Universidad Veracruzana

Microbiologa ambiental

Giseth Damaris Higinio Santander

IA-2-V

Fijacin y mtodos de tincin

En microbiologa el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona importante
informacin para la identificacin temprana y definitiva de los microorganismos. En la valoracin de
las muestras, es trascendente el poder de resolucin del microscopio, el cual se define como la
capacidad que posee un objetivo para distinguir la distancia mnima entre dos puntos del objeto para
que se puedan visualizar como dos puntos separados. El poder de resolucin de un objetivo es el
responsable de la calidad, claridad, nitidez y fineza detallada de la imagen, y depende de la longitud
de onda () del haz de luz utilizado y de la apertura numrica del objetivo empleado. Para
aprovechar esta ventaja de los microscopios, se han desarrollado tcnicas tintoriales que destacan
las caractersticas morfolgicas de los microorganismos. Existe una gran variedad de tinciones que
pueden ser aplicadas dentro del campo de la microbiologa
Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a clulas, tejidos, fibras, etctera. De
acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales son extrados de
plantas o animales, y colorantes artificiales, que son aquellos de minerales procesados y
manipulados en el laboratorio. Qumicamente, el colorante est constituido de un componente
cromforo y un auxcromo. El cromforo es todo grupo aislado, covalente e insaturado, que tiene
una absorcin caracterstica en la regin ultravioleta o visible; dicho de otra forma, es la capacidad
que tiene la molcula para que sus electrones absorban energa o luz visible, se exciten y emitan
diversos colores de acuerdo con la longitud de emitida como resultado del cambio en el nivel
energtico.
Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al microscopio
ptico, la mayora de las veces es necesario teirlos para que por medio del uso de colorantes, sea
mucho ms fcil su identificacin; adems, la presencia de ciertas estructuras, as como su reaccin
a determinadas tcnicas, nos permite clasificar a las bacterias.
As pues, los colorantes tienen las siguientes funciones:
1. Permiten hacer visibles a los objetos microscpicos y transparentes.
2. Revelan su forma y tamao.
3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas.
4. Producen reacciones qumicas especficas.
Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tie del mismo color y se
utiliza un slo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tincin diferencial, cuando se visualiza ms
de un color porque se utiliza ms de un colorante Gram o Ziehl-Neelsen); tincin especfica, cuando
se utilizan anticuerpos marcados con una molcula fluorescente para identificar una estructura
celular en particular (inmunocitoqumico).
Algunas tcnicas tintoriales como Gram o ZiehlNeelsen requieren antes de su proceso la fijacin de
las muestras. Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas,
proceso llamado fijacin. Para las bacterias la fijacin por el calos es lo ms corriente, aunque
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tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehdo, cidos y alcoholes. Despus de
la fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido secadas sobre un portaobjetos, tratando
despus ste con el agente fijador y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin
produce generalmente el encogimiento de las clulas, la tincin, por el contrario, hace que las
clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas
que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin.
A continuacin se mencionarn las principales tcnicas de tincin utilizadas en microbiologa.
Tinciones simples
Se usa un nico colorante, que siempre es de tipo bsico. Se utilizan solamente para incrementar el
contraste; todas las clulas absorbern el colorante y quedarn teidas del mismo color. Se fija el
espcimen, se aade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el
exceso de colorante y la preparacin ya est lista para ser observada.
Tinciones diferenciales
Se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La tcnica de tincin diferencial consta de
dos etapas: una tincin simple seguida de una tincin de contraste. En la tincin de contraste se
utiliza otro colorante que tie (y por tanto, revela) las clulas no teidas por el primer colorante.
Estas tinciones son muy utilizadas en microbiologa.
Tinciones especficas
Se utilizan para incrementar el contraste en las clulas microbianas y revelan estructuras
particulares, entre las que se incluyen en los flagelos y las cpsulas.
Tincin adecuada
En su forma ms simple, el verdadero proceso de tincin puede implicar la inmersin de la muestra
en la solucin colorante, seguido del aclarado que es un lavado para eliminar el exceso de colorante
y la observacin. Muchos tintes, sin embargo, requieren del uso de un mordiente. Cuando la solucin
de colorante en exceso se elimina durante el aclarado, la tincin mordentada permanece.
Tincin indirecta
Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un mordiente habitual es
el cido tnico.
Tincin directa
Hablamos de tincin directa cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato, sin otro
tratamiento previo.
Tincin naranja de acridina
El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico ya sea en su forma nativa o
desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede
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variar, dependiendo del pH y de la concentracin. El naranja de acridina ha sido empleado como

colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo est vivo y roja si est muerto.
Tincin de Gram
Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la
pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con cierto detalle la tincin de Gram. Las
clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien primero con una solucin de cristal violeta
(otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de
colorante. En este estado todas las clulas, tanto las gramnegativas como las grampositivas, estn
teidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo (I2) yoduro potsico
(KI). El ingrediente activo es aqu el yodo, el yoduro potsico simplemente hace soluble el yodo en
agua. El yodo entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De
nuevo tanto las clulas grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situacin.
Se lleva a cabo despus de la decoloracin, usando bien alcohol o bien acetona, sustancias en las
que es soluble el complejo yodo cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se
decoloran mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos
de clulas est, por lo tanto, en la resistencia a la decoloracin. Despus de la decoloracin las
clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de
manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un
colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste
las clulas gramnegativas son rojas mientras que las grampositivas permanecen azules.

Tincin cido alcohol resistencia

Esta tincin sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que tienen un alto
contenido en lpidos y en cidos miclicos y que no pueden ser calificadas por la tincin de Gram.
Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una mezcla de fucsina fenol, en la que la fucsina
hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. Las clulas se tien de rosa, tanto las cido alcohol
sensibles como las resistentes. Despus se usa un decolorante orgnico que hace que las bacterias
cido alcohol sensibles se decoloren mientras que las cido alcohol resistentes se quedan rosa.
Como en la tincin de Gram se utiliza un colorante de contraste que en este caso es el azul de
metileno que tie las clulas cido alcohol sensibles de color azul quedando las clulas cido
alcohol resistentes de color rosa.
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Tincin de esporas
Se utiliza para teir las estructuras de
resistencia llamadas endosporas bacterianas.
Sobre el portaobjetos con la preparacin se
echa verde malaquita que tie las clulas de
verde. Luego se lava con agua destilada con lo
que las clulas se quedan incoloras y las
endosporas permanecen verde. Finalmente se
usa la safranina para obtener bacterias de
color rosa mientras que las endosporas continan con su color verde del verde malaquita.

Tincin negativa
Es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se
dejan sin teir pero se colorea un cambio el medio que las rodea.
Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia
utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene
afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea
las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de
partculas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro
insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de
aumentar el contraste de las clulas en microscopia ptica, pero su
mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor
de las clulas bacterianas.

Tincin de azul algodn de lactofenol

El examen microscpico es de gran importancia en micologa para la observacin de las diferentes
especies de hongos de inters clnico. Se deben utilizar tinciones que logren preservar la integridad
de las estructuras fngicas. La tincin de azul algodn de lactofenol no es considerada una tincin
diferencial, sin embargo, posee caractersticas tintoriales que permiten observar cada uno de los
componentes fngicos y apreciar fcilmente las estructuras para una adecuada identificacin. El
fenol inactiva las enzimas lticas de la clula e impide que sta se rompa; de igual forma, destruye la
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flora acompaante e inactiva a la clula, quitndole el grado de patogenicidad; adems, acta como
mordiente cuando se usa en combinacin con colorantes. El cido lctico preserva las estructuras
fngicas al provocar un cambio de gradiente osmtico con relacin al interior fngico, lo que genera
una pelcula protectora. El azul de algodn es un colorante cido, que tie el citoplasma y la quitina
presente en las clulas fngicas, mientras que el glicerol mantiene hmeda la preparacin.2 Una vez
preparado el colorante, se debe colocar la muestra microbiolgica en un portaobjetos por medio de
una impronta (proceso en el cual se coloca una impresin de la muestra sobre una estructura
utilizando una cinta adhesiva transparente).

Preparacin de la impronta
1. Colocar el material necesario en la campana de
seguridad tipo.
2. Seleccionar las colonias para realizar las improntas.
3. Cortar segmentos de cinta adhesiva transparente
aproximadamente de 1 cm2.
4. Pegar los segmentos de cinta en un asa micolgica.
5. Poner una gota de azul de algodn en el portaobjetos.
6. Con el lado adhesivo de la cinta, tocar la parte superior
de hongo.
7. Colocar la cinta sobre la gota de azul de algodn y poner
otra gota de azul de algodn.
8. Poner un cubreobjetos sobre la preparacin.
9. Observar en 40x.

Bibliografa
En lnea:
Tcnicas de tincin. Recuperado el 5 de octubre de 2016 a las 17:26 horas.
http://acuanatura.galeon.com/cursosonline/tecnicasdetincion/tecnicasdetincion.pdf
Mtodos y tcnicas de tincin. Recuperado el 5 de octubre de 2016 a las 17:42 horas.
http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com/2014/10/metodos-y-tecnicas-de-tincion.html
Las tinciones bsicas en el laboratorio de microbiologa. Recuperado el 5 de octubre a las 18:04
horas.
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http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf