Lpez-Durn M, Campo-Trapero J, Cano-Snchez J, Dez-Prez R, Bascones-Martnez A

Aplicacin de las tcnicas de biologa molecular en oncologa oral

Aplicacin de las tcnicas de biologa

molecular en oncologa oral
Application of molecular biology techniques in oral cancer
Lpez-Durn M*, Campo-Trapero J**, Cano-Snchez J***, Dez-Prez R*,
Bascones-Martnez A****

RESUMEN
Este artculo de revisin se propone exponer las principales tcnicas de biologa molecular disponibles actualmente
para los investigadores, en el campo del cncer y precncer oral, clasificadas segn el tipo de material biolgico del
que se disponga para iniciar la investigacin. ste puede ser ADN, ARN o protenas. La explicacin de cada tcnica
comprender una breve sistemtica del proceso, as como sus ventajas, inconvenientes y estado de actividad actual.
Todo ello con la finalidad de esclarecer las aplicaciones, pronto indispensables, de las tcnicas ms destacadas, en
el diagnstico precoz, pronstico y tratamiento individualizado del carcinoma oral. Entre las tcnicas ms tiles en
este proceso se encuentran: la electroforesis en gel, las tcnicas de hibridacin, la tecnologa microarray, los
biochips, la PCR convencional, la cuantitativa o la transcriptasa inversa, las tcnicas de Southern, Northern y
Western blot, la secuenciacin de ADN, la clonacin de genes, la inmunohistoqumica, el ensayo ELISA y la
citometra de flujo. Destacan en particular por su gran utilidad, la tecnologa microarray, los biochips y la PCR.
Palabras clave: Tcnicas biologa molecular, cncer oral, carcinoma oral de clulas escamosas, PCR, micro-
chips, microarrays.

SUMMARY
This article summarizes the main techniques in the area of molecular biology that are available for the
investigation of oral cancer and precancer. They have been classified depending on the biological material we
expect to analyze, which can be DNA, RNA or proteins. The explanation for each technique includes a brief
description of its basics, as well as some advantages, drawbacks and current use of the technique. Our aim is
to throw light on the applications of these techniques, soon indispensable for most studies, in the early
diagnosis, prognosis and individualized treatment of oral carcinoma. The most useful techniques for this
objective are nowadays: gel electrophoresis, hybridation, microarray technology, biochips, PCR (conventional,
quantitative or reverse transcriptase), Southern, Northern and Western blot studies, DNA sequenciation, cloning,
immunohistochemistry, ELISA and flow citrometry. Some techniques that deserve a special mention due to
their greater usefulness in the area of oral cancer are microarray technology, biochips and PCR.
Key words: Molecular biology techniques, oral cancer, oral squamous cell carcinoma, PCR, microchips,
microarrays.
Fecha de recepcin: 17 de abril de 2009.
Aceptado para publicacin: 22 de abril de 2009.
* Licenciado en Odontologa. Facultad de Odontologa. Departamento de Medicina y Ciruga Bucofacial. UCM.
** Doctor en Odontologa. Profesor contratado doctor. Facultad de Odontologa. Departamento de Medi-
cina y Ciruga Bucofacial. UCM.
*** Doctor en Odontologa. Profesor asociado. Facultad de Odontologa. Departamento de Medicina y
Ciruga Bucofacial. Facultad de Odontologa. UCM.
**** Doctor en Medicina y en Estomatologa. Catedrtico de Medicina y Ciruga Bucofacial. Facultad de
Odontologa. Departamento de Medicina y Ciruga Bucofacial. UCM.
Lpez-Durn M, Campo-Trapero J, Cano-Snchez J, Dez-Prez R, Bascones-Martnez A. Aplicacin de las
tcnicas de biologa molecular en oncologa oral. Av. Odontoestomatol 2010; 26 (4): 189-196.

AVANCES EN ODONTOESTOMATOLOGA/189
AVANCES EN ODONTOESTOMATOLOGA
Vol. 26 - Nm. 4 - 2010
INTRODUCCIN
Una vez secuenciado el genoma humano, hay que
acotar y otorgar su funcin a cada fragmento de ADN
correspondiente a un gen. El Proyecto Genoma Hu-
mano ha revelado que los diez billones de pares de
bases que forman el ADN codifican entre 30.000 y
40.000 genes (1). El ADN de las clulas de un orga-
nismo contiene la informacin gentica necesaria para
la construccin de sus protenas, que determinarn la
funcin biolgica del gen o la patologa de la enfer-
medad. La molcula de ARNm (ARN mensajero) es
una copia de esta informacin mediante un proceso
conocido como transcripcin. La informacin codifi-
cada en la molcula de ARNm es interpretada en un
proceso denominado traduccin que tiene como fin
la construccin de la protena.
Sin embargo, el mero conocimiento de la secuencia
de bases del ADN no es suficiente para definir la fun-
cin biolgica o la patologa de la enfermedad. Para
alcanzar este conocimiento se han desarrollado tcni-
cas basadas en los perfiles de expresin, que a su vez
han favorecido la deteccin de nuevos protooncoge-
nes, genes supresores tumorales y modificaciones
genticas involucradas en la carcinognesis oral. A
toda esta tecnologa se le une la bioinformtica, capaz
de descifrar la ingente cantidad de los datos genera-
dos por las tcnicas de biologa molecular (2). La
caracterizacin de los patrones moleculares alterados
que conducen a la transformacin maligna puede
emplearse tanto para el diagnstico temprano del
cncer como para un tratamiento eficaz de esta pato-
loga (1). Todo esto tambin est suponiendo una
revolucin en la investigacin de la carcinognesis oral
al permitirnos llevar a cabo un anlisis en una escala
genmica o protemica, complementaria a los mto-
dos convencionales de diagnstico clnico o histopa-
tolgico, con el objetivo de determinar biomarcado-
res que puedan ser aplicados a nivel diagnstico y/o
teraputico en las lesiones de precncer y cncer oral.
APLICACIONES DE LA BIOLOGA
MOLECULAR EN ONCOLOGA ORAL
Subclasificacin de los tumores orales identificados
histolgicamente
El cncer de cabeza y cuello (CCC) es el sexto ms
comn en el mundo, y est asociado a una baja
190 /AVANCES EN ODONTOESTOMATOLOGA
supervivencia y una alta morbilidad, constituyendo
el cncer oral el 40% de los CCC (3). En la actuali-
dad, la tecnologa microarray ha descubierto cuatro
subtipos de carcinoma oral de clulas escamosas
(COCE) segn sus distintos comportamientos clni-
cos, identificados por los perfiles de expresin gnica.
Chung et al, describieron un subtipo de COCE aso-
ciado al EGFR (receptor del factor de crecimiento
endotelial), otro con un mesnquima enriquecido, un
tercer tipo similar al epitelio normal y un ltimo sub-
clasificado en base a sus altos niveles de enzimas
antioxidantes (4, 5). Estos grupos mostraron diferen-
cias estadsticamente significativas en la tasa de su-
pervivencia sin recurrencia del tumor, y una exactitud
del 80% en la prediccin de metstasis linfticas (5).
Diagnstico y pronstico molecular del cncer
El COCE, como sucede con el resto de los cnceres,
es una enfermedad causada por la acumulacin de
anomalas en la secuencia y expresin de un nmero
de genes crticos. La tecnologa microarray ha con-
seguido identificar muchos genes con alteraciones
en su expresin, siendo la mayora reguladores del
ciclo celular, marcadores de diferenciacin, genes
con funcin antioxidante o reparadora del ADN, y
genes involucrados en la adhesin celular, en las
seales de transduccin o en la respuesta inflamato-
ria (1, 6, 7) Entre ellos, cabe mencionar por su im-
portancia o relevancia los siguientes: Proliferacin y
ciclo celular: el EGFR, C-myc, las ciclinas A y D1,
Ki67, Bcl-2, H-RAS; supresin tumoral: p53, Bax,
Rb, p16, p21, p27, maspina; angiognesis: EGFR,
VEGF; invasin y metstasis: caderinas, cateninas,
MMPs, integrinas, protena S100. Hasta el momento
actual no se ha encontrado un gen o grupo de genes
implicados en el desarrollo de la enfermedad en la
mayora de los casos y que pudiera ser, por lo tanto,
utilizado como biomarcador en el diagnstico pre-
coz y/o manejo de los pacientes con COCE.
Todas las formas de cncer desarrollan alteraciones
comunes, como son: la habilidad para la autosufi-
ciencia en las seales de crecimiento e insensibili-
dad a las seales que se oponen a l, evasin de la
apoptosis, angiognesis, potencial replicativo ilimi-
tado, invasin tisular y capacidad de metstasis (8).
Las alteraciones que promueven este crecimiento
celular anormal, detectables mediante las tcnicas
 Lpez-Durn M, Campo-Trapero J, Cano-Snchez J, Dez-Prez R, Bascones-Martnez A
Aplicacin de las tcnicas de biologa molecular en oncologa oral
de biologa molecular, son: la mutacin, delecin,
amplificacin, translocacin y las modificaciones en
la expresin gnica o en el nivel de metilacin. Se ha
observado que los cambios en los patrones de
metilacin pueden aparecer incluso dos aos antes
del desarrollo de un COCE, por lo que se ha propues-
to utilizar estas modificaciones como biomarcadores
para la deteccin y pronstico de esta patologa (9)
Ninguna de las mltiples tcnicas que existen actual-
mente para la deteccin de los patrones de metilacin
es universal. Para la seleccin de la ms adecuada se
debe considerar el tipo, cantidad y calidad del mate-
rial biolgico. Las tcnicas ms avanzadas para la
deteccin de metilaciones en los genes son el MALDI-
TOF MS (Matrix-assisted laser desorption/ionization
time-of-flight mass spectrometry), la HPLC (High-per-
formance liquid chromatography) (9) y la MSP-PCR
(Methylation - Specific PCR) (9-11).
En lesiones potencialmente malignas, como la leu-
coplasia oral, se ha empleado la tecnologa
microarray para identificar genes que sirvieran de
biomarcadores para las lesiones displsicas con po-
tencial para progresar a COCE, establecindose la
tecnologa microarray como el mtodo de eleccin
para analizar los marcadores potenciales de progre-
sin de la displasia epitelial. (1, 7).
Mejora en el desarrollo de frmacos
El empleo de la biologa molecular para el tratamiento
oncolgico pretende, por una parte, identificar los
subgrupos sensibles a beneficiarse del tratamiento, y
por otra, establecer nuevas dianas teraputicas de-
terminando los genes asociados con un mal prons-
tico o ausencia de respuesta al tratamiento (12). Ade-
ms, facilita la prediccin de efectos adversos durante
los estudios de toxicidad (12). El desarrollo farmaco-
lgico actual se centra en agentes diseados contra
genes especficos involucrados en el cncer, alejn-
dose cada vez ms de los frmacos con toxicidad
general (12). Cabe destacar tambin la importancia
de la tecnologa microarray en este campo (1, 12).
Estudio de la estabilidad cromosmica
La longitud de los telmeros es un importante indi-
cador en el estudio tanto de la estabilidad cromos-
mica como de la actividad de la telomerasa y la ca-
pacidad proliferativa de las clulas, pudiendo utilizar-
se para el pronstico de malignidad en las clulas
tumorales (13). Entre los mtodos empleados para
medir la longitud de los telmeros se encuentran
los siguientes: southern blot, hybridization protection
assay, fluorescence in situ hybridization (FISH),
citrometra de flujo, reaccin en cadena de la poli-
merasa (PCR) y la microscopa electrnica.
TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR
DISPONIBLES PARA SU APLICACIN EN
ONCOLOGA ORAL
Existen en la actualidad numerosas tcnicas para el
estudio de las alteraciones producidas en el cncer o
precncer oral. En las tablas 1 y 2 aparecen explica-
das las tcnicas principales, clasificadas en grupos
segn el tipo de material gentico que pretendamos
analizar: ADN, ARN o protenas. Algunas de ellas son
aplicables a todo tipo de muestra biolgica, mien-
tras que otras son especficamente utilizadas para
cada uno de los tipos de material de partida.
De todas las tcnicas que se resumen en las Tablas
1 y 2, merecen especial atencin y un desarrollo mayor
la tecnologa microarray, los biochips y la PCR.
La tecnologa microarray permite la miniaturizacin
del proceso de hibridacin de las secuencias de
nucletidos en superficies microscpicas, que nor-
malmente son ledas por un lser capaz de interpre-
tar los fluorforos. Pueden usarse para detectar ADN,
ARN o protenas y permiten analizar incluso todo el
genoma humano conocido en un nico experimen-
to (14, 15). El microarray permite analizar los niveles
de expresin de un gen, determinando la cantidad
de material gentico presente (4). Son ensayos sen-
cillos que requieren un material muy accesible, de
alta validez y reproducibilidad (6, 15).
En general, el procedimiento del microarray puede
dividirse en las siguientes fases:
1. Fabricacin del array.
2. Aislamiento y marcaje del material gentico.
3. Aplicacin de la muestra marcada al array y
medicin de la hibridacin.
AVANCES EN ODONTOESTOMATOLOGA/191
AVANCES EN ODONTOESTOMATOLOGA
Vol. 26 - Nm. 4 - 2010

TABLA 1.- TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR APLICABLES TANTO A MUESTRAS

DE ADN, ARN O PROTENAS

Base metodolgica Aplicacin Ventajas Inconvenientes

Electroforesis Separacin de cidos Comparacin de mues- Tcnica sencilla Necesita comparar

en gel nucleicos o protenas tras biolgicas distintas datos con otros co-
segn su tamao y (sano/enfermo). nocidos. Se tiende a
carga elctrica me- la miniaturizacin y
diante campo elctri- a los chips.
co, en medio poroso.

Hibridacin Unin de sondas es- Se usa en PCR, chips Alta especifici- Requiere un mto-
pecficas marcadas a de ADN, Southern y dad. do de visualizacin
los cidos nucleicos o Northern Blot. (radiactividad o qui-
protenas a identificar. mioluminiscencia).

Microarray Miniaturizacin del Monitorizacin de nive- Tcnica cuanti- Los de ADNc no

proceso de hibrida- les de biomarcadores, tativa, sencilla, permiten detectar
TCNICAS cin para analizar un deteccin de cambios accesible, de alta modificaciones post-
COMUNES nmero elevado de en material gentico, validez, reprodu- transcripcionales.
muestras en un nico determinacin de dia- cibilidad y sensi-
experimento. nas farmacolgicas, bilidad.
evaluacin de interac-
ciones entre protenas.

Biochips Ensayo bioqumico Farmacogenmica y Estudio de va- Problemas para ana-

miniaturizado. farmacogentica (Iden-
tificacin de dianas te-
raputicas; desarrollo
de frmacos), diagns-
tico de enfermedades,
deteccin de mutacio-
nes y polimorfismos,
anlisis de perfiles de
expresin.
rios elementos lizar protenas (la es-
simultneamen- tructura 3D favorece
te en la misma uniones mltiples;
muestra; requie- fcil desnaturalizacin
re cantidades m- o inactivacin por la
nimas de mues- manipulacin), pre-
tra y reactivos; cio.
rendimiento alto
de la muestra.

4. Anlisis e interpretacin de los datos (12). Una
tcnica frecuentemente empleada para el estu-
dio del cncer oral es la aplicacin de la inmuno-
histoqumica a muestras recogidas en tissue
microarrays (TMA) (Fig. 1).
El concepto de los microarrays basados en anticuer-
pos fue propuesto por Ekins y Chu en la segunda
mitad de la dcada de 1980. Probaron matemtica-
mente que estos arrays permitan determinar mlti-
ples niveles proteicos de forma simultnea y con una
alta sensibilidad. Posibilitan, por tanto, identificar y
cuantificar protenas, as como estudiar su funcin.
La limitacin de los microarrays de ADNc es que no
son capaces de detectar modificaciones que ocu-
rran despus de la transcripcin (metilacin, fosfori-
lacin, etc), permitiendo en este caso slo una vi-
sin parcial del proceso (7).
Las aplicaciones de los microarrays incluyen:
La monitorizacin de los niveles de biomarcado-
res en los pacientes con lesiones de cncer o
precncer oral.

192 /AVANCES EN ODONTOESTOMATOLOGA

 Lpez-Durn M, Campo-Trapero J, Cano-Snchez J, Dez-Prez R, Bascones-Martnez A
Aplicacin de las tcnicas de biologa molecular en oncologa oral
TABLA 2.- TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR APLICABLES ESPECFICAMENTE
A MUESTRAS DE ADN, ARN O PROTENAS
Base metodolgica
PCR (reaccin Mtodo enzimtico de ampli-
en cadena de ficacin de secuencias espe-
la polimerasa) cficas de ADN (ej: gen) para
obtener millones de copias,
mediante la ADN polimerasa
PCR cuantitativa Variante de la PCR en la que
o en tiempo real se cuantifica de forma abso-
luta o relativa (comparando
con un gen normalizador) el
producto de la amplificacin
TCNICAS de ADN
PARA ADN
Cloning Duplicar un gen o una por-
cin de ste
Southern blot Electroforesis e hibridacin
para secuencias especficas
de ADN
Secuenciacin Conocimiento de la secuen-
cia de bases nitrogenadas de
un fragmento de ADN me-
diante un mtodo qumico o
enzimtico
Northern blot Electroforesis e hibridacin
para secuencias especficas
de ARNm
RT-PCR Amplificacin de fragmentos
(PCR transcrip- de ARN de inters para ob-
tasa inversa) tener millones de copias,
con un paso previo de con-
TCNICAS versin de ARNm en ADNc
PARA ARN bicatenario
Hibridacin in Visualizacin de una secuen-
situ cia de ADN o ARN en el sitio
fsico donde se encuentra,
mediante hibridacin por
complementariedad de bases.
Variaciones de la tcnica:
FISH, Q-FISH, TELI-FISH (pa-
rafina), Flow-FISH
Western blot Electroforesis en gel para
separar protenas segn su
peso molecular y deteccin
mediante anticuerpos espe-
cficos
Inmuno -histo - Deteccin de molculas me-
qumica diante uniones especficas
TCNICAS antgeno-anticuerpo
PARA ELISA (Enzyme Ensayo inmunoenzimtico
PROTENAS linked immuno que puede ser directo/ indi-
sorbent assay) recto, cualitativo/ cuantitati-
vo/ semicuantitativo
Citometra de Paso de clulas por un flui-
flujo do colocado bajo una fuen-
te de luz que permite su vi-
sualizacin
Aplicacin
Amplificacin de genes; mo-
dificacin de fragmentos de
ADN; genotipificacin; detec-
cin de mutaciones, marcado-
res genticos, expresin de
genes.
Cuantificacin de expresin
gnica, valoracin de la efi-
cacia de frmacos, detec-
cin de agentes infecciosos
y polimorfismos, diagnsti-
co tumoral, medicin de te-
lmeros
Obtener un fragmento de
ADN buscado
Deteccin del tamao y can-
tidad de un fragmento de
ADN de inters (ej: telmero)
Entender la estructura; detec-
tar mutaciones y mecanismos
fisiopatolgicos generados
por inferencia en la secuen-
cia y homologa de genes
Deteccin del tamao y n-
mero de transcripciones
Cuantificacin de expresin
gnica, valoracin de la efi-
cacia de frmacos, detec-
cin de agentes infecciosos,
diagnstico tumoral
Analizar la presencia y/o dis-
tribucin de una secuencia
de ADN o ARN transcrito de
inters en tejidos o clulas.
Muy utilizada en los TMA,
donde puede hacerse de
forma automatizada
Examinar cambios en nive-
les proteicos
Localizacin de protenas
especficas en tejidos o c-
lulas
Cuantificacin de molculas
Recuento celular, evaluacin
de marcadores fenotpicos,
ciclos celulares, apoptosis
AVANCES EN ODONTOESTOMATOLOGA/193
Ventajas Inconvenientes
Lmite de deteccin Requiere material gen-
muy alto tico bicatenario y tcni-
cas de visualizacin; es
semicuantitativa; fre-
cuentes falsos positivos
por contaminacin leve
Tcnica cuantitativa; Requiere una curva de
mayor sensibilidad y calibrado para la cuan-
rapidez; menor pro- tificacin absoluta y una
babilidad de conta- alta calidad del material
minacin; no requie- de partida; aconsejable
re electroforesis para la estandarizacin
su visualizacin
Posibilidad de ampliar Se obtiene slo una co-
la muestra exacta pia
Permite cuantificar Tcnica lenta que re-
tamao y abundancia quiere grandes cantida-
des de ADN
Permite el conoci- Slo permite el conoci-
miento de la estruc- miento de la secuencia
tura ms bsica de de bases, pero no su
un nucletido o gen funcin
Es la tcnica ms Tcnica lenta que re-
sensible para detec- quiere grandes cantida-
tar niveles de expre- des de ARN
sin de ARNm
Requiere cantidades Tcnica semicuantita-
mnimas de ARN tiva
Sondas ms sensi- Las sondas de ARN son
bles y especficas que ms lbiles que las de
las de ADN; la visua- ADN
lizacin en el tejido
permite correlacionar
resultados con mues-
tras histolgicas e in-
munolgicas
Tcnica con gran Tcnica semicuantitati-
sensibilidad; permite va, poco especfica; la-
detectar tambin el boriosa; requiere tcni-
peso molecular de cas de visualizacin
las protenas
Posible a partir de Tcnica semicuantita-
muestras congela- tiva
das o en formol
Sencilla, rpida, Requiere tcnicas de vi-
econmica, automa- sualizacin de la reac-
tizable, anlisis si- cin enzimtica
multneo de varias
muestras
Tcnica rpida; per- Requiere clulas en sus-
mite valorar el conte- pensin
nido total de ADN de
una poblacin celular
AVANCES EN ODONTOESTOMATOLOGA
Vol. 26 - Nm. 4 - 2010

Fig. 1. Construccin y anlisis de un TMA a partir de muestras fijadas en formaldehdo y embebidas en parafina. A) Marcaje de la zona de
inters en portaobjetos y parafinas. B) Fijacin del bloque recibidor en el microtomo. C) Confeccin del cilindro recibidor. D) Toma de la regin
marcada. E) Colocacin en el cilindro preconfeccionado. F) Recoger el resto de las muestras en el bloque recibidor de la misma manera. G)
Corte del TMA. H) Tincin con hematoxilina/eosina y/o inmunotincin. I) Visualizacin mediante microscopio.

La determinacin de cambios en los niveles celu-
lares de expresin gnica o proteica; el anlisis
de distintos candidatos farmacolgicos.
El descubrimiento y validacin de nuevas dianas
teraputicas para el tratamiento del COCE.
La evaluacin de las interacciones entre prote-
nas.
La monitorizacin de las modificaciones protei-
cas. (1, 4, 6, 12, 15).
La Genmica y la Protemica utilizan para su estu-
dio en el campo de los biochips, los ADN-chips y los
microarrays proteicos, respectivamente. Con las pro-
tenas, el escenario se vuelve ms complicado por
varias razones, entre las que se encuentran las si-
guientes:
La amplia variedad proteica permite muchas for-
mas de funcionalizacin e hibridacin.
La tcnica no consigue una amplificacin de pro-
tenas igualable a la PCR.
Requiere una herramienta de anlisis estadstico
para cuantificar las uniones de la estructura tridi-
mensional proteica.
Los mtodos de transporte e inmovilizacin pue-
den producir la desnaturalizacin o inactivacin
de las protenas (16).
Otra tcnica muy utilizada por su enorme poten-
cial replicativo es la PCR (por Polymerase Chain
Reaction), bien la convencional, la semicuantitativa
pero con un lmite de deteccin mucho mayor que
el resto de las tcnicas, o cualquiera de sus varieda-

194 /AVANCES EN ODONTOESTOMATOLOGA

 Lpez-Durn M, Campo-Trapero J, Cano-Snchez J, Dez-Prez R, Bascones-Martnez A
Aplicacin de las tcnicas de biologa molecular en oncologa oral
des. Esta tcnica fue descrita inicialmente por
Khorana y colaboradores en 1974, y perfeccionada
por Mullis en 1986, siendo de las ms empleadas
actualmente. Permite la amplificacin de un fragmen-
to de ADN de inters (por ejemplo un gen), obte-
niendo millones de copias, en slo 30 50 ciclos de
reaccin. La PCR requiere material gentico bicate-
nario (ADN molde o template), que se separa en las
dos hebras mediante incrementos de temperatura, y
donde cada uno de los filamentos aislados sirve de
molde para la sntesis y amplificacin de nuevas
hebras de ADN (17). La PCR es una tcnica vlida
para diferentes aplicaciones mdicas que requieran
una concentracin alta de un fragmento concreto de
ADN (17). Entre las variaciones de esta tcnica se
encuentran la PCR en tiempo real (PCR cuantitativa),
capaz de determinar el nmero de copias de ADN
presentes en una muestra, o la PCR transcriptasa
inversa, adaptada para analizar ARN mensajero mo-
nocatenario mediante un paso previo de conversin
a ADN complementario bicatenario. Esta tcnica
puede usarse en los casos en que se dispone de
niveles de ARN insuficientes para la tcnica de
Northern blot. Adems de proporcionar informacin
cuantitativa, la PCR en tiempo real presenta otra serie
de ventajas frente a la PCR tradicional, entre las que
se encuentra su mayor sensibilidad (menos falsos
negativos), rapidez y menor probabilidad de conta-
minacin (menos falsos positivos) (17). Existe una
PCR especialmente diseada para la deteccin de
las metilaciones en los genes implicados en la carci-
nognesis oral. Es la Methylation-Specific PCR o MSP,
que precisa de un tratamiento especial de la muestra
con bisulfito sdico para diferenciar las bases meti-
ladas de las no metiladas (10, 11). La Nested-MSP
(MN-MSP) aparece como mtodo alternativo a la MSP
en aquellos casos en que se analicen muestras con
baja cantidad o calidad de ADN inicial, como puede
ocurrir con las conservadas en parafina (11).
CONCLUSIN
Debido a que el cncer oral es una enfermedad aso-
ciada a cambios moleculares, genticos y tisulares, el
descubrimiento de biomarcadores que puedan detec-
tar estas alteraciones proporciona una potente herra-
mienta para el diagnstico, seguimiento y prediccin
del pronstico y de la respuesta al tratamiento.
Se podra afirmar que, a da de hoy, la tecnologa
precede al conocimiento, ya que es el rpido desa-
rrollo de estas tcnicas lo que permite avanzar en el
conocimiento de las enfermedades a nivel molecu-
lar, as como la creacin de dianas teraputicas cada
vez ms especficas y fiables. En la actualidad existen
numerosas herramientas disponibles para dilucidar
las funciones biolgicas de un gen en sus diferentes
niveles de expresin (DNA, mRNA o protenas), en-
tre las que se encuentran: la electroforesis en gel, las
tcnicas de hibridacin, la tecnologa microarray, los
biochips, la PCR convencional, la cuantitativa o la
transcriptasa inversa, las tcnicas de Southern,
Northern y Western blot, la secuenciacin de ADN,
la clonacin de genes, la inmunohistoqumica, el
ensayo ELISA y la citometra de flujo. No todas las
tcnicas son aplicables a cualquier muestra biolgi-
ca, sino que deberemos tener en cuenta el tipo, can-
tidad y mtodo de conservacin del material de par-
tida, as como los objetivos, tiempo y economa de
la investigacin.
Actualmente, las tcnicas con mayor utilidad en el
estudio del cncer oral son la PCR cuantitativa, los
biochips y la tecnologa microarray. La PCR en tiem-
po real o cuantitativa comprende, adems de las
ventajas inherentes a la PCR convencional, el poder
de cuantificacin del producto inicial, un aumento
en la sensibilidad, una mayor rapidez y menor pro-
babilidad de contaminacin. La hibridacin con
microarrays ha esclarecido la relacin existente en-
tre el perfil de expresin gnica y la presencia de
diversas patologas. Esta tcnica es adems de gran
inters en el ensayo de frmacos anticancergenos.
Los biochips consiguen un alto rendimiento de la
muestra y de los reactivos y, al igual que los
microarrays permiten medir la expresin de dece-
nas de miles de genes simultneamente, pudin-
dose recoger dicha informacin en bases de datos
con perfiles de expresin gnica que permitan
comprender las funciones e interacciones de es-
tos genes.
Una vez se empiezan a crear estas bases de datos, es
importante aadir a toda investigacin molecular la
denominada bsqueda in silico, a travs de las nu-
merosas herramientas bioinformticas actualmente
disponibles, que permiten el acceso a estas bases de
datos, muchas de ellas de acceso pblico.
AVANCES EN ODONTOESTOMATOLOGA/195
AVANCES EN ODONTOESTOMATOLOGA
Vol. 26 - Nm. 4 - 2010
BIBLIOGRAFA
1. Nazmul-Hossain ANM, Patel KJ, Rhodus NL,
Moser KL. Microarrays: applications in dental
research. Review article. Oral Diseases 2008;14:
25-9.
2. Glazer CA, Chang SS, Ha PK, Califano JA.
Applying the molecular biology and epigenetics
of head and neck cancer in everyday clinical practice.
Oral Oncol (2008), doi:10.1016/j.oraloncology.
2008.05.013.
3. Ziober AF, Patel KR, Alawi F, Gimotty P, Weber
RS, Feldman MM, et al. Identification of a gene
signature for rapid screening of oral squamous
cell carcinoma. Clin Cancer Res. 2006;15;12:
5960-71.
4. Kuo WP, Whipple ME, Epstein JB, Jenssen TK,
Santos GS, Ohno-Machado L et al. Deciphering
gene expression profiles generated from DNA
microarrays and their applications in oral medi-
cine. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol
Endod 2004;97:584-91.
5. Chung CH, Parker JS, Karaca G, Wu J, Funkhouser
WK, Moore D et al. Molecular classification of head
and neck squamous cell carcinomas using
patterns of gene expression. Cancer Cell. 2004;5
(5):489-500.
6. Weber A, Hengge UR, Stricker I, Tischoff I,
Markwart A, Anhalt K et al. Protein microarrays
for the detection of biomarkers in head and neck
squamous cell carcinomas. Hum Pathol 2007;
38(2):228-38.
7. Carinci F, Lo Muzio L, Piattelli A, Rubini C, Palmieri
A, Stabellini A et al. Genetic portrait of mild and
severe lingual dysplasia. Oral Oncol. 2005;41:
365-74.
8. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of
cancer. Cell 2000;200:57-70.
9. Sulewska A, Niklinska W, Kozlowski M, Minarowski
L, Naumnik W, Niklinski J et al. Detection of DNA
methylation in eucaryotic cells. Folia Histochem
Cytobiol. 2007;45(4):315-24.
196 /AVANCES EN ODONTOESTOMATOLOGA
10. Herman JG, Graff JR, Myhnen S, Nelkin BD,
Baylin SB. Methylation-specific PCR: a novel PCR
assay for methylation status of CpG islands. Proc
Natl Acad Sci U S A. 1996;93(18):9821-6.
11. Licchesi JD, Herman JG. Methylation-specific
PCR. Methods Mol Biol. 2009;507:305-23.
12. Clarke PA, te Poele R, Workman P. Gene
expression microarray technologies in the
development of new therapeutic agents. Eur J
Cancer. 2004;40(17):2560-91.
13. Kah-Wai L, Ju Y. The telomere length dynamic
and methods of its assessment. J Cell Mol Med
2005; 9(4):977-89.
14. Ha PK, Chang SS, Glazer CA, Califano JA,
Sidranskyet D. Molecular techniques and genetic
alterations in head and neck cancer. Oral Oncol
2008, doi:10.1016/j.oraloncology.2008.05.015.
15. Radhakrishnan R, Solomon M, Satyamoorthy K,
Martin LE, Lingen MW. Tissue microarray - a high-
throughput molecular analysis in head and neck
cancer. J Oral Pathol Med. 2008;37(3):166-76.
16. Pasquarelli A. Materials Science and Engineering
C (2007), doi:10.1016/j.msec.2007.06.001
17. http://www.medmol.es/tecnicas.cfm.
18. Tachibana M, Shinagawa Y, Kawamata H,
Omotehara F, Horiuchi H, Ohkura Y, et al. RT-
PCR amplification of RNA extracted from formalin-
fixed, paraffin-embedded oral cancer sections:
analysis of p53 pathway.Anticancer Res 2003;23
(3C):2891-6.
19. J. Bayani, J.A. Squire. Application and inter-
pretation of FISH in biomarker studies. Mini-
review. Cancer Letters 2007;249:97-109.
20. Chandler HL, Colitz CMH. Molecular Biology for
the Clinician: Understanding Current Methods. J
Am Anim Hosp Assoc 2006;42:326-35.
CORRESPONDENCIA
Mercedes Lpez-Durn
lopezduran.m@gmail.com