan berwarna kuning, merah, atau cokelat.
Daun jambu biji (Psidium guajava L) adalah salah satu obat tradisional yang masih
sering digunakan sampai sekarang. Daun jambu biji sebagai obat tradisional digunakan untuk
pengobatan diare, radang lambung, sariawan, keputihan, kencing manis. Secara alamiah daun
jambu biji yang diketahui berkhasiat dan aman dikonsumsi (Dalimartha, 2001). Salah satu zat
yang terkandung dalam tananaman jambu biji (Psidium guajava L) adalah tanin yang dapat
digunakan sebagai obat anti diare. Tanin merupakan senyawa fenolik larut air dengan BM
500-3000, memberikan reaksi umum senyawa fenol dan memiliki sifat-sifat khusus seperti
presipitasi alkaloid, gelatin, dan protein-protein lain. Tanin banyak tedapat di dalam
tumbuhan berpembuluh, khususnya dalam jaringan kayu, selain itu banyak terdapat pada
bagian daunnya.
Senyawa aktif pada daun yang berfungsi sebagai anti diare adalah tannin. Ekstrak
daun jambu biji dapat digunakan untuk membasmi bakteri/mikroba penyebab diare
(Salmonella typhii, E. coli, Shigella dysentriae). Komposisi kimia di dalam daun jambu biji
adalah tannin 9 - 12%, minyak atsiri, minyak lemak dan asam malat, asam ursolat, asam
psidiolat, asam kratogolat, asam oleanolat, asam guajavarin dan vitamin.

53
Tanin merupakan komponen zat organik derivat polimer glikosida yang terdapat
dalam bermacam-macam tumbuhan, terutama tumbuhan berkeping dua (dikotil). Monomer
tannin adalah digallic acid dan D-glukosa. Ekstrak tanin terdiri dari campuran senyawa
polifenol yang sangat kompleks dan biasanya tergabung dengan karbohidrat rendah. Oleh
karena adanya gugus fenol, maka tannin akan dapat berkondensasi dengan formaldehida.
Tanin terkondensasi sangat reaktif terhadap formaldehida dan mampu membentuk produk
kondensasi, berguna untuk bahan perekat termosetting yang tahan air dan panas. Tanin
diharapkan mampu mensubsitusi gugus fenol dari resin fenol formaldehid guna mengurangi
pemakaian fenol sebagai sumberdaya alam tak terbarukan.
Tanin merupakan metabolit sekunder tanaman yang bersifat astrigen dengan rasa khas
yang sepat. Secara umum tannin terbagi atas tannin (proanthocyanidins) hidrolisis dan tannin
kondensasi. Tannin hidrolisis diprekursor oleh asam dehydroshikimic sedangkan tannin
kondensasi disintesis dari prekursor flavonoid. Tingginya kandungan tannin dari kalus yang
dihasilkan secara in vitro dapat dipahami karena produksi metabolit sekunder pada kalus in
vitro dipengaruhi oleh berbagai faktor di antaranya komposisi media yang digunakan dan zat
pengatur tumbuh yang diaplikasikan.
Psidium guajava L. diketahui mengandung beberapa bahan aktif antara lain tanin,
flavonoid, guayaverin, leukosianidin, minyak atsiri, asam malat, damar, dan asam oksalat,
tetapi hanya komponen khusus seperti flavonoid, tanin, minyak atsiri, dan alkaloid yang
memiliki efek farmakologi sebagai antidiare terutama pada penyakit diare yang disebabkan
oleh bakteri.Senyawa tanin yang terkandung dalam daun Psidium guajava L. dapat
diperkirakan memiliki jumlah sebanyak 912%. Tanin dapat menimbulkan rasa sepat pada
buah dan daun Psidium guajava L. tetapi berfungsi memperlancar sistem pencernaan, dan
sirkulasi darah. Tanin mempunyai sifat sebagai pengelat berefek spasmolitik yang
mengkerutkan usus sehingga gerak peristaltik usus berkurang.
Tanin atau lebih dikenal dengan asam tanat, biasanya mengandung 10% H2O.
Struktur kimia tanin adalah kompleks dan tidak sama. Asam tanat tersusun 5 - 10 residu ester
galat, sehingga galotanin sebagai salah satu senyawa turunan tanin dikenal dengan nama
asam tanat. Beberapa struktur kimia senyawa tanin adalah sebagai berikut.

54
Gambar 1.1: Struktur kimia tanin
Tanin terkondensasi (condensed tannins) biasanya tidak dapat dihidrolisis, tetapi
dapat terkondensasimenghasilkan asam klorida. Tanin jenis ini kebanyakan terdiri dari
polimerflavonoid yang merupakan senyawa fenol. Nama lain dari tanin ini adalah
Proanthocyanidin. Proanthocyanidin merupakanpolimer dari flavonoid yang dihubungkan
dengan melalui ikatan C-8 dengan C-4. Salahsatu contohnya adalah Sorghum procyanidin,
senyawa ini merupakan trimeryang tersusun dari epiccatechin dan catechin.Senyawa ini jika
dikondensasi maka akan menghasilkan flavonoid jenis flavan dengan bantuan nukleofil
berupa floroglusinol.
Tanin terhidrolisis biasanya berikatan dengan karbohidrat dengan
membentuk jembatan oksigen, maka dari itu tanin ini dapat dihidrolisis denganmenggunakan
asam sulfat atau asam klorida. Salah satu contoh jenis tanin iniadalah gallotanin yang
merupakan senyawa gabungan dari karbohidrat denganasam galat. Selainmembentuk
gallotanin, dua asam galat akan membentuk taninterhidrolisis yang biasa disebut
Ellagitanins.Ellagitanin sederhana disebut jugaester asam hexahydroxydiphenic (HHDP).
Senyawa ini dapat terpecah menjadiasam galic jika dilarutkan dalam air.

55
Gambar 2.1: Tanin Terkondensasi, Proanthocyanidin merupakan polimer dari flavonoid
yang dihubungkan dengan melalui ikatan C-8 dengan C-4.

Gambar 3.1: Tanin Terhidrolisis, Gallotanin prototipe merupakanglukosapentagalloyl(-1, 2,


3, 4, 6-Pentagalloyl-OD-Glukopyranose). PGGmemiliki5hubunganesteridentikyang
melibatkangugus hidroksialifatikgulainti. PGG memiliki banyak isomer seperti Gallotanin.

56
Rantai ester poligallol ditemukan di dalam gallotanin terbentuk dari meta-atau para-
depside obligasi, melibatkan hidroksil fenolik dari pada gugus hidroksialifatik. Depside
obligasi lebih mudah dihidrolisis dari pada ikatan ester alifatik. Metanolisis dalam asam
lemah dengan menggunakan metanol dapat menghancurkan depside tetapi tidak estero
bligasi. Dengan demikian poliol inti dengan kelompok galloyl yang teresterisasi dapat
dihasilkan dari campuran kompleks dari esterpoly galloyl oleh metanolisis dengan buffer
asetat. Asam kuatmineral, panas, dan metanol dapat digunakan untuk metanolisis baik
depside dan ester obligasi menghasilkan poliol inti dan metil galat. Hidrolisis dengan asam
kuat dapat mengubah galotanin menjadi asam galat dan poliol inti.

57
Gambar 3.3: Aceritannin, gallotannin yang ditemukan pada daun maple dan hamamellitannin
adalah gallotannin dari kulit kayu pohon ek.

Gambar 4.1: Elagitanin sederhana merupakan ester dari asam hexahidroxidifenik (HHDP).

58
f. Poli fenol
Tumbuhan yang hidup disekitar kita memiliki kandngan kimia yang unk. Kimia bahan
alam yang merupakan hasil dari metabolisme sekunder. Bahan kimia yang dimaksud
biasanya di gunakan manusia untuk memenuhi kebutuhannya dalam bidang farmasi. Salah
satu kelompok senyawa yang banyak memberikan manfaat bagi manusia adalah polifenol.
Senyawa yng termasuk kedalam polifenol ini adalah semua senyawa yang memiliki struktur
dasar berupa fenol. Polifenol adalah kelompok zat kimia yang ditemukan pada tumbuhan. Zat
ini memiliki tanda khas yakni memiliki banyak gugus fenol dalam molekulnya. Fenol sendiri
merupkan struktur yangterbentuk dari benzena tersubtitusi dengan gugus OH. GugusOH
yang terkandung merupakan aktivator yang kuat dalam reaksi subtitusi aromatik elektrofilik
(Fessenden,1982).

Fenol

Polifenol dapat diklasifikasikan menjadi beberpa jenis berdasarkan unit


basanya(Wikipedia.com)antara lain Asam Galia, Asam Sinamat, dan Flavon. Selain itu
senyawa-senyawa polifenol jikaberdasarkan komponen penyusun fenolnya dapaat dibagi
menjadiFenol, pyrocatechol, pirogallol,resorsinol, floroglucinol, dan hidroquinon. Jenis-
jenisdiatas akan dibahas dalam makalah ini. Selainitu juga makalah ini juga akan
membahassalah satu contoh senyawa polifenol yang ada didalam teh yang sering kita
konsumsi.Senyawa yang dimaksud antara lain epicatechin dan epigallocatechin.Senyawa ini
akandibahs tentang reaksi oksidasi dan biosintesis dari turunan epigallocatechin yangberupa
senyawa Epigallocatechin gallate (EGCG).Kerena polifenol banyak dimanfaatkan
olehmanusia dan sebagian telah diproduksidengan cara disintesis secara industri sebagai obat.
Itulahsebabnya kita akan membahastentang beberapa contoh dan fungsi-fungsi senyawa
polifen.

59
g. Identifikasi senyawa

Preparasi Sampel
Ekstrak Psidium guajava sebanyak 0.3 gram ditambah 10 mL aquadest panas, diaduk
dan kemudian dibiarkan sampai tercapai temperature ruangan. Kemudian tambahkan 3-4
tetes NaCl 10%, diaduk kemudian disaring. Filtrate kemudian dibagi menjadi 3 bagian dan
disebut larutan IVA, IVB, IVC
Reaksi Uji
Uji Gelatin
Larutan IVA digunakan sebagai blanko, larutan IVB ditambah sedikit larutan gelatin
dan 5 mL NaCl 10%. Jika terjadi endapan putih menunjukan adanya Tanin.
Uji Ferri Klorida
Larutan IVA digunakan sebagai blanko, larutan IVC ditambah beberapa tetes larutan
FeCl3, kemudian di amati perubahan warnanya. Jika terjadi warna hijau kehitaman
menunjukkan adanya Tanin. Jika terjadi warna hijau biru hingga kehitaman menunjukkan
adanya Polifenol
Kromatografi Lapis Tipis
Larutan IVA ditotolkan pada fase diam.
Fase diam : Kiesel Gel 254
Fase gerak : Kloroform :Etilasetat : Asamformiat (0.5:9.0:05)
Penampak noda : pereaksi FeCl3
Adanya polifenol ditunjukkan dengan timbulnya noda berwarna hitam pada sampel

60
h. Pemisahan KLT
Thin Layer Chromatography (TLC)
Kromatografi lapis tipis adalah salah satu contoh kromatografi planar. Fase diamnya
(Stationary Phase) berbentuk lapisan tipis yang melekat pada gelas/kaca, plastik, aluminium.
Sedangkan fase geraknya (Mobile Phase) berupa cairan atau campuran cairan, biasanya
pelarut organi dan kadangkadang juga air. Fase diam yang berupa lapisan tipis ini dapat
dibuat dengan membentangkan /meratakan fase diam (adsorbent=penjerap=sorbent) diatas
plat/lempeng kaca plastik ataupun aluminium.Digunakan untuk pemisahan zat secara cepat
dengan menggunakan zat penyerap berupa serbuk halus yang dilapiskan serba rat pada
lempeng kaca. Lempeng yang dilapis dapat dianggap sebagai kolom kromatografi terbuka
dan pemisahan didasarkan pada penyerapan pembagian atau gabungannya tergantung dari zat
penyerap pembagian atau gabungannya tergantung dari jenis zat penyerap dan cara
pembuatan lapisan zat penyerap dan jenis zat pelarut. KLT dengan penyerap penukar ion
dapat digunakan untuk pemisahan senyawa polar.
Fase diam
Sifat fase diam yang satu dengan fase diam yang lain berbeda karena strukturnya,
ukurannya, kemurniannya, zat tambahan sebagai pengikat dll. Fasa diam yang digunakan
TLC tidak sama dengan yang digunakan untuk kromatografi kolom, terutama karena ukuran
dan zat yang ditambahkan. Fase diam dijual dengan spesifikasi tertentu, iaitu ukuran
(diameter) dalam mesh atau j^m dan untuk kegunaannya (mis: untuk TLC atau kromatografi
kolom). Beberapa fase diam yang banyak dijual dipasaran.
Silika gel
Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam
perdagangan dijual dengan variasi ukuran (diameter) 10-40m. Makin kecil diameter akan
makin lambat kecepatan alir fase geraknya dengan demikian mempengaruhi kualitas
pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi dari 300-1000 m2/g. Bersifat higroskopis,
pada kelembaban relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%. Macam-macam silka gel yang
dijual dipasaran, Silika gel dengan pengikat. Pada umumnya digunakan pengikat gypsum,
(CaSO4 5-15%). Jenis ini diberi nama Silika gel G. Ada juga menggunakan pengikat pati
(starch) dan dikenal Silika gel S, penggunaan pati sebagai pengikat mengganggu penggunaan
asam sulfat sebagai pereaksi penentuan bercak.Silika gel dengan pengikat dan indicator
flouresensi. Jenis silica gel ini sama seperti silika gel diatas dengan tambahan zat
berfluoresensi bila diperiksa dibawah lampu UV A, panjang atau pendek. Sebagai indicator
digunakan timah kadmium sulfida atau mangan-timah silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF

61
atau Silika gel GF254 (berflouresensi pada 254 , nm). Silika gel tanpa pengikat, dikenal
dengan nama Silika gel H atau Silika gel N. Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indicator
flouresensi. Silika gel untuk keperluan pemisahan preparatif.

Fase gerak
Yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik. Dapat digunakan
satu macam pelarut organic saja ataupun campuran. Bilamana fase gerak merupakan
campuran pelarut organik dengan air maka mekanisme pemisahan adalah partisi. Pemilihan
pelarut organic ini sangat penting karena akan menentukan keberhasilan pemisahan.
Pendekatanpolaritas adalah yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut. Senyawa polar akan
lebih mudah terelusi oleh fase gerak yang bersifat polar dari pada fase gerak yang non polar.
Sebaliknya, senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh fase gerak non polar dari pada fase
gerak yang polar.

Pembuatan plat (lempeng) silica gel


30 Gram fase diam berbentuk serbuk (dengan diameter tertentu dijual dengan merk
dagang tertentu misalnya Silica gel GF 254) dibuat bubur dengan air atau pelarut lain
sejumlah tertentu (lihat tabel 2) diratakan diatas 4-5 lempeng kaca ukuran 20X20 cm, dalam
waktu tidak lebih dari 4 menit. Perataan ini dapat menggunakan alat perata Stahl-Desaga
untuk plat kaca ukuran 20X20 cm, 20X10 cm dengan ketebalan dapat diatur 0,25-2,0 mm.
Bila ukuran plat lebih kecil dapat dibuat dengan mencelupkan ke dalam bubur adsorbent.
Setelah lapisan bubur ini mengering diruangan kemudian dipanaskan di dalam oven pada
100-120C selama 60 menit, dengan tujuan semua air akan menguap. Proses pengeringan
atau penghilangan air disebut proses mengaktifkan plat kromatografi (fase diam), selanjutnya
didalam rak penyimpan plat-plat ini dimasukkan kedalam dexicator. Sehingga pada waktu
penyimpanan plat-plat tadi tidak menyerap lembab (air) dari udara. Dengan demikian
mekanisme pemisahan komponen (senyawa-senyawa) yang ditahan fase diam adalah
mekanisme absorption.

62
Penyiapan dan penotolan sampel
Sampel atau cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai (hampir pelarut organik
dapat digunakan dan biasanya dipilih yang mudah menguap), air digunakan hanya bila tidak
dapat dicari pelarut organik yang sesuai. Untuk keperluan analisis kuantitatif sample harus
ditimbang demikian juga pelarut yang digunakan. Kemudian larutan sample disimpan dalam
wadah yang tertutup rapat untuk menghindari penguapan. Pada umumnya ditotolkan 1-20 l
larutan yang mengandung 50-100 g sample tiap bercak untuk kromatografi absorbsi dan 5-
2Qg sample untuk kromatografi partisi. Penotolan dapat dilakukan dengan gelas kapiler
yang dibuat sendiri atau dengan pipet mikro. Untuk keperluan kuantitatif digunakan
quantitative microsyringe. Kepada plat TLC konvensional (20X20 cm, 5X20 cm, tebal 0,2
mm) sample ditotolkan sebagai bercak

Tinjauan Eluen
Fase gerak merupakan medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa pelarut.
Fase gerak bergerak dalam fase diam karena adanya gaya kapiler. Pelarut yang digunakan
sebagai fase gerak hanyalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila diperlukan system
pelarut mltikomponen ini harus berupa suatu campuran yang sesederhana mungkin yang
terdiri atas maksimum 3 komponen. Angka banding campuran dinyatakan dalam bagian
volume total 10 (Nyiredy, 2002). Pelarut pengembang dikelompokkan ke beberapa golongan
Snyders berdasarkan kekuatan pelrutnya. Menurut Stahl (1985) eluen atau fase gerak yang
digunakan dalam KLT dikelompokkan ke dalam 2 kelompok, yaitu untuk pemisahan
senyawa hidrofil dan lipofil. Eluen untuk pemisahan senyawa hidrofil meliputi air, methanol,
asam asetat, etanol, isopropanol, aseton, n-propanol, tert-butanol, fenol, n-butanol, sedangkan
untuk pemisahan senyawa lipofil meliputi etil asetat, eter, kloroform, benzene, toluene,
sikloheksana, dan petroleum eter.
1. Kloroform
a. Sifat fisis
Rumus molekul : CHCl3
Berat molekul : 119,39 g/gmol
Wujud : cairan bening
Titik didih : 61,20C
Titik leleh : -63,50C

63
Densitas : 1,489 g/cm3, 32oC
Suhu kritis : 264oC
Specific gravity :1,489
Viskositas : 0,57 cP (20oC)
Kapasitas panas : 0,234 kal/goC, pada 20oC
Tekanan kritis : 53,8 atm
Volume kritis : 0,239 m3/kmol
Tegangan permukaan : 0,0267 N/m, 25C
Kapasitas panas : 113,666 kJ/kmol.K, 25C
Panas penguapan : 29,5 kJ/mol, 61,2C
Energi Gibbs : -18,663 kkal/mol
Entalpi pembentukan : -32,12 kkal/mol
Kelarutan dalam 100 ml bagain air : 0,8 g (250C)
(Ketta & Cunningham, 1992)

b. Sifat kimia
Kloroform jika bereaksi dengan udara atau cahaya seara perlahan-lahan akan
teroksidasi menjadi senyawa beracun phosgene (karbonil klorida).
Reaksi :
udara atau cahaya
CHCl3 + O2 COCl2 + HCl
Kloroform dapat direduksi dengan bantuan zeng dan asam klorida untuk
membentuk metilen klorida. Jika proses reduksi dilakukan dengan bantuan debu
sebg dan air akan dapat diperoleh metana.
Reaksi :
Zn
CHCl3 + 2H COCl2 + HCl
HCl
Zn
CHCl3 + 6H CH4 + 3 HCl
H2O

Kloroform dapat bereaksi dengan asam nitrat pekat untuk membentuk nitro
kloroform atau kloropikrin.
Reaksi :
CHCl3 + HNO3 CCl2NO2 + H2O
Kloropikrin biasanya digunakan sebagai insektisida.

64
Kloroform dapat mengalami proses klorinasi dengan klorin jika terkena sinar
matahari dan mengahsilkan karbon tetraklorida.
Reaksi :
CHCl3 + Cl2 CCl4 + HCl
(Kirk and Othmer, 1982)

2. Aseton
a. Sifat-sifat fisika
Rumus molekul : CH3COCH3
Berat molekul : 58,080 kg/kmol
Densitas : 785,601 kg/m3, 25C
Viskositas : 0,32 cP, 20C
Titik didih : 56,29C
Titik leleh : -94,6C
Temperatur kritis : 235,05C
Tekanan kritis : 4.701 kPa
Volume kritis : 0,209 m3/kmol
Tegangan permukaan : 0,0230 N/m, 25C
Kapasitas panas : 126,281 kJ/kmol.K, 25C
Panas penguapan : 29,1 kJ/mol
Entalpi penguapan : 30,836 kJ/mol
Energi Gibbs : -36,47 kkal/mol
Entalpi pembentukan : -59,33 (cair) kkal/mol
Kelarutan (dalam air) : larut dalam berbagai rasio

b. Sifat-sifat kimia
Dengan air akan membentuk suatu 1,1-diol yang disebut gem-diol atau hidrat.
Reaksi ini bolak-balik dan biasanya kesetimbangan terletak pada sisi karbonil.
Reaksi :

65
Dengan hidrogen sianida dalam kondisi sedikit basa (aseton hidrat) akan
membentuk sianohidrin aseton.
Reaksi :

Dengan amonia dan amina primer akan membentuk imina, suatu senyawa yang
mengandung gugusan C = N. Reaksi ini dapat berjalan dengan baik pada keadaan
asam, dimana pH optimum 3-4.
Reaksi :

Dengan amina sekunder (R2NH akan menghasilkan ion iminium yang bereaksi
lebih lanjut menjadi enamina (vinilamina).
Reaksi :

3. Asam formiat
I. Sifat fisika
Rumus molekul : HCOOH
Berat molekul : 46,03 g/mol
Densitas : 785,601 kg/m3, 25C
Viskositas : 1,57 cP, 25C

66
Titik didih : 100,8C (760 mmHg)
Titik leleh : 8,4C
Spesifik gravity : 1,22647, 20C
Tegangan permukaan : 37,67 dyne/cm, 22C
Kapasitas panas : 82,8 joulel/mol.K, 0C
Panas pembentukan : 3031 kal/mol
Panas penguapan : 104 kal/mol
Panas pembakaran cairan : 60,9 kkal/mol, pada 25C
Panas pembentukan cairan : 101,52 kkal/mol, pada 25C
II. Sifat kimia
Asam formiat dapat bercampur sempurna dengan air dan sedikit larut dalam
benzene, karbon tetra klorida, toluene dan tidak larut dalam hidrokarbon alifatik
seperti heptana dan oktana.
Asam formiat dapat melarutkan nilon, poliamida tetapi tidak melarutkan Poli
Vinil Chlorida (PVC).
Campuran Asam formiat dan air membentuk campuran azeotrop (yaitu campuran
larutan yang mempunyai titik didih mendekati titik beku) dengan kandungan
maksimum Asam formiat 77,5 % pada tekanan atmosfer.
Asam formiat akan terdekomposisi menjadi Karbon dioksida dan air pada
temperatur 100 oC atau dalam temperatur kamar bila ditambahkan katalis
Palladium.
Asam formiat terhidrasi oleh Asam sulfat pekat dan menghasilkan Karbon
monoksida dan air.

Tinjauan Indeks Polaritas


Pelarut Indeks Polaritas
Pentana 0
1,1,2-trikorotrifluoroetana 0
Siklopentana 0,1
Heptane 0,1
Heksana 0,1

67
Iso oktana 0,1
Petroleum eter 0,1
Sikloheksana 0,2
N-butilklorida 1,0
Toluene 2,4
Metal t-butil eter 2,5
O-xylene 2,5
Klorobenzena 2,7
O-diklorobenzena 2,7
Etil eter 2,8
Diklorometana 3,1
Etilen diklorida 3,5
N-butil alcohol 3,9
Isopropyl alcohol 3,9
N-butil asetat 4,0
Isobutil alcohol 4,0
Metal isoamil keton 4,0
N-propoil alcohol 4,0
Tetrahidrofuran 4,0
Kloroform 4,1
Metal isobutyl keton 4,2
Etil asetat 4,4
Metal n-propil keton 4,5
Metal etil keton 4,7
1,4-dioxana 4,8
Aseton 5,1
Methanol 5,1
Piridin 5,3
2-metoksietanol 5,5
Aseetonitrit 5,8
Propilen karbonat 6,1
N-n dimetilformamida 6,4
Dimetil asetamida 6,5
N-metilpirolidin 6,7
dimetilsulfoksida 7,2

68
III. BAGAN ALIR

A. PREPARASI SAMPEL

0,3 gram ekstrak ditambah 10 ml aquadest panas, diaduk dan dibiarkan sampai
temperatur kamar, lalu tambahkan 3-4 tetes 10% NaCl, diaduk dan disaring.

Filtrat dibagi menjadi tiga bagian masing-masing 3 ml dan disebut sebagai


larutan IV A, IV B dan IV C.
B. UJI GELATIN
Larutan IV A digunakan sebagai blanko, larutan IV B ditambah dengan sedikit
larutan gelatin dan 5 ml larutan NaCl 10%.

Jika terjadi endapan putih menunjukkan adanya tanin.

C. UJI FERRI KLORIDA


Sebagian larutan IV C diberi beberapa tetes larutan FeCl3 kemudian diamati
terjadinya perubahan warna.

Jika terjadi warna kehitaman menunjukkan adanya tanin.

Jika pada penambahan gelatin dan NaCl tidak timbul endapan putih, tetapi
setelah ditambahkan dengan larutan FeCl3 terjadi perubahan warna menajdi
hijau biru hingga hitam, menunjukkan adanya senyawa polifenol.

FeCl3 positif, uji gelatin positif tanin (+)


FeCl3 positif, uji gelatin negative polifenol (+)
FeCl3 negatif polifenol (-), tanin (-)

D. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Sebagian larutan IV C digunakan untuk pemeriksaan KLT.


Fase diam: Kiesel Gel 254
Fase gerak: Kloroform-Etil asetat-Asam formiat (0,5 : 9 : 0,5)
Penampak noda: Pereaksi FeCl3

69
Jika timbul warna hitam menunjukkan adanya polifenol dalam sampel.

IV. SKEMA KERJA

a. Preparasi Sampel

+ 0,3 gram ekstrak Filtrat dibagi tiga


+ 10ml aquadest bagian masing-
panas diaduk masing 3ml,
dan dibiarkan disebut sebagai
sampai temperatur
larutan IVA, IVB,
kamar,lalu + 3-4
dan IVC
tetes 10% NaCl
diaduk dan
disaring.

b. Uji Gelatin

Larutan
Larutan IVB + sedikit Jika terjadi endapan
IVA
larutan gelatin + 5ml putih menunjukkan
sebagai
larutan NaCl 10% adanya tanin
blanko

c. Uji Ferri Klorida

Larutan IVC Jika terjadi warna hijau kehitaman adanya tanin


diberi Jika penambahan Gelatin dan NaCl tidak timbul
beberapa endapan putih, tetapi setelah + dengan larutan
tetes larutan FeCl3 terjadi perubahan warna hijau biru hingga
FeCl3 hitam adanya senyawa polifenol
diamati FeCl3 positif, uji gelatin positif tanin (+)
perubahan FeCl3 positif, uji gelatin negatif polifenol (+)
warna FeCl3 negatif polifenol (-), tanin (-)

70
d. Kromatografi Lapis Tipis

Filtrat di
Larutan
uapkan ad
IVC ad
kering
larutan
dengan
menjadi
metanol.
basa

Totolkan Masukan plat Jika timbul


pada plat KLT ke dalam warna
KLT chamber yang hitam
telah jenuh. adanya
Kemudian polifenol
lakukan dalam
pemeriksaan sampel
KLT

71
V. HASIL

a. Preparasi Sampel
0,3 gram ekstrak ditambah 10 ml aquadest panas, diaduk dan dibiarkan sampai temperatur
kamar, lalu tambahkan 3-4 tetes 10% NaCl, diaduk dan disaring. Filtrat dibagi menjadi tiga
bagian masing-masing 3 ml dan disebut sebagai larutan IV A, IV B dan IV C.
b. Uji Gelatin
Pada uji gelatin larutan VI A sebagai blanko dan larutan IV B ditambah sedikit dengan
larutan gelatin dan 5 ml larutan NaCl 10 %, sehingga terjadi perubahan warna dan terdapat
endapan putih dibawah tabung yang berarti larutan IV B positif mengandung tanin yang
dibandingkan dengan blanko.
Sebelum Terdapat endapan Setelah terdapat endapan putih
Berwarna putih kekuningan

c. Uji Ferri Klorida


Pada Uji ferri klorida laruan IV A sebagai blanko dan larutan IV C diberi beberapa tetes
larutan FeCl3 kemudian diamati terjadinya perubahan warna dan menghasilkan warna hijau
kehitaman yang berarti larutan IV C mengandung tanin (positif tanin dan negatif polifenol),
karena pada saat ditetesi FeCl3 positif, uji gelatin positif tanin (+).

72
d. Kromatografi Lapis Tipis
Pada pemisahan dengan kromatografi lapis tipis larutan IV A ditotolkan ke plat KLT sampai
totolan pekat pada saat diamati di sinar UV 254 dan kelompok kami menotolkan sebanyak 9
totolan (3 kapiler) sehingga totolan pada plat KLT menjadi pekat. Kemudian dieluasi dan
diamati pada sinar UV 254 dan diberi penampak noda (Pereaksi FeCl3), dikeringkan dilemari
asam dan amati pada sinar UV 365, dihasilkan 4 noda dan noda tersebut berwarna hitam yang
berarti menunjukkan adanya polifenol dalam larutan IV A yang berisi ekstrak Psidium
guajava dengan nilai Rf yaitu noda 1 (1,1/8 = 0,14 cm), noda 2 (2,5/8 = 0,31 cm), noda 3 (4/8
= 0,50 cm) dan noda 4 (5,3/8 = 0,66 cm).

Sebelum dieluasi Setelah dieluasi


Pada Sinar UV 254

Setelah Pemberian Di amati Pada Sinar UV 365 dan Noda dilingkari


Penampak noda pereaksi FeCl3

73
VI.PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini yaitu identifikasi senyawa golongan polifenol dan tanin pada
ekstrak psidium guajava. Tahap pertama yaitu preparasi sampel dimana 0,3 gram ekstrak
ditambah 10 ml aquadest panas kemudian diaduk dan dibiarkan sampai temperatur kamar lalu
ditambahkan 3-4 tetes 10% NaCl, diaduk dan ditunggu dingin baru disaring. Kemudian filtrat
dibagi menjadi 3 bagian masing-masing dibagi rata sebagai larutan IV A, IV B dan IV C.

Tahap kedua yaitu Uji gelatin, dimana larutan IV A sebagai blanko dan larutan IV B
ditambah dengan sedikit larutan gelatin dan 5 ml larutan NaCl 10% dan dihasilkan endapan
putih yang berarti terdapat senyawa golongan tanin pada larutan IV B yang berisi ekstrak
jambu biji.

Tahap ketiga yaitu Uji Ferri Klorida, dimana larutan IV A sebagai blanko dan larutan IV C
diberi beberapa tetes larutan FeCl3 kemudian dihasilkan warna hijau kehitaman yang berarti
menunjukkan senyawa golongan tanin pada larutan IV C yang berisi ekstrak jambu biji dan
pada larutan IV C tersebut negatif polifenol karena larutan tersebut tidak menghasilkan warna
hijau biru pada saat ditetesi dengan FeCl3.

Tahap terakhir yaitu Kromatografi lapis tipis dimana Larutan IV A ditotolkan pada plat KLT
sampai pekat, untuk mengetahui pekat atau masih belum pekat yaitu dengan diamati pada
sinar UV 254 dan kelompok kami menotolkan sebanyak 9 totolan (3 kapiler) baru terlihat
pekat pada saat diamati disinar UV 254 dan difoto. Kemudian dieluasi, setelah dieluasi
dikeringkan di lemari asam dan diamati disinar UV 254 lalu diberi penampak noda yaitu
pereaksi FeCl3 dan dikeringkan dilemari asam, kemudian diamati pada sinar UV 365 yang
dihasilkan 4 noda dengan warna hitam pada plat KLT yang berarti larutan IV A mengandung
senyawa polifenol dan nilai Rf noda 1 yaitu 1,1/8 = 0,14 cm, noda 2 yaitu 2,5/8 = 0,31 cm,
noda 3 yaitu 4/8 = 0,50 cm dan noda 4 yaitu 5,3/8 = 0,66 cm.

74
VII.KESIMPULAN

1. Uji gelatin, terbentuk endapan putih pada larutan IVB yang menunjukkan adanya
kandungan tanin dalam ekstrak daun Psidium guajava.
2. Uji Ferri Klorida, terjadi perubahan warna pada larutan IVC menjadi hjau kehitaman
yang menunjukkan adanya kandungan tanin dalam ekstrak daun Psidium guajava
3. Uji dengan metode KLT menghasilkan penampakan noda berwarna hitam yang
menunjukkan adanya kandungan polifenol dalam ekstrak daun Psidium guajava
4. Nilai Rf kelompok kami pada penampakan noda di duga mengandung senyawa tanin
pada ekstrak daun Psidium guajava sebesar 0,66. Dimana hampir mendekati nilai Rf
sebenarnya yaitu 0,62

75
BAB 5. IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN ANTRAKINON

I. TUJUAN
Mahasiswa mampu melakukan identifikasi senyawa golongan antrakinon dalam tanaman.

II. TINJAUAN PUSTAKA


A. Klasifikasi Kelembak
Tumbuhan kelembak (Rheum officinale Baill.) mempunyai klasifikasi sebagai
berikut:
Divisi : Spermatophyta
Sub divisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledonae
Bangsa : Polygonales
Suku : Polygonaceae
Marga : Rheum
Jenis : Rheum officinale Baill.
(Depkes, 2010).
Kelembak merupakan salah satu tanaman yang sering digunakan untuk pengobatan di
Indonesia. Bagian yang digunakan dalam tanaman ini adalah akar dan rhizomanya. Dengan
indikasi untuk mengobati konstipasi, jaundice, amenorea (tidak haid). Zat aktif yang ada
dalam tanaman ini antara lain turunan antrakinon (termasuk glikosida), rhein, emodin,
chrysophanol, aloe- emodin, physcion (Depkes, 2010).

Rheum officinale atau kelembak ini tergolong tanaman C, fiksasi karbonnya terjadi
melalui rubisko,enzim siklus Clvin yang menambahkan CO2 pada ribolusa bifosfat . produk

76
fiksasi karbon organikn pertamanya ialah senyawa berkarbon 3 (3-fosfogliserat). Tumbuhan
tipe C3 memproduksi sedikit makanan apabila stomatanya tertutup pada hari yang panas dan
kering. Tingkat CO2 yang menurun dalam daun akan mengurangi bahan ke siklus Calvin.
Yang membuat tambah parah, rubisko ini dapat menerima O2 sebagai pengganti CO2 .
Karena konsentrasi O2 melebihi konsentrasi CO2 dalam ruang udara daun, rubisko
menambahkan O2 pada siklus Calvin dan bukannya CO2. Produknya terurai, dan satu
potong, senyawa berkarbon 2 dikirim keluar dari kloroplas. Mitokondria dan peroksisom
kemudian memecah molekul berkarbon 2 menjadi CO2. Proses ini yang disebut
Fotorespirasi. Akan tetapi tidak seperti respirasi sel, fotorespirasi tidak menghasilkan ATP.
Dan tidak seperti fotosintesis, fotorespirasi tidak menghasilkan makanan, tapi menurunkan
keluaran fotosintesis dengan menyedot bahan organik dari siklus Calvin.

Tahapan siklus Calvin pada tanaman C3:


Fase 1 :
Fiksasi karbon, Siklus calvin memasukkan setiap molekul CO2 dengan menautkannya
pada gula berkarbon 5 yang dinamai ribose bifosfat (RuBP). Enzim yang mengkatalis
langkah ini adalah rubisko. Produknya adalah intermediet berkarbon 6 yang demikian tidak
stabil hinggga terurai separuhnya untuk membentuk 2 molekul 3 fosfogliserat.
Fase 2 :
Reduksi, setiap molekul3-fosfogliserat menerima gugus fosfat baru. Suatau enzim
mentransfer gugus fosfat dari ATP membentuk 1,3-bifosfogliserat sebagai produknya.
Selanjutnya sepasang electron disumbangkan oleh NADPH untuk mereduksi 1,3
bifosfoglisera.

B. Morfologi Tanaman Kelembak


Kelembak merupakan tumbuhan semak, tahunan, dan mempunyai tinggi 25-80 cm.
Batangnya pendek, terdapat di dalam tanah, beralur melintang,masif, coklat. Daunnya
tunggal, bulat telur, pangkal bentuk jantung dan berbulu, ujung runcing, tepi rata, bertangkai
10-40 cm, pangkal tangkai daun memeluk batang, panjang 10-35 cm, lebar 8-30 cm, hijau.
Bunganya majemuk, berkelamin dua atau satu,bergabung menjadi malai yang bercabang,
mahkota enam helai tersusun dalam lingkaran, benang sari sembilan.

77
C. Manfaat Tanaman Klembak
Mengobati konstipasi, jaundice, amenorea, akar kelembak menjadi komponen dalam
rokok klembak menyan yang populer di kalangan masyarakat menengah ke bawah di DIY
dan jateng kelembak juga dijadikan campuran dalam pembuatan jamu. Khasiat obatnya
adalah sebagai laksatif penenang. Mengobati sembelit (konstipasi) dan membantu mengatasi
penggumpalan darah dan nanah serta Pengobatan hepatitis B (Depkes, 2010).
Masing-masing manfaat terperinci tiap bagiannya adalah sebagai berikut; Batangnya
dapat mengobati malaria, sariawan dan batuk, Akarnya mengandung glikosida adstringent
yang berkelakuan sebagai zat penyamak. Pada akarnya pula mengandung antrkuinon yang
berefek purgative,dan tannin yang berefek melawan astringen atau dapat disebut sebagai
adstringent,tapi dalam jumlah kecil efek astringen juga dibutuhkan,tapi jika terlalu banyak
maka dapat menimbulkan efek laksatif (Depkes, 2010).

D. Senyawa Antrakinon

Senyawa antrakinon adalah glikosida yang aglikonnya sekerabat dengan antrasena


yang memiliki gugus karbonil pada kedua atom C yang berseberangan (atom C9 dan C10)
atau hanya C9 (antron) dan C9 ada gugus hidroksil (antranol). Zatini berkhasiat sebagai
laksativum. Dialam, terdapat sekitar 40 turunan antrakuinon yang berbeda. Umumnya
antrakinon ditemukan pada Lichenes dan Fungi tertentu.
Glikosida antrakinon bersifat mudah terhidrolisis seperti glikosida lainnya. Glikosida
ini jika terhidrolisis menghasilkan aglikon di-, tri-, atau tetra hidroksi antrakuinon atau
modifikasinya sedangkan bagian gulanya tidak menentu. Contohnya jika frangulin
dihidrolisis maka akan mengasilkan emodin (1,6,8-trihidroksi-3-metil antrakuinon) dan
rhamnosa. Antrakuinon bebas hanya memiliki sedikit aktivitas terapeutik. Residu gula
memfasilitasi absorpsi dan translokasi aglikon pada situs kerjanya.
Turunan antrakuinon umumnya berwarna merah oranye dan dapat dilihat langsung
serta terdapat dalam bahan-bahan purgativum (laksativum atau pencahar). Turunan

78
antrakuinon berbentuk dihidroksi fenol seperti kriso fanol, berbentuk trihidroksi fenol seperti
emodin, atau tetrahidroksi fenol seperti asam karminat. Seringkali terdapat gugus-gugus lain
seperti metil dalam kriso fanol, hidroksi metil pada aloe-emodin, serta karboksil dalam resin
dan asam karminat.
E. Identifikasi Senyawa Antrakinon
Semua antrakinon memberikan warna reaksi yang khas dengan reaksi Borntraeger
jika Amonia ditambahkan: larutan berubah menjadi merah untuk antrakinon dan kuning
untuk antron dan diantron. Antron adalah bentuk kurang teroksigenasi dari antrakinon,
sedangkan diantron terbentuk dari 2 unit antron. Antrakinon yang mengandung gugus
karboksilat (rein) dapat diekstraksi dengan penambahan basa, misalnya dengan natrium
bikarbonat.
Hasil reduksi antrakinon adalah antron dan antranol, terdapat bebas di alam atau
sebagai glikosida. Antron bewarna kuning pucat, tidak menunjukkan fluoresensi dan tidak
larut dalam alkali, sedangkan isomernya, yaitu antranol bewarna kuning kecoklatan dan
dengan alkali membentuk larutan berpendar (berfluoresensi) kuat. Oksantron merupakan zat
antara (intermediate) antara antrakinon dan antranol. Reaksi Borntraeger modifikasi
Fairbairn, yaitu dengan menambahkan hidrogen peroksida akan menujukkan reaksi positif.

F. Identifikasi Senyawa
Reaksi Warna
1. Uji Borntrager
1) Ekstrak sebanyak 0,3 gram diekstraksi dengan 10 ml aquadest, saring, lalu filtrat
diekstraksi dengan 5 ml toluena dalam corong pisah
2) Ekstraksi dilakukan sebanyak dua kali. Kemudian fase toluena dikumpulkan dan
dibagi menjadi dua bagian, disebut sebagai larutan VA dan VB
3) Larutan VA sebagai blanko, larutan VB ditambah amonia pekat 1 ml dan dikocok
4) Timbulnya warna merah menunjukkan adanya senyawa antrakinon
2. Uji Modifikasi Borntrager
1) Ekstrak sebanyak 0,3 gram ditambah dengan 5 ml KOH 0,5N dan 1 ml H2O2
encer
2) Dipanaskan selama 5 menit dan disaring, filtrat ditambah asam asetat glasial,
kemudian diekstraksi dengan 5 ml toluena
3) Fase toluena diambil dan dibagi menjadi dua sebagian larutan VIA dan VIB

79
4) Larutan VIA sebagai blanko, larutan VIB ditambah amonia pekat 1 ml.
Timbulnya warna merah atau merah muda pada lapisan alkalis menunjukkan
adanya antrakinon

Kromatografi Lapis Tipis


1. Sampel ditotolkan pada fase diam. Uji kromatografi lapis tipis ini menggunakan:
Fase diam : Kiesel Gel 254
Fase gerak : toluena etil asetat-asam asetat glasial (75:24:1)
Penampak noda : Larutan KOH 10% dalam metanol
2. Timbulnya noda berwarna kuning, kuning coklat, merah ungu atau hijau ungu
menunjukkan adanya senyawa antrakinon.

G. Pemisahan KLT
Thin Layer Chromatography (TLC)
Kromatografi lapis tipis adalah salah satu contoh kromatografi planar. Fase diamnya
(Stationary Phase) berbentuk lapisan tipis yang melekat pada gelas/kaca, plastik, aluminium.
Sedangkan fase geraknya (Mobile Phase) berupa cairan atau campuran cairan, biasanya
pelarut organi dan kadangkadang juga air. Fase diam yang berupa lapisan tipis ini dapat
dibuat dengan membentangkan /meratakan fase diam (adsorben=penjerap=sorben) diatas
plat/lempeng kaca plastik ataupun aluminium.Digunakan untuk pemisahan zat secara cepat
dengan menggunakan zat penyerap berupa serbuk halus yang dilapiskan serba rat pada
lempeng kaca. Lempeng yang dilapis dapat dianggap sebagai kolom kromatografi terbuka
dan pemisahan didasarkan pada penyerapan pembagian atau gabungannya tergantung dari zat
penyerap pembagian atau gabungannya tergantung dari jenis zat penyerap dan cara
pembuatan lapisan zat penyerap dan jenis zat pelarut. KLT dengan penyerap penukar ion
dapat digunakan untuk pemisahan senyawa polar.

Fase diam
Sifat fase diam yang satu dengan fase diam yang lain berbeda karena strukturnya,
ukurannya, kemurniannya, zat tambahan sebagai pengikat dll. Fasa diam yang digunakan
TLC tidak sama dengan yang digunakan untuk kromatografi kolom, terutama karena ukuran
dan zat yang ditambahkan. Fase diam dijual dengan spesifikasi tertentu, iaitu ukuran
(diameter) dalam mesh atau j^m dan untuk kegunaannya (mis: untuk TLC atau kromatografi
kolom). Beberapa fase diam yang banyak dijual dipasaran.

80
Silika gel
Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam
perdagangan dijual dengan variasi ukuran (diameter) 10-40m. Makin kecil diameter akan
makin lambat kecepatan alir fase geraknya dengan demikian mempengaruhi kualitas
pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi dari 300-1000 m2/g. Bersifat higroskopis,
pada kelembaban relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%. Macam-macam silka gel yang
dijual dipasaran, Silika gel dengan pengikat. Pada umumnya digunakan pengikat gypsum,
(CaSO4 5-15%). Jenis ini diberi nama Silika gel G. Ada juga menggunakan pengikat pati
(starch) dan dikenal Silika gel S, penggunaan pati sebagai pengikat mengganggu penggunaan
asam sulfat sebagai pereaksi penentuan bercak.Silika gel dengan pengikat dan indicator
flouresensi. Jenis silica gel ini sama seperti silika gel diatas dengan tambahan zat
berfluoresensi bila diperiksa dibawah lampu UV A, panjang atau pendek. Sebagai indicator
digunakan timah kadmium sulfida atau mangan-timah silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF
atau Silika gel GF254 (berflouresensi pada 254 , nm). Silika gel tanpa pengikat, dikenal
dengan nama Silika gel H atau Silika gel N. Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indicator
flouresensi. Silika gel untuk keperluan pemisahan preparatif.

Fase gerak
Yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik. Dapat digunakan
satu macam pelarut organic saja ataupun campuran. Bilamana fase gerak merupakan
campuran pelarut organik dengan air maka mekanisme pemisahan adalah partisi. Pemilihan
pelarut organic ini sangat penting karena akan menentukan keberhasilan pemisahan.
Pendekatanpolaritas adalah yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut. Senyawa polar akan
lebih mudah terelusi oleh fase gerak yang bersifat polar dari pada fase gerak yang non polar.
Sebaliknya, senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh fase gerak non polar dari pada fase
gerak yang polar.

Pembuatan plat (lempeng) silica gel


30 Gram fase diam berbentuk serbuk (dengan diameter tertentu dijual dengan merk
dagang tertentu misalnya Silica gel GF 254) dibuat bubur dengan air atau pelarut lain
sejumlah tertentu (lihat tabel 2) diratakan diatas 4-5 lempeng kaca ukuran 20X20 cm, dalam
waktu tidak lebih dari 4 menit. Perataan ini dapat menggunakan alat perata Stahl-Desaga
untuk plat kaca ukuran 20X20 cm, 20X10 cm dengan ketebalan dapat diatur 0,25-2,0 mm.
Bila ukuran plat lebih kecil dapat dibuat dengan mencelupkan ke dalam bubur adsorbent.

81
Setelah lapisan bubur ini mengering diruangan kemudian dipanaskan di dalam oven pada
100-120C selama 60 menit, dengan tujuan semua air akan menguap. Proses pengeringan
atau penghilangan air disebut proses mengaktifkan plat kromatografi (fase diam), selanjutnya
didalam rak penyimpan plat-plat ini dimasukkan kedalam dexicator. Sehingga pada waktu
penyimpanan plat-plat tadi tidak menyerap lembab (air) dari udara. Dengan demikian
mekanisme pemisahan komponen (senyawa-senyawa) yang ditahan fase diam adalah
mekanisme absorption.

Penyiapan dan penotolan sampel


Sampel atau cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai (hampir pelarut organik
dapat digunakan dan biasanya dipilih yang mudah menguap), air digunakan hanya bila tidak
dapat dicari pelarut organik yang sesuai. Untuk keperluan analisis kuantitatif sample harus
ditimbang demikian juga pelarut yang digunakan. Kemudian larutan sample disimpan dalam
wadah yang tertutup rapat untuk menghindari penguapan. Pada umumnya ditotolkan 1-20 l
larutan yang mengandung 50-100 g sample tiap bercak untuk kromatografi absorbsi dan 5-
2Qg sample untuk kromatografi partisi. Penotolan dapat dilakukan dengan gelas kapiler
yang dibuat sendiri atau dengan pipet mikro. Untuk keperluan kuantitatif digunakan
quantitative microsyringe. Kepada plat TLC konvensional (20X20 cm, 5X20 cm, tebal 0,2
mm) sample ditotolkan sebagai bercak

Tinjauan Eluen
Fase gerak merupakan medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa pelarut.
Fase gerak bergerak dalam fase diam karena adanya gaya kapiler. Pelarut yang digunakan
sebagai fase gerak hanyalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila diperlukan system
pelarut mltikomponen ini harus berupa suatu campuran yang sesederhana mungkin yang
terdiri atas maksimum 3 komponen. Angka banding campuran dinyatakan dalam bagian
volume total 10 (Nyiredy, 2002). Pelarut pengembang dikelompokkan ke beberapa golongan
Snyders berdasarkan kekuatan pelrutnya. Menurut Stahl (1985) eluen atau fase gerak yang
digunakan dalam KLT dikelompokkan ke dalam 2 kelompok, yaitu untuk pemisahan
senyawa hidrofil dan lipofil. Eluen untuk pemisahan senyawa hidrofil meliputi air, methanol,
asam asetat, etanol, isopropanol, aseton, n-propanol, tert-butanol, fenol, n-butanol, sedangkan
untuk pemisahan senyawa lipofil meliputi etil asetat, eter, kloroform, benzene, toluene,
sikloheksana, dan petroleum eter.

82
1. Kloroform
a. Sifat fisis (Ketta & Cunningham, 1992)
Rumus molekul : CHCl3
Berat molekul : 119,39 g/gmol
Wujud : cairan bening
Titik didih : 61,20C
Titik leleh : -63,50C
Densitas : 1,489 g/cm3, 32oC
Suhu kritis : 264oC
Specific gravity :1,489
Viskositas : 0,57 cP (20oC)
Kapasitas panas : 0,234 kal/goC, pada 20oC
Tekanan kritis : 53,8 atm
Volume kritis : 0,239 m3/kmol
Tegangan permukaan : 0,0267 N/m, 25C
Kapasitas panas : 113,666 kJ/kmol.K, 25C
Panas penguapan : 29,5 kJ/mol, 61,2C
Energi Gibbs : -18,663 kkal/mol
Entalpi pembentukan : -32,12 kkal/mol
Kelarutan dalam 100 ml bagian air : 0,8 g (250C)
b. Sifat kimia
Kloroform jika bereaksi dengan udara atau cahaya seara perlahan-lahan akan
teroksidasi menjadi senyawa beracun phosgene (karbonil klorida).
Reaksi :
udara atau cahaya
CHCl3 + O2 COCl2 + HCl
Kloroform dapat direduksi dengan bantuan zeng dan asam klorida untuk
membentuk metilen klorida. Jika proses reduksi dilakukan dengan bantuan debu
sebg dan air akan dapat diperoleh metana.
Reaksi :
Zn
CHCl3 + 2H COCl2 + HCl
HCl
Zn
CHCl3 + 6H CH4 + 3 HCl
H2O

83
Kloroform dapat bereaksi dengan asam nitrat pekat untuk membentuk nitro
kloroform atau kloropikrin.
Reaksi :
CHCl3 + HNO3 CCl2NO2 + H2O
Kloropikrin biasanya digunakan sebagai insektisida.
Kloroform dapat mengalami proses klorinasi dengan klorin jika terkena sinar
matahari dan mengahsilkan karbon tetraklorida.
Reaksi :
CHCl3 + Cl2 CCl4 + HCl
(Kirk and Othmer, 1982)

2. Aseton
c. Sifat-sifat fisika
Rumus molekul : CH3COCH3
Berat molekul : 58,080 kg/kmol
Densitas : 785,601 kg/m3, 25C
Viskositas : 0,32 cP, 20C
Titik didih : 56,29C
Titik leleh : -94,6C
Temperatur kritis : 235,05C
Tekanan kritis : 4.701 kPa
Volume kritis : 0,209 m3/kmol
Tegangan permukaan : 0,0230 N/m, 25C
Kapasitas panas : 126,281 kJ/kmol.K, 25C
Panas penguapan : 29,1 kJ/mol
Entalpi penguapan : 30,836 kJ/mol
Energi Gibbs : -36,47 kkal/mol
Entalpi pembentukan : -59,33 (cair) kkal/mol
Kelarutan (dalam air) : larut dalam berbagai rasio

d. Sifat-sifat kimia
Dengan air akan membentuk suatu 1,1-diol yang disebut gem-diol atau hidrat.
Reaksi ini bolak-balik dan biasanya kesetimbangan terletak pada sisi karbonil.

84
Reaksi :

Dengan hidrogen sianida dalam kondisi sedikit basa (aseton hidrat) akan
membentuk sianohidrin aseton.
Reaksi :

Dengan amonia dan amina primer akan membentuk imina, suatu senyawa yang
mengandung gugusan C = N. Reaksi ini dapat berjalan dengan baik pada
keadaan asam, dimana pH optimum 3-4.
Reaksi :

Dengan amina sekunder (R2NH akan menghasilkan ion iminium yang bereaksi
lebih lanjut menjadi enamina (vinilamina).
Reaksi :

3. Asam formiat
V. Sifat fisika
Rumus molekul : HCOOH
Berat molekul : 46,03 g/mol
Densitas : 785,601 kg/m3, 25C
Viskositas : 1,57 cP, 25C

85
Titik didih : 100,8C (760 mmHg)
Titik leleh : 8,4C
Spesifik gravity : 1,22647, 20C
Tegangan permukaan : 37,67 dyne/cm, 22C
Kapasitas panas : 82,8 joulel/mol.K, 0C
Panas pembentukan : 3031 kal/mol
Panas penguapan : 104 kal/mol
Panas pembakaran cairan : 60,9 kkal/mol, pada 25C
Panas pembentukan cairan : 101,52 kkal/mol, pada 25C
VI. Sifat kimia
Asam formiat dapat bercampur sempurna dengan air dan sedikit larut dalam
benzene, karbon tetra klorida, toluene dan tidak larut dalam hidrokarbon alifatik
seperti heptana dan oktana.
Asam formiat dapat melarutkan nilon, poliamida tetapi tidak melarutkan Poli
Vinil Chlorida (PVC).
Campuran Asam formiat dan air membentuk campuran azeotrop (yaitu
campuran larutan yang mempunyai titik didih mendekati titik beku) dengan
kandungan maksimum Asam formiat 77,5 % pada tekanan atmosfer.
Asam formiat akan terdekomposisi menjadi Karbon dioksida dan air pada
temperatur 100 oC atau dalam temperatur kamar bila ditambahkan katalis
Palladium.
Asam formiat terhidrasi oleh Asam sulfat pekat dan menghasilkan Karbon
monoksida dan air.
Tinjauan Indeks Polaritas
Pelarut Indeks Polaritas
Pentana 0
1,1,2-trikorotrifluoroetana 0
Siklopentana 0,1
Heptane 0,1
Heksana 0,1
Iso oktana 0,1
Petroleum eter 0,1
Sikloheksana 0,2

86
N-butilklorida 1,0
Toluene 2,4
Metal t-butil eter 2,5
O-xylene 2,5
Klorobenzena 2,7
O-diklorobenzena 2,7
Etil eter 2,8
Diklorometana 3,1
Etilen diklorida 3,5
N-butil alcohol 3,9
Isopropyl alcohol 3,9
N-butil asetat 4,0
Isobutil alcohol 4,0
Metal isoamil keton 4,0
N-propoil alcohol 4,0
Tetrahidrofuran 4,0
Kloroform 4,1
Metal isobutyl keton 4,2
Etil asetat 4,4
Metal n-propil keton 4,5
Metal etil keton 4,7
1,4-dioxana 4,8
Aseton 5,1
Methanol 5,1
Piridin 5,3
2-metoksietanol 5,5
Aseetonitrit 5,8
Propilen karbonat 6,1
N-n dimetilformamida 6,4
Dimetil asetamida 6,5
N-metilpirolidin 6,7
dimetilsulfoksida 7,2

87
III. BAGAN ALIR

A. Reaksi warna
1. Uji Borntrager

Ekstrak sebanyak 0,3 gram diekstraksi dengan 10 ml aquadest,saring,lalu filtrat


diekstraksi dengan 5 ml toluena dalam corong pisah.

Ekstraksi dilakukan sebanyak dua kali. Kemudian fase toluena dikumpulkan dan di
bagi menjadi bagian, di sebut sebagai larutan VA dan VB

Larutan VA sebagai blanko, larutan VB ditambah amonia pekat 1 ml dan dikocok.

Timbulnya warna merah menunjukan adanya senyawa antrakinon.

2. Uji modifikasi Borntrager

Ekstrak sebanyak 0,3 gram ditambah dengan 5 ml KOH 0,5N dan 1 ml H2O2 encer.

Dipanaskan selama 5 menit dan disaring , filtrat ditambah asam asetat glasial,
kemudian diekstraksi dengan 5 ml toluena.

Fase toluena diambil dan dibagi menjadi dua sebagai larutan VIA VIB

Larutan VIA sebagai blanko, larutan VIB ditambah amonia pekat 1ml. Timbulnya
warna merah atau merah muda pada lapisan alkalis menunjukan adanya antrakinon
88
B. Kromatografi Lapis Tipis

Sampel ditotolkan pada fase diam. Uji kromatografi lapis tipis ini menggunakan :

Fase diam : kiesel Gel 254

Fase gerak : toluena-etil asetat-asam asetat glasial ( 75:24:1)

Penampak noda : larutan KOH 10% dalam metanol

Timbulnya noda berwarna kuning,kuning coklat,merah ungu atau hijau ungu


menunjukan adanya senyawa antrakinon.

89
IV. SKEMA KERJA

A. Reaksi Warna
1. Uji Borntrager

Filtrat diektraksi Fase toluene


dengan toluene dibagi menjadi
sebanyak 2 kali 2 bagian
Ekstrak 0,3 g
diekstraksi
dgn 10 ml
Larutan VA
aquadest

Larutan VB

Lar. VB ditambah Timbul warna merah


1ml ammonia pekat menunjukkan adanya
1 ml, dikocok. senyawa antrakinon.
Blanko

2. Uji Modifikasi Borntrager

Filtrate +
Panaskan asam
selama 5 asetat
Ekstrak 0,3 g
menit di glasial
+ 5 ml KOH
atas
+ 1 ml H2O2
waterbath
encer
Ekstraksi
Fase toluene dengan 5
Larutan VIA
dibagi ml
menjadi 2 toluena
bagian
Larutan VIB

Timbul warna merah


Larutan VIA
atau merah muda pada
sebagai blanko
lapisan alkalis
Larutan VIB + 1 menunjukkan senyawa
ml ammonia antrakinon.
pekat

90
B. Kromatografi Lapis Tipis

Sampel Totolkan pada


+ fase diam
etanol menggunakan Fase
pipet kapiler diam
Silica
gel

Setelah dieluasi,
disemprot
penampak noda
larutan KOH 10%
Fase diam dieluasi
dan methanol. dengan eluen = toluene :
etil asetat : asam asetat
glacial (75:24:1)

Timbul noda berwarna kuning, kuning


coklat, merah ungu atau hijau ungu
menunjukkan adanya senyawa
antrakinon.

91
V. HASIL
a. Reaksi Warna
1. Uji Borntrager
Mengekstraksi ekstrak sebanyak 0,3 gram dalam 10 ml aquadest saring, lalu filtrat
diekstraksi dengan 5 ml toluena dalam corong pisah. Ekstraksi dilakukan
sebanyak dua kali(bagian yang bening dipisahkan terlebih dahulu pada tebung
reaksi yang berbeda, baru ditambahkan 5ml toluena lagi). Kemudian fase toluena
dikumpulkan dan di bagi menjadi dua bagian, disebut sebagai larutan VA dan VB.
Larutan VA sebagai blanko, larutan VB ditambah amonia pekat 1 ml dan dikocok.
Jika Timbul warna merah menunjukan adanya senyawa antrakinon dan hasil
kelompok kami menunjukkan adanya senyawa antrakinon dengan ditandai
berubahnya larutan berwarna merah pada lapisan bawah tabung.

2. Uji Modifikasi Borntrager


Mengekstraksi 0,3 gram ekstrak kelembak ditambah dengan 5 ml KOH 0,5N dan
1 ml H2O2 encer. Dipanaskan selama 5 menit dan disaring, filtrat ditambah asam
asetat glasial, kemudian diekstraksi dengan 5 ml toluena. Kemudian Fase toluena
diambil dan dibagi menjadi dua sebagai larutan VIA dan VIB. Larutan VIA
sebagai blanko, larutan VIB ditambah amonia pekat 1ml. Timbulnya warna merah
atau merah muda pada lapisan alkalis menunjukan adanya antrakinon dan hasil
kelompok kami menunjukkan adanya antrakinon dengan berubahnya larutan
menjadi merah muda pada lapisan bawah tabung.

92
b. Pemisahan dengan Kromatografi Lapis Tipis
Ekstrak dilarutkan dengan etanol ad tepat larut, kemudian setelah larut baru ditotolkan
pada plat klt dan diamati dibawah sinar UV 254 untuk mengetahui pekat atau
tidaknya, kelompok kami menotolkan sebanyak 6 totolan atau 2 kapiler baru
didapatkan hasil yang pekat pada plat KLT. Lalu dieluasi pada chamber dan
dikeringkan dilemari asam diamati dibawah sinar UV 254 dan 365. Kemudian diberi
penampak noda larutan KOH 10% dalam metanol, dikeringkan dilemari asam dan
diamati pada sinar UV 365.
Sebelum dieluasi Setelah dieluasi
Sinar UV 254 Sinar UV 254 Sinar UV 365

Setelah Pemberian Penampak noda Larutan KOH 10% dalam metanol.


Tampak secara Visual Sinar UV 365

93
VI. PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini yaitu identifikasi senyawa golongan antrakinon (ekstrak
Rheum officinale L). Tahap pertama yaitu reaksi warna dimana pada reaksi warna ada dua
pengujian yaitu uji borntrager dan uji modifikasi borntrager. Uji borntrager yaitu dengan
mengekstraksi ekstrak sebanyak 0,3 gram dalam 10 ml aquadest saring,lalu filtrat diekstraksi
dengan 5 ml toluena dalam corong pisah. Ekstraksi dilakukan sebanyak dua kali(bagian yang
bening dipisahkan terlebih dahulu pada tebung reaksi yang berbeda, baru ditambahkan 5ml
toluena lagi). Kemudian fase toluena dikumpulkan dan di bagi menjadi dua bagian, disebut
sebagai larutan VA dan VB. Larutan VA sebagai blanko, larutan VB ditambah amonia pekat
1 ml dan dikocok. Jika Timbul warna merah menunjukan adanya senyawa antrakinon dan
hasil kelompok kami menunjukkan adanya senyawa antrakinon dengan ditandai berubahnya
larutan berwarna merah pada lapisan bawah tabung. Uji modifikasi borntrager yaitu dengan
mengekstraksi 0,3 gram ekstrak kelembak ditambah dengan 5 ml KOH 0,5N dan 1 ml H2O2
encer. Dipanaskan selama 5 menit dan disaring, filtrat ditambah asam asetat glasial,
kemudian diekstraksi dengan 5 ml toluena. Kemudian Fase toluena diambil dan dibagi
menjadi dua sebagai larutan VIA dan VIB. Larutan VIA sebagai blanko, larutan VIB
ditambah amonia pekat 1ml. Timbulnya warna merah atau merah muda pada lapisan alkalis
menunjukan adanya antrakinon dan hasil kelompok kami menunjukkan adanya antrakinon
dengan berubahnya larutan menjadi merah muda pada lapisan bawah tabung.

Tahap kedua yaitu pemisahan dengan kromatografi lapis tipis dimana sedikit ekstrak
dilarutkan dalam etanol sampai tepat larut. Setelah larut maka ditotolkan pada plat klt dengan
fase diam Kiesel Gel 254 dan fase geraknya toluena-etil asetat-asam asetat glasial (75:24:1).
Setelah ditotolkan kemudian diamati dibawah sinar UV 254 dan apabila totolan sudah pekat
maka dieluasi pada chamber, kelompok kami menotolkan sebanyak 6 totolan atau 2 kapiler
dan sudah terlihat pekat pada saat diamati pada sinar UV 254. Kemudian dieluasi, tapi
kelompok kami melakukan kesalahan dengan salah penotolan, tapi itu tidak berpengaruh
pada hasil karena jarak antara batas atas dan batas bawah tetap yaitu 8 cm. Kemudian setelah
dieluasi dikeringkan dahulu dilemari asam dan diamati dibawah sinar UV 254 dan 365, lalu
diberi penampak noda larutan KOH 10% dalam metanol dan dikeringkan dilemari asam.
Amati dibawah sinar UV 365 dan difoto, noda yang dihasilkan pada plat KLT yaitu sebanyak
6 noda dimana noda pertama memiliki nilai Rf ( 1,8/8 = 0,225 cm ) dengan noda warna hijau
ungu, noda kedua memiliki nilai Rf ( 2,7/8 = 0,338 cm ) dengan noda warna kuning cokelat,
noda ketiga memiliki nilai Rf ( 3,8/ 8 = 0,475 cm ) dengan noda warna merah ungu / pink,

94
noda keempat memiliki nilai Rf ( 4,8/8 = 0,6 cm ) dengan noda warna merah ungu / pink,
noda kelima memiliki nilai Rf ( 6,4/8 = 0,8 cm ) dengan noda warna ungu dan noda kelima
memiliki nilai Rf ( 6,9/8 = 0,863 cm ) dengan noda warna ungu. Jika timbul noda warna
kunig, kuning cokelat, merah ungu, hijau ungu menunjukkan adanya senyawa antrakinon.
Jadi dari keempat noda warna yang dihasilkan pada kelompok kami yaitu noda warna hijau
ungu, kuning cokelat, merah ungu/pink dan ungu berarti bahwa pada ekstrak kelembak
dengan pemisahan KLT menunjukka adanya senyawa antrakinon.

Dari semua uji yang dilakukan, baik reaksi warna dengan uji borntrager menghasilkan
warna merah pada dasar tabung reaksi sehingga dismpulkan bahwa ekstrak kelembak positif
mengandung senyawa antrakinon dan modifikasi borntrager menghasilkan warna merah
muda pada dasar tabung reaksi sehingga dismpulkan bahwa ekstrak kelembak positif
mengandung senyawa antrakinon. Dengan pemisahan KLT, juga didapatkan hasil positif
mengandung senyawa antrakinon dengan ditunjukkan adanya noda pada plat berwarna hijau
ungu, kuning cokleat, merah ungu/pink dan ungu.

95
BAB 6. UJI KLT DENGAN BERBAGAI ELUEN

I. TUJUAN
Mahasiswa mampu menjelaskan tentang kaitan antara polaritas eluen dengan harga Rf

II. TINJAUAN PUSTAKA


a. Kolesterol
Kolesterol ada dalam diet semua orang, kolesterol merupakan lipid berwarna
kekuningan dan berupa seperti lilin yang diproduksi oleh tubuh kita, terutama di dalam hati.
Kolesterol merupakan zat antara yang diperlukan dalam biosintesis hormon steroid.
Kolesterol memiliki 2 gugus metil yang terikat pada rantai C-13 dan C-10 dengan 5 ikatan
rangkap. Rantai cabang hidrokarbon terikat pada atom C-17, sedangkan gugus hidroksil
terdapat pada atom C-3. Kolesterol sangat larut dalam lemak tetapi hanya sedikit larut dalam
air. Kolesterol secara spesifik mampu membentuk ester dengan asam lemak. Hampir 70%
kolesterol dalam lipoprotein plasma memang dalam bentuk ester kolesterol (Guyton, 2007)

Gambar VI.2.1 Struktur molekul kolesterol

Kolesterol merupakan bahan perantara pembentuk sejumlah komponen penting


seperti vitamin D (untuk membentuk tulang), hormon seks (estrogen dan testosteron) dan
asam empedu (untuk pencernaan). Kolesterol merupakan sterol yang terdapat di dalam semua
jaringan hewan dan manusia, baik dalam bentuk kolesterol maupun terikat sebagai ester
kolesterol dan dinyatakan sebagai 3-hidroksi-5,6 kolesten (Wirahadikusuma, 1985)
Kolesterol dalam tubuh mempunyai fungsi yang penting, diantaranya adalah
a. Sebagai pelindung otak, 11 % dari berat otak adalah kolesterol.
b. Bersama zat gizi lainnya kolesterol dan sinar matahari membentuk vitamin D.
c. Zat esensial untuk membran sel.
d. Bahan pokok untuk pembuatan garam empedu yang diperlukan untuk pencernaan
makanan.

96
e. Bahan baku pembentukan hormon steroid, misalnya progesterone dan estrogen pada
wanita, testosteron pada laki-laki.
f. Untuk mencegah penguapan air pada kulit
g. Membawa lemak keseluruh tubuh melalui peredaran darah.

Penyimpanan kolesterol Secara umum sampel dimana kolesterol diperiksa seharusnya


tidak dibekukan, siklus beku cair akan merusak struktur lipoprotein dan menurunkan resolusi
lipoprotein. Pemeriksaan kolesterol sebaiknya dianalisa segera. Metode pemeriksaan
kolesterol adalah dengan Metode Lieberman Burchad yang mempunyai prinsip kolesterol
dengan asam asetat anhidrida dan asam sulfat pekat membentuk warna hijau kecoklatan.
Absorben warna ini sebanding dengan kolestrol dalam sampel. Metode kolorimetri langsung
dengan reagen Lieberman Burchad penyerapan chromaphores yang dihasilkan dari
kolesterol dan ester kolestrol berbeda. Ester kolesterol menghasilkan warna yang lebih
benyak dibandingkan dengan kolesterol non ester dan mempunyai bias 10 15 % ketika
analisa dilakukan berdasarkan standart kolesterol non ester. Metode ini memerlukan kerja
keras disebabkan karena ester kolesterol harus dihidrolisa dan kolestrol diekstraksi. Tujuan
ekstrsksi ini mencegah adanya zat-zat pengganggu yang akan mempengaruhi hasil,
contohnya hemoglobin dan billirubi.

b. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)


Kromatografi Lapis Tipis adalah suatu metode pemisahan fitokimia dari campuran zat
dengan menggunakan sebuah lapisan tipis bahan penjerap. Campuran zat yang akan
dipisahkan berupa larutan dan ditotolkan berupa titik atau pita, setelah itu lempeng diletakkan
di dalam bejana tertutup rapat yang berisi cairan eluasi atau fase gerak yang cocok.
Pemisahan dikatakan berhasil jika zat dapat berpisah satu dengan yang lainnya sepanjang
lapisan bahan penjerap (lempeng) berupa bercak, selanjutnya senyawa yang tidak berwarna
harus ditampakkan dengan pereaksi warna yang cocok.
Ada beberapa komponen penting dalam kromatografi lapis tipis, yaitu:
1. Fase diam (fase stasioner)
Bahan penjerap disebut juga fase diam, fase stasioner, atau fase tidak bergerak sebab
fase ini diletakkan diam selama proses pemisahan. Bahan penjerap atau fase diam terdiri atas
bahan berbutir-butir yang ditempatkan pada penyangga berupa plat gelas, logam atau lapisan
yang cocok.
Fase diam umumnya adalah silica gel, Al oksida, kieselguhr, selulosa, dll. Panjang
lapisan tipis fase diam adalah 200mm atau 100mm. Untuk analisis ketebalannya 0,1-0,3 mm,

97
sebelum digunakan fase diam disimpan dalam lingkungan yang tidak lembab dan bebas uap
laboratorium. Lempeng yang paling banyak digunakan adalah lempeng dengan fase diam
silica gel GF 254 dimana pada sinar UV = 254 nm lempeng akan berfluoresensi dan bercak
berwarna gelap, sedangkan dengan sinar UV = 356 nm lempeng akan berwarna gelap dan
bercak berfluoresensi.
2. Fase gerak (cairan eluasi)
Fase gerak adalah media angkut yang terdiri dari suatu atau beberapa pelarut,
bergerak di dalam fase diam yaitu lapisan berpori, karena adanya gaya kapiler. Pemilihan
fase gerak tergantung pada faktor-faktor antara lain sifat dan kelarutan dari campurannya.
Untuk mendapatkan daya pemisahan yang baik umumnya digunakan campuran dari pelarut
yang mempunyai polaritas yang berbeda, karena daya eluasinya dapat disesuaikan sehingga
berlaku untuk semua jenis senyawa yang terkandung dalam cuplikan.
Persyaratan yang harus dipenuhi pelarut baik pelarut campuran maupun pelarut tunggal, yaitu
mampu menghasilkan pemisahan yang baik, tidak merusak lapisan adsorben yang digunakan,
dan tidak bereaksi dengan senyawa yang dipisahkan. Cairan eluasi biasanya berupa zat
organik yang mudah menguap agar saat proses pemisahan selesai, cairan eluasi dapat segera
menguap dari lempeng. Kromatografi lapis tipis akan mencapai efektivitas pemisahan yang
baik dan waktu pengembangan yang lebih singkat jika menggunakan eluen yang terdiri dari
campuran dua bahan atau lebih.
3. Pereaksi semprot
Lempengan kemudian akan disemprot dengan pereaksi semprot untuk menampakkan
zat yang tidak berwarna. Lempengan yang telah dieluasi kemudian dikeringkan, diamati di
bawah sinar UV , setelah itu disemprot dengan larutan pereaksi. Bila perlu lempengan
dipanaskan pada suhu tertentu, kemudian dilakukan pengamatan.
4. Letak bercak
Letak bercak dinyatakan dengan nilai Rf (Retardaction factor). Nilai Rf didefinisikan
sebagi perbandingan jarak yang ditempuh oleh senyawa pada permukaan fase diam dibagi
dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut sebagai fase gerak. Harga ini merupakan ukuran
kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram. Nilai Rf diperoleh dengan cara:

Nilai Rf sangat karakteristik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Hal tersebut
dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam sampel. Senyawa

98
yang mempunyai Rf yang lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga
sebaliknya. Hal tersebut dikarenakan fase diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan
tertahan kuat pada fase diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah.
Rf KLT yang bagus berkisar antara 0,2-0,8. Jika nilai Rf terlalu tinggi, yang harus
dilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen, dan sebaliknya.
c. Faktor yang Mempengaruhi Hasil Kromatografi Lapis Tipis
Nilai Rf didefinisikan sebagai perbandingan jarak yang ditempuh oleh senyawapada
permukaan fase diam dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut sebagai fase gerak.
Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa
tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan dua sampel yang berbeda di
bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar nila senyawa tersebut kurang
polar dan berinteraksi dengan adsorben polar dari plat kromatografi lapis tipis (Handayani,
2008)
Nilai Rf sangat karakteristik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Hal tersebut
dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam sampel. Senyawa
yang mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga
sebaliknya. Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan
tertahan kuat pada fase diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah. Rf KLT yang
bagus berkisar antara 0,2-0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang harus dilakukan adalah mengurangi
kepolaran eluen, dan sebaliknya. (Ewing Galen Wood, 1985)
Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam KLT yang juga akan
mempengaruhi nilai Rf adalah:
1. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.
2. Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.
Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan mengeringkan
molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap. Perbedaan penyerap
akan memberikan perbedaan yang besar terhadap harga Rf meskipun menggunakan fase
bergerak dan zat terlarut yang sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang
sama, jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap dan jika pengikat
(kalau ada) dicampur hingga homogen.
3. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.
Pada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu
diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi
tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.

99
4. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.
Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam kromatografi
lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan
yang dipakai harus betul-betul diperhatikan.
5. Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.
6. Teknik percobaan.Arah pelarut bergerak di atas plat.
(Metoda aliran penaikan yang hanya diperhatikan, karena cara ini yang paling umum
meskipun teknik aliran penurunan dan mendatar juga digunakan).
7. Jumlah cuplikan yang digunakan.
Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran
noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak kesetimbangan lainnya,
hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf.
8. Suhu.
Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk
mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan
atau perubahan-perubahan fase.
9. Kesetimbangan.
Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam kromatografi
kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut. Suatu
gejala bila atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut
campuran, akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan
fase bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah.
Manfaat dari Kromatografi Lapis Tipis, yaitu :
Pemeriksaan kualitatif dan kemurnian senyawa obat.
Pemeriksaan simplisia hewan dan tanaman.
Pemeriksaan komposisi dan komponen aktif sediaan obat.
Penentuan kualitatif masing-masing senyawa aktif sediaan obat.

Nilai Rf didefinisikan sebagai perbandingan jarak yang ditempuh oleh senyawa pada
permukaan fase diam dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut sebagai fase gerak.
Semakin besar nilai Rf dari sampel, maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa
tersebut pada plat KLT.

Faktor yang mempengaruhi gerak Rf :

100
Sifat penyerap dan derajat aktifitasnya.
Struktur dari senyawa yang dipisahkan .
Kerapatan dari suatu pasang penyerap

d. Fase Gerak (Eluen)


Eluen merupakan fase gerak, pemilihan fase gerak dibedakan atas kelarutan dan
konstanta dielektrik dari pelarut yang digunakan beberapa konstanta dielektrik pelarut yang
ditunjukkan dalam tabel berikut:
1. n-Heksana

Gambar VI.2.2 Struktur kimia n-heksana

n-Heksan (Heksana) merupakan senyawa hidrokarbon alkana dengan rumus kimia


C6H14 (isomer utama n-heksan memiliki rumus CH3(CH2)4CH3). n-heksan memiliki
konstanta dielektrik sebesar 1,89 yang menjadikan n-heksana masuk dalam kategori pelarut
non polar. Seluruh isomer heksana amat tidak reaktif, dan sering digunakan sebagai pelarut
organik yang inert. Dalam keadaan standar senyawa ini merupakan cairan tak berwarna yang
tidak larut dalam air. heksana diproduksi oleh kilang-kilang minyak mentah. n heksan
memiliki kekurangan yaitu mudah terbakar dan biodegradabilitas rendah sehingga beresiko
menimbulkan penyakit dan pencemaran udara.

101
2. Etil Asetat

Gambar VI.2.3 Struktur kimia Etil asetat

Etil asetat adalah senyawa organik dengan rumus empiris C2H5OC(O)CH3. Etil asetat
memilii konstanta dielektrik 6.02. Senyawa ini merupakan ester dari etanol dan asam asetat.
Senyawa ini tidak berwarna, berbentuk cair dan memiliki aroa khas. Etil asetat merupakan
pelarut polar menengah yang volatil (mudah menguap), tidak beracun, dan tidak higroskopis.
Etil asetat merupakan penerima ikatan hidrogen yang lemah, dan bukan merupakan donor
ikatan hidrogen karena tidak adanya proton yang bersifat asam (yaitu hidrogen yang terikat
pada atom elektronegatif seperti flor, oksigen, dan nitrogen). Kelarutannya meningkat pada
suhu yang lebih tinggi. Namun demikian, senyawa ini tidak stabil dalam air yang
mengandung basa atau asam.
Katalis yang digunakan adalah asam sulfat (H2SO4), karena berlangsungnya reaksi.
Reaksi kebalikan hidrolisis yaitu, esterifikasi ficher. Untuk memperoleh hasil rasio yang
tinggi biasanya digunakan asam kuat dengan proposi stoiklometris, misalnya natrium
hidroksida. Reaksi ini menghasilkan etanol dan natrium asetat yang tidak dapat di reaksi lagi
dengan etanol.

102
Sifat fisika dan kimia etil asetat dapat dilihat pada tabel dibawah ini:

Sifat Fisika Sifat Kimia

Berbau Khas Rumus molekul

Titik didih : 77,1 0C Mudah menguap

Densitas : 0,89 gr/cm3 Tidak Beracun

Berat Molekul : 88,12 gr/mol Tidak Higroskopis

Tidak berwarna

Tabel 1. Sifat fisika dan sifat kimia etil asetat

3. Kloroform

Gambar VI.2.5 Struktur kimia Kloroform

Kloroform atau juga dikenal trichloromentana memiliki rumus kimia CHCl3,


merupakan pelarut yang memiliki konstanta dielektrik sebesar 4,81 sehingga kloroform
termasuk ke dalam kategori pelarut non polar. Kloroform berwarna, memiliki bau khas, rasa
manis dan membakar. Meski tidak mudah terbakar, kloroform dapat terurai menjadi produk
yang berbahaya seperti hidrogen klorida dan fosgen. Sifat non-polar dari senyawa kloroform
membuatnya menjadi pelarut yang digunakan untuk melarutkan senyawa non polar lainnya.

103
4. Metanol

Gambar VI.2.6 Struktur kimia Kloroform

Metanol adalah bentuk paling sederhana dari alkohol yang biasanya digunakan
sebagai pelarut di industri. Metanol merupakan pelarut dengan konstanta dielektrik sebesar
32,7 sehingga metanol termasuk ke dalam kategori pelarut polar. Rumus kimia dari metanol
adalah CH3OH dan dikenal dengan nama lain yaitu metil alkohol, metil hidrat, metil karbinol,
wood alkohol atau spiritus. Pada keadaan atmosfer metanol berbentuk cairan yang ringan,
mudah menguap, tidak berwarna, mudah terbakar, dan beracun dengan bau yang khas.

104
e. Polaritas dan Nilai Rf
Ketika memisahkan senyawa melalui kromatografi, sangat penting untuk memilih
pelarut yang besar sebagai fase gerak. Suatu senyawa yang mempunyai nilai lipofilitas tinggi
berarti mudah larut dalam lipid atau pelarut non polar, maka akan mempunyai nilai lipofilitas
tinggi berarti mudah larut dalam lipid atau pelarut non polar, maka akan mempunyai harga Rf
yang rendah. Sedangkan senyawa yang mempunyai lipofilitas rendah berarti senyawa
tersebut tidak mudah larut dalam pelarut non polar, maka Rf akan bernilai tinggi. Fase gerak
yang digunakan dilakukan pemilihan beberapa campuran fase gerak atau eluen dengan
berbagai perbandingan untuk mendapatkan campuran yang optimum.
Polaritas sampel dan laju gerak mempunyai perbandingan terbalik. Semakin tinggi
polaritas senyawa, maka fase diam dari senyawa dengan afinitas yang lebih besar akan
mempunyai nilai Rf yang semakin kecil. Semakin rendah polaritas senyawa semakin tinggi
afinitas untuk pelarut semakin besar nilai Rf. Jika pelarut berubah dari pelarut dengan
polaritas rendah kepolaritas yang lebih tinggi kekuatan eluasi akan meningkat dan akan
meningkatkan semua nilai-nilai Rf. Tempat dengan nilai R tertinggi adalah yang paling polar
dan nilai tempat nilai Rf terendah adalah yang paling polar.
f. Pelarut
Pelarut adalah bahan yang ditambahkan untuk membentuk suatu fase yang berbeda dari
bahan yang dipisahkan.Pelarut menyebabkan pori-pori bahan mengembang sehingga zat yang
berada di dalam bahan berdifusi keluar permukaan partikel bahan.Pemisahan tercapai jika
komponen yang dipisahkan larut dalam pelarut sedangkan komponen yang lainnya masih
tetap berada dalam bahan asalnya.Kelarutan zat dalam pelarut dipengaruhi oleh tingkat
kepolaran pelarutnya. Zat yang polar hanya larut dalam pelarut polar, sedangkan zat nonpolar
hanya larut dalampelarut non polar (Dwiariet. al.,2008).
Terdapat kecenderungan kuat bagi senyawa polar larut dalam pelarut polar atau non-
polar.Berdasarkan sifat kepolarannya, suatu bahan digolongkan menjadi bahan polar dan non
polar. Suatu bahan bersifat polar bercirikan molekulnya mengandung ikatan ganda, gugus
karbonil dan atom elektronegatif sedangkan bahan non polar molekulnya biasanya
mengandung cincin aromatik, gugus lipofilik atau molekulnya tidak mengandung ikatan
ganda, gugus karbonil dan atom elektronegatif (Houghton dan Raman, 1989). Tingkat
polaritas pelarut yaitu seperti tabel dibawah ini :

105
Tabel 1.Indeks Polaritas Pelarut
Pelarut Indeks Polaritas
Pentana 0
1,1,2triklorotrifluoroetana 0
Siklopentana 0,1
Heptana 0,1
Heksana 0,1
Iso oktana 0,1
Petroleum eter 0,1
Sikloheksana 0,2
N-butilklorida 1,0
Toluena 2,4
Metal t-butil eter 2,5
O-xylena 2,5
Klorobenzena 2,7
O-diklorobenzena 2,7
Etil eter 2,8
Diklorometana 3,1
Etilen diklorida 3,5
N butil alkohol 3,9
Isopropil alkohol 3,9
N-butil asetat 4,0
Isobutil alkohol 4,0
Metal isoamil keton 4,0
N-propil alkohol 4,0
Tetrahidrofuran 4,0
Kloroform 4,1
Metal isobutyl keton 4,2
Etil asetat 4,4
Metal n-propil keton 4,5
Metal etil keton 4,7
1,4-dioxina 4,8
Aseton 5,1
Methanol 5,1
Piridin 5,3
2-metoksietanol 5,5
Asetonitrit 5,8
Propilen karbonat 6,1
N-n dimetilformamida 6,4
Dimeil asetamida 6,5
N-metilpirolidon 6,7
Dimetilsulfoksida 7,2

106
g. Prosedur Kerja
1. Larutkan sedikit kolesterol ke dalam kloroform
2. Totolkan pada 4 plat KLT (Kiesel Gel 254)
3. Siapkan 4 macam eluen (fase gerak) yaitu:
n-heksan-etil asetat (1:1)
n-heksan-etil asetat (4:1)
kloroform-metanol (4:1)
kloroform-etil asetat (4:1)
4. Eluasi 4 plat KLT tersebut dengan eluen yang dibuat
5. Semprot dengan penampak noda anisaldehid asam sulfat
6. Panaskan 100 C sampai timbul noda berwarna merah ungu/ungu
7. Hitung harga Rf pada masing-masing plat KLT
8. Diskusikan, mengapa harga Rf masing-masing plat berbeda

107
III. BAGAN ALIR

1. Larutkan sedikit kolesterol ke dalam kloform

2. Totolkan pada 4 plat KLT (Kiesel Gel 254)

3. Siapkan 4 macam eluen (fase gerak) yaitu :

n- Heksan-etil asetat (1:1)

n-Heksan-etil asetat (4:1)

Kloroform-metanol (4:1)

Kloroform-etil asetat (4:1)

4. Eluasi 4 plat KLT tersebut dengan eluen yang dibuat.

5. Semprot dengan penampak noda anisalsehid asam sulfat.

6. Panaskan 1000C sampai timbul noda berwarna merah ungu/ungu.

7. Hitung harga Rf pada masing-masing plat KLT.

8. Diskusikan, mengapa harga Rf pada masing-masing plat berbeda.

108
IV. SKEMA KERJA

0,3 gram kolesterol


di larutkan sedikit kloroform
Totolkan pada 4 plat KLT

Plat KLT A Plat KLT B Plat KLT C Plat KLT D

n-Heksana EA n-Heksana EA Kloroform- Kloroform-EA


(1 : 1) (4: 1) Metanol (4 : 1)
(4 : 1)

Eluasi 4 Plat KLT tersebut dengan eluen yang dibuat

Plat yang sudat di eluasi disemprot


dg penampak noda anisaldehid
sulfat.
Panaskan 1000C sampai timbul
noda berwarna merah ungu/ungu.
Hitung Rf pada masing-masing plat
Diskusikan nilai Rf yang didapat.

109
V. PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini yaitu Uji KLT dengan berbagai macam eluen dengan melarutkan
kolesterol dalam kloroform, dimana kolesterol merupakan zat antara yang diperlukan dalam
biosintesis hormon steroid. Sedangkan golongan triterpenoid dan steroid akan memberikan
hasil yang kuat jika eluen yang digunakan yaitu metanol, etil asetat , kloroform dan air
sedangkan untuk ekstrak n-heksan hanya memberikan hasil yang lemah adanya triterpenoid
dan steroid.

Dalam percobaan ini digunakan 4 macam perbandingan kombinasi eluen antara lain n-
heksan-etil asetat (1:1), n-heksan-etil asetat (4:1), kloroform-metanol (4:1) dan kloroform-etil
asetat (4:1). Hal ini dikarenakan agar dapat diketahui kepolaran yang tepat untuk pemisahan
senyawa fitokimia yang diinginkan. N-heksan memiliki konstanta dielektrik sebesar 1,89
yang menjadikan n-heksana masuk dalam kategori pelarut non polar, etil asetat memilii
konstanta dielektrik 6.02 sehingga etil asetat merupakan pelarut polar menengah yang volatil
(mudah menguap), tidak beracun, dan tidak higroskopis, kloroform memiliki konstanta
dielektrik sebesar 4,81 sehingga kloroform termasuk ke dalam kategori pelarut non polar dan
metanol memiliki konstanta dielektrik sebesar 32,7 sehingga metanol termasuk ke dalam
kategori pelarut polar. Sehingga semakin tinggi konstanta dielektrik maka semakin polar dan
semakin rendah konstanta dielektrik maka semakin non polar. Salah satu faktor yang harus
dperhatikan dalam mencampur fase gerak adalah hanya pelarut yang mempunyai kepolaran
yang sama dapat dicampur (Gritter,1991).
Nilai Rf sangat karakteristik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Hal tersebut
dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam sampel. Senyawa
yang mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga
sebaliknya. Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan
tertahan kuat pada fase diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah. Rf KLT yang
bagus berkisar antara 0,2-0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang harus dilakukan adalah mengurangi
kepolaran eluen, dan sebaliknya. (Ewing Galen Wood, 1985)
Pada identifikasi noda atau penampakan noda, jika noda sudah bewarna dapat langsung
diperiksa dan ditentukan harga Rf. Rf merupakan nilai dari Jarak relatif pada pelarut. Harga
Rf dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak tempuh oleh
eluen (fase gerak).
Faktor yang mempengaruhi gerak dan harga Rf :
Sifat dari penyerap dan derajat aktivitas.

110
Struktur kimia dari senyawa dipisahkan.
Kerapan dari satu pasang penyerap.
Pelarut (derajat kemurnian) fase bergerak.
Telah disebutkan sebelumnya bahwa polaritas sampel dan laju pergerakan berbanding
terbalik. Semakin tinggi polaritas senyawa, semakin ikatannya dengan fase diam yang berupa
plat silica gel yang bersifat polar sehingga mempunyai nilai Rf yang semakin kecil, dan
sebaliknya. Sedangakan jika dilihat dari pengaruh eluen yang digunakan, semakin tinggi
polaritas eluen maka nilai Rf nya juga semakin tinggi. (Serma and Bernard, 2003).
Pada saat diberi penampak noda (anisaldehida asam sulfat) kemudian dikeringkan dilemari
asam dan dipanaskan sampai warna ungu. Lalu dihitung nilai Rf-nya, dari hasil percobaan
dengan keempat campuran eluen yang berbeda didapatkan jarak totolan pada perbandingan
eluen n-heksan-etil asetat (1:1) adalah 7 cm sehingga Rf 0,88 cm. Pada perbandingan eluen n-
heksan-etil asetat (4:1) jarak totolan adalah 4,5 cm sehingga Rf 0,56 cm. Pada perbandingan
eluen kloroform-metanol (4:1) jarak totolan adalah 7,4 cm sehingga Rf 0,92 cm. Sedangkan
pada perbandingan eluen kloroform-etil asetat (4:1) jarak totolan adalah 5,2 cm sehingga Rf
0,65 cm. Berdasarkan literature diketahui bahwa n-Heksan adalah senyawa yang memiliki
indeks polaritas sebesar 0,1 sedangkan indeks polaritas etil asetat adalah 4,4 (Houghton dan
Raman, 1989). Dilihat dari perbedaan nilai indeks polaritas antara keduanya dapat diketahui
bahwa etil asetat bersifat lebih polar dibandingkan dengan n-Heksan.
Indeks polaritas dari kloroform dilihat dari literatur diketahui bahwa Kloroform memiliki
indeks polaritas sebesar 4,1 sedangkan indeks polaritas metanol yaitu 5,1. Dilihat dari
perbedaan nilai indeks polaritas antara keduanya dapat diketahui bahwa metanol lebih polar
dibandingkan dengan kloroform. Indeks polaritas dari kloroform dilihat dari literatur
diketahui bahwa Kloroform memiliki indeks polaritas sebesar 4,1 sedangkan indeks polaritas
dari etil asetat adalah 4,4 (Houghton dan Raman, 1989). Sehingga dapat diketahui bahwa etil
asetat lebih polar dari kloroform. Sehingga dari keempat eluen yang bersifat paling non polar
adalah perbandingan eluen n-heksan : etil asetat = 4:1, kloroform : etil asetat = 4:1, n-heksan-
etil asetat = 1:1, dan paling polar yaitu kloroform : metanol = 4:1.
Dengan urutan fase gerak dari yang paling polar, didapatkan Rf 0,92 cm ( kloroform :
metanol = 4:1 ), Rf 0,88 cm ( n-heksan : etil asetat = 1:1 ), Rf 0,65 cm ( kloroform : etil asetat
= 4:1 ) dan Rf 0,56 cm ( n-heksan : etil asetat = 4:1 ). Sehingga dapat disimpulkan bahwa
semakin tinggi polaritas eluen(fase gerak) maka nilai Rf akan semakin tinggi juga begitupun
sebaliknya, hal ini sesuai dengan teori diatas. Nilai Rf yang dihasilkan juga baik karena
sesuai dengan teori bahwa nilai Rf baik berkisar 0,2-0,8 dan hasil nilai Rf kelompok kami

111
memenuhi syarat tersebut, meskipun ada satu dari nilai Rf yang lebih dari 0,8 yang
disebabkan karena kepolaran dari eluen sehingga dihasilkan nilai Rf terlalu tinggi maka untuk
itu bisa mengurangi kepolaran dari eluen yang digunakan. Hal tersebut juga sesuai dengan
teori yang ada.

112
VI. HASIL
Larutkan sedikit kolesterol ke dalam kloform, kemudian Totolkan pada 4 plat KLT (Kiesel
Gel 254) sampai terlihat pekat pada saat diamati pada sinar UV 254 dan setelah ditotolkan
sebanyak 3 kapiler ( 9 totolan ) plat KLT kelompok kami baru terlihat pekat pada sinar UV
254.

Sebelum dieluasi (4 KLT)

1. n- Heksan-etil asetat (1:1)


Setelah ditotolkan dieluasi pada chamber yang berisi fase gerak n- Heksan-etil asetat (1:1)
sampai jenuh. Lalu dikeringkan dilemari asam dan diamati pada sinar UV 254 dan diberi
penampak noda anisaldehida asam sulfat. Kemudian keringkan dilemari asam dan panaskan
di atas hotplate dengan suhu 1000 C sampai timbul warna ungu dan hasil kelompok kami
setelah pemanasan di atas hotplate berwarna ungu yang terlihat pada plat KLT dengan nilai
Rf yaitu 7/8 = 0,88 cm.

Setelah dieluasi Tampak Visual Setelah dieluasi + penampak noda


Sinar UV 254 Anisaldehida asam sulfat Anisaldehida asam sulfat (sinar UV 365)

113
1. n-Heksan-etil asetat (4:1)

Setelah ditotolkan dieluasi pada chamber yang berisi fase gerak n- Heksan-etil asetat (4:1)
sampai jenuh. Lalu dikeringkan dilemari asam dan diamati pada sinar UV 254 dan diberi
penampak noda anisaldehida asam sulfat. Kemudian keringkan dilemari asam dan panaskan
di atas hotplate dengan suhu 1000 C sampai timbul warna ungu dan hasil kelompok kami
setelah pemanasan di atas hotplate berwarna ungu yang terlihat pada plat KLT dengan nilai
Rf yaitu 4,5/8 = 0,56 cm.

Setelah dieluasi Tampak Visual Setelah dieluasi + penampaknoda

Sinar UV 254 Anisaldehida asam sulfat Anisaldehida asam sulfat (sinar UV 365)

2. Kloroform-metanol (4:1)
Setelah ditotolkan dieluasi pada chamber yang berisi fase gerak Kloroform-metanol (4:1)
sampai jenuh. Lalu dikeringkan dilemari asam dan diamati pada sinar UV 254 dan diberi
penampak noda anisaldehida asam sulfat. Kemudian keringkan dilemari asam dan panaskan
di atas hotplate dengan suhu 1000 C sampai timbul warna ungu dan hasil kelompok kami
setelah pemanasan di atas hotplate berwarna ungu yang terlihat pada plat KLT dengan nilai
Rf yaitu 7,4/8 = 0,92 cm.

114
Setelah dieluasi Tampak Visual Setelah dieluasi + penampaknoda

Sinar UV 254 Anisaldehida asam sulfat Anisaldehida asam sulfat (sinar UV 365)

3. Kloroform-etil asetat (4:1)

Setelah ditotolkan dieluasi pada chamber yang berisi fase gerak Kloroform-etil asetat (4:1)
sampai jenuh. Lalu dikeringkan dilemari asam dan diamati pada sinar UV 254 dan diberi
penampak noda anisaldehida asam sulfat. Kemudian keringkan dilemari asam dan panaskan
di atas hotplate dengan suhu 1000 C sampai timbul warna ungu dan hasil kelompok kami
setelah pemanasan di atas hotplate berwarna ungu yang terlihat pada plat KLT dengan nilai
Rf yaitu 5,2/8 = 0,65 cm.

Setelah dieluasi Tampak Visual Setelah dieluasi + penampaknoda

Sinar UV 254 Anisaldehida asam sulfat Anisaldehida asam sulfat (sinar UV 365)

115
VII. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil praktikum yang dilakukan, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa dilihat
dari pengaruh eluen yang digunakan, semakin tinggi polaritas eluen maka nilai Rf nya juga
semakin tinggi. Menurut hasil percobaan, eluen yang paling polar adalah ( kloroform :
metanol = 4:1 ) dengan nilai Rf 0,92 cm dan eluen yang cocok untuk kolesterol (golongan
steroid) yaitu metanol, etil asetat dan kloroform karena menghasilkan hasil yang kuat untuk
menunjukkan senyawa golongan triterpenoid dan steroid.

116
BAB 7. FRAKSINASI DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM

I. TUJUAN
Mahasiswa mampu melakukan fraksinasi suatu ekstrak menggunakan kromatografi kolom

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Klasifikasi Jambu Biji


Jambu biji berasal dari Amerika tropik, tumbuh pada tanah yang gembur maupun liat,
pada tempat terbuka dan mengandung air cukup banyak. Pohon ini banyak ditanam sebagai
pohon buah-buahan. Namun, sering tumbuh liar dan dapat ditemukan pada ketinggian 1-
1.200 m dpl. Jambu biji berbunga sepanjang tahun (Hapsoh, 2011).

Secara botanis tanaman jambu biji diklasifikasikan sebagai berikut :


Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Class : Dicotyledoneae
Ordo : Myrtales
Famili : Myrtaceae
Genus : Psidium
Spesies : Psidium guajava L.
Nama Lokal : Jambu Biji

117
B. Morfologi Tumbuhan Jambu Biji
Jambu biji perdu atau pohon kecil, tinggi 2-10 m, percabangan banyak. Batangnya
berkayu, keras, kulit batang licin, mengelupas, berwarna cokelat kehijauan. Daun tunggal,
bertangkai pendek, letak berhadapan, daun muda berambut halus, permukaan atas daun tua
licin. Helaian daun berbentuk bulat telur agak jorong,ujung tumpul, pangkal membulat, tepi
rata agak melekuk ke atas, pertulangan menyirip, panjang 6-14 cm, lebar 3-6 cm, berwarna
hijau. Bunga tunggal, bertangkai, keluar dari ketiak daun, berkumpul 1-3 bunga, berwarna
putih. Buahnya buah buni, berbentuk bulat sampai bulat telur, berwarna hijau sampai hijau
kekuningan. Daging buah tebal, buah yang masak bertekstur lunak, berwarna putih
kekuningan atau merah jambu. Biji buah banyak mengumpul di tengah, kecil-kecil. Keras,
berwarna kuning kecoklatan (Hapsoh, 2011).

C. Manfaat Tumbuhan Jambu Biji


Tanaman jambu biji atau Psidium guajava L. Termasuk familia Myrtaceae, banyak
tumbuh di daerah-daerah di tanah air kita. Penduduk terlalu mementingkan buahnya,
sedangkan daun-daunnya hanya sebagian kecil saja yang memperhatikannya, padahal
mempunyai nilai obat yang baik, terutama untuk menyembuhkan sakit: diare dan astringensia
(Kartasapoetra, 1992).
Jambu biji memiliki beberapa kelebihan, antara lain buahnya dapat dimakan sebagai
buah segar, dapat diolah menjadi berbagai bentuk makanan dan minuman. Selain itu, buah
jambu biji bermanfaat untuk pengobatan (terapi) bermacam-macam penyakit, seperti
memperlancar pencernaan, menurunkan kolesterol, antioksidan, menghilangkan rasa lelah
dan lesu, demam berdarah, dan sariawan. Selain buahnya, bagian tanaman lainnya, seperti
daun, kulit akar maupun akarnya, dan buahnya yang masih muda juga berkhasiat obat untuk
menyembuhkan penyakit disentri, keputihan, sariawan, kurap, diare, pingsan, radang
lambung, gusi bengkak, dan peradangan mulut, serta kulit terbakar sinar matahari (Cahyono
B, 2010).
Ekstrak etanol daun jambu biji juga telah dilakukan penelitian terhadap uji aktivitas
anti oksidannya (Soebagio,et al. 2007) dan uji aktivitasnya sebagai anti bakteri penyebab
diare (Adyana, et al. 2004).
Daun jambu biji mempunyai manfaat bagi kesehatan yaitu sebagai antiinflamasi,
antidiare, analgesik, antibakteri, antidiabetes, antihipertensi, mengurangi demam dan
penambah trombosit (Kirtikar dan Bashu., 1998). Daun jambu biji putih telah terbukti secara

118
klinis menghambat pertumbuhan rotavirus yang menyebabkan enteritis pada anak-anak dan
menyembuhkan kejang dan penyakit diare akut (Lozoya et al., 2002; Wei et al., 2000).

D. Kandungan Kimia Daun Jambu Biji


Kandungan kimia pada daun jambu biji (Psidium guajava L.) menurut Taiz dan
Zeiger (2002) yaitu terpen, fenolik, dan senyawa mengandung nitrogen terutama alkaloid.
Kandungan kimia tersebut merupakan bagian dari sistem pertahanan diri yang berperan
sebagai pelindung dari serangan infeksi mikroba patogen dan mencegah pemakanan oleh
herbivora. Hasil fitokimia dalam ekstrak daun jambu biji putih adalah senyawa flavonoid,
tanin, triterpenoid, saponin, steroid, dan alkaloid (Arya, et al.,2012).
Flavonoid adalah senyawa yang terdiri dari dari 15 atom karbon yang umumnya
tersebar di dunia tumbuhan. Quercetin adalah zat sejenis flavonoid yang ditemukan dalam
buah-buahan, sayuran, daun dan biji-bijian. Hal ini juga dapat digunakan sebagai bahan
dalam suplemen minuman atau makanan. Saponin adalah jenis glikosida yang banyak
ditemukan dalam tumbuhan. Saponin memiliki karakteristik berupa buih. Sehingga ketika
direaksikan dengan air dan dikocok maka akan terbentuk buih yang dapat bertahan lama.
Minyak atsiri adalah kelompok besar minyak nabati yang berwujud cairan kental pada suhu
ruang namun mudah menguap sehingga memberikan aroma yang khas. Minyak atsiri
merupakan bahan dasar dari wangi-wangian atau minyak gosok (untuk pengobatan) alami.
Tanin merupakan substansi yang tersebar luas dalam tanaman dan digunakan sebagai energi
dalam proses metabolisme dalam bentuk oksidasi, Tanin juga sebagai sumber asam pada
buah. Alkaloid adalah sebuah golongan senyawa basa bernitrogen yang kebanyakan
heterosiklik dan terdapat didunia tumbuhan (tetapi ini tidak mengecualikan senyawa yang
berasal dari hewan).
E. Identifikasi Senyawa
1. Lakukan optimasi eluen dengan cara uji KLT terhadap ekstrak dengan mengganti-ganti
eluen sampai diperoleh pemisahan yang baik. Eluen tersebut akan digunakan untuk
fraksinasi
2. Saipakan 50 gram silica gel
3. Siapkan eluen dari butir (1) sebanyak 300 ml
4. Silika gel dimasukkan ke dalam labu erlemeyer, kemudian ditambahkan sedikit eluen,
kocok selama 15 menit
5. Campuran butir (4) tersebut dituang kedalam kolom sampai setinggi 10 cm dari atas

119
6. Tuangkan eluen ke dalam kolom sampai jenuh, tutup dengan aluminium foil, biarkan
semalam
7. Timbang ekstrak sebanyak 1% dari jumlah silica gel yang digunakan, kemudian ekstrak
di tambahkan sedikit pelarut (etanol/methanol) ad larut dicampur dengan silica gel sama
banyak, diaduk-aduk menggunakan gelas pengaduk sampai homogen dan kering
8. Eluen dibiarkan sampai permukaannya 0,5 cm diatas permukaan silica gel.
9. Ekstrak yang sudah dikeringkan dengan silica gel, dimasukkan ke dalam kolom (diatas
permukaan silica gel), lalu ditambah eluen kira-kira setinggi 3 cm. Eluen
dialirkan/diteteskan sambil dituangi eluen baru sampai kolom terisi penuh dengan eluen,
sementara penetesan tetep dilakukan. Kecepatan penetesan diatur.
10. Penampungan eluen setiap vial sebanyak 5 ml
11. Dilakukan uji KLT untuk kelipatan 10 vial (vial no.1,10,20,30,40,dst). Pada uji KLT,
fase gerak yang digunakan adalah sama dengan fase gerak pada kromatografi kolom.
12. Bila uji KLT memberikan noda yang sama, maka fraksi diataranya dapat digabung
13. Bila uji KLT mmeberikan noda yang berdea, maka uji KLT dilakukan pada vial
diantaranya (bila vial no 10 dan 20 berbeda, maka vial no.15 dilakukan uji KLT).
14. Penetesan dihentikan bila vial terakhir sudah tidak memberikan noda pada analisis
dengan KLT
15. Hasil penggabungan berdasarkan kemiripan profil kromatogram, dianalisis dengan
teknik Kromatografi Lapis Tipis dan dihitung Rf masing-masing spot noda
16. Dokumentasikan pada UV 254, UV 365 dan visual
17. Plat KLT (no.15) di derivatisasi dengan pereaksi dragendrof, uap amonia, anisaldehid-
asam sulfat, FeCl3, dan KOH 10%

F. Pemisahan KLT
Thin Layer Chromatography (TLC)
Kromatografi lapis tipis adalah salah satu contoh kromatografi planar. Fase diamnya
(Stationary Phase) berbentuk lapisan tipis yang melekat pada gelas/kaca, plastik, aluminium.
Sedangkan fase geraknya (Mobile Phase) berupa cairan atau campuran cairan, biasanya
pelarut organi dan kadangkadang juga air. Fase diam yang berupa lapisan tipis ini dapat
dibuat dengan membentangkan /meratakan fase diam (adsorben=penjerap=sorben) diatas
plat/lempeng kaca plastik ataupun aluminium.Digunakan untuk pemisahan zat secara cepat
dengan menggunakan zat penyerap berupa serbuk halus yang dilapiskan serba rat pada
lempeng kaca. Lempeng yang dilapis dapat dianggap sebagai kolom kromatografi terbuka

120
dan pemisahan didasarkan pada penyerapan pembagian atau gabungannya tergantung dari zat
penyerap pembagian atau gabungannya tergantung dari jenis zat penyerap dan cara
pembuatan lapisan zat penyerap dan jenis zat pelarut. KLT dengan penyerap penukar ion
dapat digunakan untuk pemisahan senyawa polar.

Fase diam
Sifat fase diam yang satu dengan fase diam yang lain berbeda karena strukturnya,
ukurannya, kemurniannya, zat tambahan sebagai pengikat dll. Fasa diam yang digunakan
TLC tidak sama dengan yang digunakan untuk kromatografi kolom, terutama karena ukuran
dan zat yang ditambahkan. Fase diam dijual dengan spesifikasi tertentu, iaitu ukuran
(diameter) dalam mesh atau j^m dan untuk kegunaannya (mis: untuk TLC atau kromatografi
kolom). Beberapa fase diam yang banyak dijual dipasaran.

Silika gel
Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam
perdagangan dijual dengan variasi ukuran (diameter) 10-40m. Makin kecil diameter akan
makin lambat kecepatan alir fase geraknya dengan demikian mempengaruhi kualitas
pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi dari 300-1000 m2/g. Bersifat higroskopis,
pada kelembaban relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%. Macam-macam silka gel yang
dijual dipasaran, Silika gel dengan pengikat. Pada umumnya digunakan pengikat gypsum,
(CaSO4 5-15%). Jenis ini diberi nama Silika gel G. Ada juga menggunakan pengikat pati
(starch) dan dikenal Silika gel S, penggunaan pati sebagai pengikat mengganggu penggunaan
asam sulfat sebagai pereaksi penentuan bercak.Silika gel dengan pengikat dan indicator
flouresensi. Jenis silica gel ini sama seperti silika gel diatas dengan tambahan zat
berfluoresensi bila diperiksa dibawah lampu UV A, panjang atau pendek. Sebagai indicator
digunakan timah kadmium sulfida atau mangan-timah silikat. Jenis ini disebut Silika gel GF
atau Silika gel GF254 (berflouresensi pada 254 , nm). Silika gel tanpa pengikat, dikenal
dengan nama Silika gel H atau Silika gel N. Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indicator
flouresensi. Silika gel untuk keperluan pemisahan preparatif.

Fase gerak
Yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik. Dapat digunakan
satu macam pelarut organic saja ataupun campuran. Bilamana fase gerak merupakan
campuran pelarut organik dengan air maka mekanisme pemisahan adalah partisi. Pemilihan

121
pelarut organic ini sangat penting karena akan menentukan keberhasilan pemisahan.
Pendekatanpolaritas adalah yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut. Senyawa polar akan
lebih mudah terelusi oleh fase gerak yang bersifat polar dari pada fase gerak yang non polar.
Sebaliknya, senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh fase gerak non polar dari pada fase
gerak yang polar.

Pembuatan plat (lempeng) silica gel


30 Gram fase diam berbentuk serbuk (dengan diameter tertentu dijual dengan merk
dagang tertentu misalnya Silica gel GF 254) dibuat bubur dengan air atau pelarut lain
sejumlah tertentu (lihat tabel 2) diratakan diatas 4-5 lempeng kaca ukuran 20X20 cm, dalam
waktu tidak lebih dari 4 menit. Perataan ini dapat menggunakan alat perata Stahl-Desaga
untuk plat kaca ukuran 20X20 cm, 20X10 cm dengan ketebalan dapat diatur 0,25-2,0 mm.
Bila ukuran plat lebih kecil dapat dibuat dengan mencelupkan ke dalam bubur adsorbent.
Setelah lapisan bubur ini mengering diruangan kemudian dipanaskan di dalam oven pada
100-120C selama 60 menit, dengan tujuan semua air akan menguap. Proses pengeringan
atau penghilangan air disebut proses mengaktifkan plat kromatografi (fase diam), selanjutnya
didalam rak penyimpan plat-plat ini dimasukkan kedalam dexicator. Sehingga pada waktu
penyimpanan plat-plat tadi tidak menyerap lembab (air) dari udara. Dengan demikian
mekanisme pemisahan komponen (senyawa-senyawa) yang ditahan fase diam adalah
mekanisme absorption.

Penyiapan dan penotolan sampel


Sampel atau cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai (hampir pelarut organik
dapat digunakan dan biasanya dipilih yang mudah menguap), air digunakan hanya bila tidak
dapat dicari pelarut organik yang sesuai. Untuk keperluan analisis kuantitatif sample harus
ditimbang demikian juga pelarut yang digunakan. Kemudian larutan sample disimpan dalam
wadah yang tertutup rapat untuk menghindari penguapan. Pada umumnya ditotolkan 1-20 l
larutan yang mengandung 50-100 g sample tiap bercak untuk kromatografi absorbsi dan 5-
2Qg sample untuk kromatografi partisi. Penotolan dapat dilakukan dengan gelas kapiler
yang dibuat sendiri atau dengan pipet mikro. Untuk keperluan kuantitatif digunakan
quantitative microsyringe. Kepada plat TLC konvensional (20X20 cm, 5X20 cm, tebal 0,2
mm) sample ditotolkan sebagai bercak

122
Tinjauan Eluen
Fase gerak merupakan medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa pelarut.
Fase gerak bergerak dalam fase diam karena adanya gaya kapiler. Pelarut yang digunakan
sebagai fase gerak hanyalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila diperlukan system
pelarut mltikomponen ini harus berupa suatu campuran yang sesederhana mungkin yang
terdiri atas maksimum 3 komponen. Angka banding campuran dinyatakan dalam bagian
volume total 10 (Nyiredy, 2002). Pelarut pengembang dikelompokkan ke beberapa golongan
Snyders berdasarkan kekuatan pelrutnya. Menurut Stahl (1985) eluen atau fase gerak yang
digunakan dalam KLT dikelompokkan ke dalam 2 kelompok, yaitu untuk pemisahan
senyawa hidrofil dan lipofil. Eluen untuk pemisahan senyawa hidrofil meliputi air, methanol,
asam asetat, etanol, isopropanol, aseton, n-propanol, tert-butanol, fenol, n-butanol, sedangkan
untuk pemisahan senyawa lipofil meliputi etil asetat, eter, kloroform, benzene, toluene,
sikloheksana, dan petroleum eter.

1. Kloroform
a. Sifat fisis (Ketta & Cunningham, 1992)
Rumus molekul : CHCl3
Berat molekul : 119,39 g/gmol
Wujud : cairan bening
Titik didih : 61,20C
Titik leleh : -63,50C
Densitas : 1,489 g/cm3, 32oC
Suhu kritis : 264oC
Specific gravity :1,489
Viskositas : 0,57 cP (20oC)
Kapasitas panas : 0,234 kal/goC, pada 20oC
Tekanan kritis : 53,8 atm
Volume kritis : 0,239 m3/kmol
Tegangan permukaan : 0,0267 N/m, 25C
Kapasitas panas : 113,666 kJ/kmol.K, 25C
Panas penguapan : 29,5 kJ/mol, 61,2C
Energi Gibbs : -18,663 kkal/mol
Entalpi pembentukan : -32,12 kkal/mol

123
Kelarutan dalam 100 ml bagian air : 0,8 g (250C)
b. Sifat kimia
Kloroform jika bereaksi dengan udara atau cahaya seara perlahan-lahan akan
teroksidasi menjadi senyawa beracun phosgene (karbonil klorida).
Reaksi :
udara atau cahaya
CHCl3 + O2 COCl2 + HCl
Kloroform dapat direduksi dengan bantuan zeng dan asam klorida untuk
membentuk metilen klorida. Jika proses reduksi dilakukan dengan bantuan debu
sebg dan air akan dapat diperoleh metana.
Reaksi :
Zn
CHCl3 + 2H COCl2 + HCl
HCl
Zn
CHCl3 + 6H CH4 + 3 HCl
H2O

Kloroform dapat bereaksi dengan asam nitrat pekat untuk membentuk nitro
kloroform atau kloropikrin.
Reaksi :
CHCl3 + HNO3 CCl2NO2 + H2O
Kloropikrin biasanya digunakan sebagai insektisida.
Kloroform dapat mengalami proses klorinasi dengan klorin jika terkena sinar
matahari dan mengahsilkan karbon tetraklorida.
Reaksi :
CHCl3 + Cl2 CCl4 + HCl
(Kirk and Othmer, 1982)

2. Aseton
a. Sifat-sifat fisika
Rumus molekul : CH3COCH3
Berat molekul : 58,080 kg/kmol
Densitas : 785,601 kg/m3, 25C
Viskositas : 0,32 cP, 20C
Titik didih : 56,29C
Titik leleh : -94,6C

124
Temperatur kritis : 235,05C
Tekanan kritis : 4.701 kPa
Volume kritis : 0,209 m3/kmol
Tegangan permukaan : 0,0230 N/m, 25C
Kapasitas panas : 126,281 kJ/kmol.K, 25C
Panas penguapan : 29,1 kJ/mol
Entalpi penguapan : 30,836 kJ/mol
Energi Gibbs : -36,47 kkal/mol
Entalpi pembentukan : -59,33 (cair) kkal/mol
Kelarutan (dalam air) : larut dalam berbagai rasio

b. Sifat-sifat kimia
Dengan air akan membentuk suatu 1,1-diol yang disebut gem-diol atau hidrat.
Reaksi ini bolak-balik dan biasanya kesetimbangan terletak pada sisi karbonil.
Reaksi :

Dengan hidrogen sianida dalam kondisi sedikit basa (aseton hidrat) akan
membentuk sianohidrin aseton.
Reaksi :

Dengan amonia dan amina primer akan membentuk imina, suatu senyawa yang
mengandung gugusan C = N. Reaksi ini dapat berjalan dengan baik pada
keadaan asam, dimana pH optimum 3-4.
Reaksi :

125
Dengan amina sekunder (R2NH akan menghasilkan ion iminium yang bereaksi
lebih lanjut menjadi enamina (vinilamina).
Reaksi :

3. Asam formiat
I. Sifat fisika
Rumus molekul : HCOOH
Berat molekul : 46,03 g/mol
Densitas : 785,601 kg/m3, 25C
Viskositas : 1,57 cP, 25C
Titik didih : 100,8C (760 mmHg)
Titik leleh : 8,4C
Spesifik gravity : 1,22647, 20C
Tegangan permukaan : 37,67 dyne/cm, 22C
Kapasitas panas : 82,8 joulel/mol.K, 0C
Panas pembentukan : 3031 kal/mol
Panas penguapan : 104 kal/mol
Panas pembakaran cairan : 60,9 kkal/mol, pada 25C
Panas pembentukan cairan : 101,52 kkal/mol, pada 25C
II. Sifat kimia
Asam formiat dapat bercampur sempurna dengan air dan sedikit larut dalam
benzene, karbon tetra klorida, toluene dan tidak larut dalam hidrokarbon alifatik
seperti heptana dan oktana.
Asam formiat dapat melarutkan nilon, poliamida tetapi tidak melarutkan Poli
Vinil Chlorida (PVC).

126
Campuran Asam formiat dan air membentuk campuran azeotrop (yaitu
campuran larutan yang mempunyai titik didih mendekati titik beku) dengan
kandungan maksimum Asam formiat 77,5 % pada tekanan atmosfer.
Asam formiat akan terdekomposisi menjadi Karbon dioksida dan air pada
temperatur 100 oC atau dalam temperatur kamar bila ditambahkan katalis
Palladium.
Asam formiat terhidrasi oleh Asam sulfat pekat dan menghasilkan Karbon
monoksida dan air.
Tinjauan Indeks Polaritas
Pelarut Indeks Polaritas
Pentana 0
1,1,2-trikorotrifluoroetana 0
Siklopentana 0,1
Heptane 0,1
Heksana 0,1
Iso oktana 0,1
Petroleum eter 0,1
Sikloheksana 0,2
N-butilklorida 1,0
Toluene 2,4
Metal t-butil eter 2,5
O-xylene 2,5
Klorobenzena 2,7
O-diklorobenzena 2,7
Etil eter 2,8
Diklorometana 3,1
Etilen diklorida 3,5
N-butil alcohol 3,9
Isopropyl alcohol 3,9
N-butil asetat 4,0
Isobutil alcohol 4,0
Metal isoamil keton 4,0
N-propoil alcohol 4,0

127
Tetrahidrofuran 4,0
Kloroform 4,1
Metal isobutyl keton 4,2
Etil asetat 4,4
Metal n-propil keton 4,5
Metal etil keton 4,7
1,4-dioxana 4,8
Aseton 5,1
Methanol 5,1
Piridin 5,3
2-metoksietanol 5,5
Aseetonitrit 5,8
Propilen karbonat 6,1
N-n dimetilformamida 6,4
Dimetil asetamida 6,5
N-metilpirolidin 6,7
dimetilsulfoksida 7,2

G. Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan preparatif. Metode ini
memungkinkan untuk melakukan pemisahan suatu sampel yang berupa campuran dengan
berat beberapa gram. Pada prinsipnya kromatografi kolom adalah suatu teknik pemisahan
yang didasarkan pada peristiwa adsorpsi. Sampel yang biasanya berupa larutan pekat
diletakkan pada ujung atas kolom. Komponen tunggal yang ada pada sampel dijerap oleh fase
diam yang telah dibentuk atau biasa digunakan silica gel yang terdapat pada kolom, namun
apabila dialirkan pelarut secara kontinyu maka akan terjadi migrasi senyawa dan senyawa
tersebut terbawa oleh pelarut sesuai dengan polaritasnya. Kecepatan eluasi sebaiknya dibuat
konstan. Jika kecepatan eluasi terlalu kecil maka senyawa-senyawa akan terdifusi ke dalam
eluen dan akan menyebabkan pita makin melebar yang akibatnya pemisahan tidak dapat
berlangsung dengan baik. Dan apabila kecepatan eluasi terlalu besar maka pemisahan kurang
baik dan tidak berdasarkan tingkat polaritasnya sehingga akan diperoleh fraksi yang sama dan
menyebabkan fase diam cepat menjadi kering dan dikhawatirkan terjadi cracking. Permukaan

128
adsorben harus benar-benar horizontal, hal ini dilakukan untuk menghindari terjadinya cacat
yang dapat terjadi selama proses eluasi berjalan.

H. Jenis-Jenis lempeng KLT


Fasa diam dapat digunakan silika gel, alumina dan serbuk selulosa.

Partikel silika gel mengandung gugus hidroksil pada permukaannya yang akan
membentuk ikatan hidrogen dengan molekul polar air. Pada kromatografi lapis tipis, sebuah
garis digambarkan dibagian atas dan bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran
pewarna di tempatkan pada garis yang telah ditentukan. Diberikan penandaan pada garis
dilempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika dilakukan dengan tinta,
pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram di bentuk (Roy J. 1991).

Alumina (Al2O3) dan silika gel (SiO2). Alumina lebih polar daripada silika gel,
dan senyawa ini sering dinyatakan lebih aktif daripada silika gel. Alumina lebih cocok
untuk analisis senyawa-senyawa yang nonpolar atau kurang polar (seperti hidrokarbon,
eter, aldehida, keton, dan alkil halida) karena senyawa-senyawa polar sangat kuat
teradsorbsi pada adsorbent ini. Analisis KLT senyawa-senyawa polar pada alumina
umumnya menghasilkan harga Rf yang rendah dan pemisahan yang minimal. Sebaliknya
silika gel dipilih sebagai adsorbent untuk senyawa-senyawa polar (asam karbokislat, alkohol,
amina) karena senyawa-senyawa non polar teradsorbsi lemah pada silika gel. Analisis KLT
senyawa-senyawa nonpolar pada silika gel umumnya memberikan harga Rf yang tinggi dan
pemisahan yang maksimal (Firdaus. 2011).

G. Konstanta dielektrik
n-heksana = 2.0
kloroform = 4.8
etil asetat = 6.0
methanol = 30.0
semakin tinggi nilai konstanta dielektrik suatu pelarut, maka semakin polar senyawa
pelarut tersebut.

129
III. BAGAN ALIR

1. Lakukan optimasi eluen dengan cara uji KLT terhadap ekstrak dengan mengganti-ganti eluen
sampai diperoleh pemisahan yang baik. Eluen tersebut akan digunakan untuk fraksinasi.

2. Siapkan 50 gram silica gel

3. Siapkan eluen dari butir (1) sebanyak 300 ml dan Silika gel dimasukkan ke dalam
labu erlemeyer, kemudian ditambahkan sedikit eluen, kocok selama 15 menit.

4. Campuran butir (3) tersebut dituang kedalam kolom sampai setinggi 10 cm dari atas.
Tuangkan eluen ke dalam kolom sampai jenuh, tutup dengan aluminium foil,
biarkan semalam

5. Timbang ekstrak sebanyak 1% dari jumlah silica gel yang digunakan, kemudian ekstrak di
tambahkan sedikit pelarut (etanol/methanol) ad larut dicampur dengan silica gel sama
banyak, diaduk-aduk menggunakan gelas pengaduk sampai homogen dan kering

6. Eluen dialirkan sampai permukaannya 0,5 cm diatas permukaan silica gel.

7. Ekstrak yang sudah dikeringkan dengan silica gel, dimasukkan ke dalam kolom (diatas
permukaan silica gel), lalu ditambah eluen kira-kira setinggi 3 cm. Eluen dialirkan/diteteskan
sambil dituangi eluen baru sampai kolom terisi penuh dengan eluen, sementara penetesan tetep
dilakukan. Kecepatan penetesan diatur.

8. Penampungan eluen setiap vial sebanyak 5 ml. Dilakukan uji KLT untuk kelipatan 10 vial (vial
no.1,10,20,30,40,dst). Pada uji KLT, fase gerak yang digunakan adalah sama dengan fase
gerak pada kromatografi kolom.

130 maka fraksi diataranya dapat digabung. Bila


9. Bila uji KLT memberikan noda yang sama,
uji KLT memberikan noda yang berbeda, maka uji KLT dilakukan pada vial diantaranya
(bila vial no 10 dan 20 berbeda, maka vial no.15 dilakukan uji KLT).
IV. SKEMA KERJA
A. Menyiapkan eluen

Di erlenmeyer
+
sebanyak 300 ml
dengan perbandingan
n-heksan etil asetat n-heksan:etil asetat
(4:1)

B. Menyiapkan silika gel

Ditimbang silika gel 90 gram

Serbuk
silika gel kolom

C. Menyiapkan kolom

Dicampur
dan diaduk

Serbuk eluen
silika gel

Silika gel diisikan ad bagian


Campuran dituangkan kedalam
tabung (pastikan tidak ada
kolom dengan diberi erlenmeyer
udara dan ratakan bagian atas
bagian bawah untuk menampung
dengan spatula logam)
eluen yang mengalir
131
Isikan eluen diatas permukaan
silika gel kurang lebih 0.5 cm

Tunggu 10 menit untuk


memampatkan silika gel

Sisa silika gel Ekstrak ditimbang 0.79


ditimbang gram (ditimbng sebanyak
1% dari jumlah silika
yang digunakan)

Ekstrak dilarutkan dengan


sedikit pelarut ad larut

Teteskan ekstrak sedikit demi


sedikit ke dalam kolom

Buka kran tabung, biarkan eluen


mengalir sambil diisi kembali.
Tunggu ekstrak sampai dibawah
tabung

132
Setelah ekstrak berada dibawah,
siapkan untuk penampungan
senyawa dengan vial

Tampung dari vial 1-80 masing-


masing vial 5 ml

D. Uji KLT

Vial no. 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, dan 80
ditotolkan pada plat KLT dan dilakukan eluasi

Liat noda pada sinar UV 254 dan 365 nm.

Lanjutkan penggabungan fraksinasi

133
V. HASIL

Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi 3

Vial 1-9 Vial 10-17 Vial 18-22

Rf = 0,8125 Rf = 0,7750 Rf = 0,5375

Rf` = 0,9375 Rf` = 0,8 Rf` = 0,7875

Fraksi 4 Fraksi 5 Fraksi 6

Vial 23-39 Vial 40-42 Vial 43-50

Rf = 0,4125 Rf = 0,375 Rf = 0,3875

Rf` = 0,575 Rf` = 0,4375 Rf` = 0,45

Rf = 0,7750 Rf = 0,575 Rf = 0,775

Rf = 0,7750 Rf = 0,875

Rf = 0,875

134
Fraksi 7
Vial 51-70
Rf = 0,025
Rf = 0,125
Rf = 0,2125
Rf = 0,3
Rf = 0,325
Rf = 0,7875
Rf = 0,875

Tampak noda ekstrak Psidium guajava


Nilai Rf
Rf = 0,0375
Rf = 0,075
Rf = 0,1375
Rf = 0,2625
Rf = 0,4875
Rf = 0,85

135
VI. PEMBAHASAN
Fraksinasi merupakan suatu prosedur yang digunakan untuk memisahkan golongan
utama kandungan yang satu dari kandungan golongan utama yang lainnya. Fraksinasi
merupakan prosedur pemisahan komponen-komponen berdasarkan perbedaan kepolaran
tergantung dari jenis senyawa yang terkandung dalam tumbuhan. Kromatografi kolom adalah
salah satu metode yang digunakan untuk pemurnian campuran dengan memakai kolom.
Sebelum melakukan percobaan kromatografi perlu dipastikan kondisi dari eluennya, seperti
pemilihan pelarut yang cocok. Pada pemisahan menggunakan kromatografi kolom ini,
campuran yang akan dipisahkan diletakkan dibagian atas kolom yang terlebih dahulu telah
dibuat.pelarut fase gerak dibiarkan mengalir melewati kolom, karena aliran yang disebabkan
oleh gaya berat(gravitasi) atau didorong dengn tekanan. Pita senyawa larut bergerak melalui
kolom dengan laju berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi-fraksi ketika keluar
dari kolom ( sudjadi 1986).
Pada praktikum ini, digunakan metode kromatografi kolom basah, dimana silica gel
tersebut dilarutkan dahulu ke dalam pelarutnya. Silica gel dimasukkan secara perlahan dan
dipastikan tidak ada gelembung dan udara yang masuk agar tidak terjadi cracking, pelarut
juga harus terus ditambahkan untuk mencegah terjadinya kerusakan atau pecahnya kolom
karena adanya rongga udara. Setelah itu, ekstrak yang akan dimasukkan ke dalam kolom
terlebih dahulu dikeringkan dengan silica gel sampai terbentuk butir-butir halus lalu
dimasukkan ke dalam tabung. Kemudian kran dibuka sedikit kira-kira menetes setiap 2 detik
agar ekstrak dapat mengalir ke bawah hingga batas tertentu (sekitar 3 cm). Setelah mencapai
3 cm, eluen ditambah perlahan-lahan lewat dinding tabung untuk mencegah keringnya kolom
didalm tabung.
Jika kolom masih berwarna putih maka penambahan eluen serta pengeluaran eluen
tetap dilakukan sampai seluruh kolom sudah tidak berwarna putih seperti awal. Setelah
kolom kromatografi berwarna agak kuning secara merata (tidak seperti awal) kecepatan
penetesan mulai diatur 1 detik 1 tetesan dan mulai ditampung pada vial yang telah dikalibrasi
sebanyak 5 ml. Selama menampung ke dalam vial, sebelum eluen habis harus segera
ditambahkan agar tidak terjadi cracking. Penampungan dilakukan hingga 70 vial. Dari 70 vial
tersebut ditutup dengan aluminium foil dan diberi lubang kecil-kecil agar eluen menguap dan
meninggalkan ekstrak yang akan diamati, kemudian dibiarkan hingga cairan dalam vial
tinggal sedikit dengan kata lain eluen sudah menguap dan tinggal dari pada yang awal.
Setelah itu, fraksi yang ada didalam vial jika tinggal sedikit dan tidak bisa ditotolkan
dengan pipa kapiler maka dilarutkan terlebih dahulu sedikit dengan eluen, tidak boleh terlalu

136
banyak, agar noda tampak saat diamati, karena apabila terlalu banyak, noda jadi tidak
tampak. Kemudian uji fraksi pertama dilakukan pada vial nomor 1,10,20,30,40,50,60,70.
Fraksi ditotolkan pada plat KLT dan dieluasi dengan eluen. Setelah dieluasi, diamati dengan
UV 365nm. Tiap setelah eluasi, noda yang tampak diamati dan noda yang sama berarti akan
dikumpulkan menjadi 1 fraksi. Sedangkan noda yang tidak sama, diambil angka tengahnya
dan diamati, apakah nodanya lebih mirip ke sisi yang satu atau yang lainnya. Begitu
seterusnya hingga semua vial tergabung dalam beberapa fraksi. Dari seluruh penotolan :
Penotolan 1 : 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ,70.
Penotolan 2 : 5, 15, 25, 35, 45, 55
Penotolan 3 : 7, 17, 23, 37, 43, 53
Penotolan 4 : 38, 39, 41, 42, 51, 52
Penotolan 5 : 8, 9, 18, 19, 21, 22
Penotolan 6 : 1-9, 10-17, 18-22, 23-39, 40-42, 43-50 dan 51-70
Setelah disimpulkan, fraksi yang diperoleh adalah sejumlah 7 fraksi, yaitu :
Fraksi 1 : Vial 1-9
Nilai Rf = 0,8125
Nilai Rf = 0,9375
Fraksi 2 : Vial 10-17
Nilai Rf = 0,7750
Nilai Rf = 0,8
Fraksi 3 : Vial 18-22
Nilai Rf = 0,5375
Nilai Rf = 0,7875
Fraksi 4 : Vial 23-39
Nilai Rf = 0,4125
Nilai Rf = 0,575
Nilai Rf = 0,7750
Fraksi 5 : Vial 40-42
Nilai Rf = 0,375
Nilai Rf = 0,4375
Nilai Rf = 0,575
Nilai Rf = 0,7750
Nilai Rf = 0,875

137
Fraksi 6 : Vial 43-50
Nilai Rf = 0,3875
Nilai Rf = 0,45
Nilai Rf = 0,775
Nilai Rf = 0,875
Fraksi 7 : Vial 51-70
Nilai Rf = 0,025
Nilai Rf = 0,125
Nilai Rf = 0,2125
Nilai Rf = 0,3
Nilai Rf = 0,325
Nilai Rf = 0,7875
Nilai Rf = 0,875
Setelah itu eluasi ekstrak psidium guajava pada chamber dan amati pada sinar UV 365
sehingga dihasilkan 6 noda dengan nilai Rf yaitu Nilai Rf 1 (0,0375), Nilai Rf 2 (0,075), Nilai
Rf 3 (0,1375), Nilai Rf 4 (0,2625), Nilai Rf 5 (0,4875) dan Nilai Rf 6 (0,85)
Dalam praktikum ini, eluen yang digunakan adalah n-heksana dan etil asetat dengan
perbandingan 4 :1. N-heksana memiliki konstanta dielektrik 2,0 sedangkan etil asetat
memiliki konstanta dielektrik 6,0. Maka tetapan dielektrik pelarut atau eleun adalah
(% )+ (% )
= 100
(80% 2)+ (20% 6)
= 100

= 2,8

Sesuai dengan teori, semakin meningkatnya konstanta dielektrik pelarut,semakin


tinggi pula kepolarannya. Hasil tetapan dielektrik eluen adalah 2,8 yang artinya eluen tersebut
adalah non polar.

138
VII. Kesimpulan
Berdasarkan hasil praktikum yang dilakukan maka dapat ditarik kesimpulan,fraksinasi
secara kromatografi kolom dari ekstrak tanaman Psidium guajava denganeluen n-heksana :
etil asetat dengan perbandingan 4:1 menghasilkan 7 fraksi. Diketahui juga dari hasil noda
yang dihasilkan dari totolan fraksi yang diidapat maka dapat disimpulkan bahwa semakin
banyak fraksi yang dihasilkan atau semakin banyak noda maka senyawa tersebut semakin
non polar.
Pelarut yang digunakan pada kromatografi kolom harus dioptimasi terlebih dahulu
dan harus dilakukan penggantian pelarut secara bertahap, non polar-semipolar-polar agar
terbentuk fraksi yang beragam. Harus dipilih pula eluen yang tepatuntuk melakukan analisa
pada KLT.

139
DAFTAR PUSTAKA

Bernard, AndrewB, Jonathan Eaton, J. Bradford Jensen and Samuel Kortum. 2003. "Plants
and Productivity in International Trade." American Economic Review, 93(4): 1268-
1290.

Depkes RI. (1995). Materia Medika Indonesia. Jilid VI. Cetakan Keenam. Jakarta: Direktorat
Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan.

Fessenden R.J dan J.S Fessenden., 2003, Dasar-dasar kimia organik. Jakarta, Erlangga
Gunawan, Didik. 2004. Ilmu Obat Alam (Farmakognosi) Jilid 1. Penebar Swadaya. Jakarta.
Materia medica jilid 4.

Guyton A.C. and J.E. Hall 2007. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Edisi 9. Jakarta: EGC.
74,76, 80-81, 244, 248,606,636,1070,1340.
Gritter, R.J., Bobbit, J.M., dan Swharting, A.E. 1991. Pengantar Kromatografi. Edisi Kedua.
Penerbit ITB. Bandung

Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman., 2007,Kimia Farmasi Analisis, pustaka pelajar,
yogyakarta
Harborne, J.B., (1987), Metode Fitokimia, Edisi ke dua, ITB, Bandung. Terjemahan Kosasih
Padmawinata dan Iwang Soediro. ITB. Bandung.

Heinrich M., Barner J., Gibbons S., Williamson E.M., 2009, Farmakognosi dan Fitoterapi.
Jakarta. Penerbit Buku Kedokteran EGC.

Markham, K. R.1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoida. Terjemahan Kosasih Padmawinata.


ITB. Bandung.

Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Edisi ke-4 Terjemahan Kosasih
Padmawinata. ITB Press. Bandung.

Setyawaty, R, Ismunandar dan Nurul Quroatun Ngaeni A. desember 2014. Identifikasi


Senyawa Antrakuinon Pada Daun Mengkudu (Morinda citrifolia L.) Menggunakan
Kromatografi Lapis Tipis. Prosiding Seminar Nasional Hasil - Hasil Penelitian dan
Pengabdian LPPM UMP 2014. ISBN 978-602-14930-3-8.
http://www.seminarlppm.ump.ac.id/index.php/semlppm/article/view/110/108. 30 Mei
2016.

140