Penentuan Nilai IC50 Aktivitas Antioksidan

dengan Metode DPPH

ABSTRAK

Paper ini merupakan hasil studi literatur yang bertujuan untuk mengetahui cara perhitungan aktivitas
antioksidan dengan parameter IC50. Sebagai studi kasus utama adalah artikel yang dipublikasikan oleh Abdul
Rohman dan Sugeng Riyanto 2005, pada Jurnal yang dipublikasikan di Majalah Farmasi Indonesia dengan judul
Daya antioksidan ekstrak etanol Daun Kemuning (Murraya paniculata (L) Jack) secara in vitro. Penentuan
Nilai IC50 pada Aktivitas Antioksidan ini bertujuan untuk mengetahui cara menentukan nilai IC50 serta
hubunganya dengan aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH (2,2 diphenyl 1-picrylhydrazil).
Semakin besar nilai IC50 makan semakin kecil aktivitas antioksidannya.

DEFINISI
IC50 : Konsentrasi dari antioksidan yang dapat meredam atau menghambat 50%
radikal bebas.
Antioksidan : Senyawa yang mampu menangkal radikal bebas
Radikal Bebas : Molekul-molekul yang tidak stabil karena muatan elektronnya tidak
berpasangan
In Vivo : Bahasa latin yang artinya dalam organisme hidup, mengacu pada penelitian
yang dilakukan menggunakan subyek manusia atau hewan suatu senyawa
sebagai antioksidan atau anti radikal bebas
BHT : Butilhidroksitoluena, Sumber antioksidan alami dapat berupa buah dan sayur
juga berupa antioksidan sintetik
Larutan Blanko: Larutan yang tidak berisi analit. Biasanya digunakan untuk tujuan kalibrasi
sebagai larutan pembanding dalam analisis fotometri

PENDAHULUAN

Latar belakang
Perubahan pola konsumsi makanan sebagai dampak dari kemajuan sains dan
teknologi menyebabkan semakin meningkatnya masyarakat yang menderita penyakit
degeneratif seperti jantung koroner, hipertensi, kanker, diabetes dan aterosklerosis.
Terjadinya penyakit tersebut didasari oleh proses biokimiawi dalam tubuh yang melibatkan
peranan radikal bebas. Radikal bebas merupakan sekelompok zat kimia yang sangat reaktif
karena memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan luarnya. Elektron tidak
berpasangan tersebut menyebabkan instabilitas dan bersifat reaktif sehingga menyebabkan
kerusakan sel,gangguan fungsi sel, bahkan kematian sel. Molekul utama di dalam tubuh yang
dirusak oleh radikal bebas dan produk oksidatifnya adalah DNA, lemak, dan protein. Radikal
bebas yang dihasilkan oleh metabolisme aerobik, radiasi dan kimiawi cenderung
menyebabkan peroksidasi lipid in vivo, shingga diperlukan suatu mekanisme perlindungan
antioksidan untuk menangkal radikal bebas. Untuk mengetahui suatu konsentrasi antioksidan
dalam hal ini digunakan parameter IC50. Oleh karena itu kami ingin mengkaji perhitungan
untuk menentukan nilai IC50 yang diperoleh dari uji aktivitas antioksidan serta korelasinya.
Tujuan
Untuk mengetahui cara menentukan nilai IC50 serta hubunganya dengan aktivitas
antioksidan dengan menggunakan metode DPPH.

Tinjaun Pustaka
Menurut Tri Rahmawati berdasarkan studi literarur, antioksidan adalah senyawa yang
mampu menangkal atau merendam dampak negatif oksidan dalam tubuh. Antioksidan
bekerja dengan cara mendonorkan satu elektron kepada senyawa yang bersifat oksidan
sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut bisa dihambat. Antioksidan sangat penting
karena berkaitan dengan fungsinya sistem imunisasi tubuh. Kondisi tersebut terutama untuk
menjaga intergritas dan berfungsinya membran lipid, Serta untuk melindungi sel-sel badan
terhadap kerusakan yang diakibatkan oleh radikal bebas. (Damayanthi dkk, 2010)
IC50 merupakan konsentrasi dari antioksidan yang dapat meredam atau
menghambat 50% radikal bebas. Antioksidan kuat memiliki senyawa alfatokoferol dengan
nilai IC50 atau setara dengan angka 5,1 ppm.Antioksidan sedang memilki nilai senyawa IC 50
sebesar 48,6 ppm. . (Damayanthi dkk, 2010)
Pengukuran aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan beberapa metode
diantaranya CUPRAC, DPPH, dan FRAP. (Widyastuti, 2010)
Metode CUPRAC menggunakan bis(neokuproin) tembaga(II) (Cu(Nc) 22+) sebagai
pereaksi kromogenik. Pereaksi Cu(Nc)22+yang berwarna biru akan mengalami reduksi
menjadi Cu(Nc)2+ yang berwarna kuning dengan reaksi:
n Cu(Nc)22+ + AR(OH)n n Cu(Nc)2+ + AR(=O)n + n H+ (Widyastuti, 2010)
Metode DPPH menggunakan 2,2difenil-1-pikrilhidrazil sebagai sumber radikal bebas.
Prinsipnya adalah reaksi penangkapan hidrogen oleh DPPH dari zat antioksidan dengan
reaksi sebagai berikut:

(Widyastuti, 2010)

Metode FRAP (Benzie & Strain 1996) menggunakan Fe(TPTZ)23+ kompleks besiligan
2,4,6-tripiridil-triazin sebagai pereaksi. Kompleks biru Fe(TPTZ)23+ akan berfungsi sebagai
zat pengoksidasi dan akan mengalami reduksi menjadi Fe(TPTZ)22+ yang berwarna kuning
dengan reaksi berikut:
Fe(TPTZ)2 3+ + AROH Fe(TPTZ)22+ + H+ + AR=O (Widyastuti, 2010)
EKSPERIMEN

Prosedur Untuk Mendapatkan Data

Dari setiap kelompok terdapat empat anggota yang masing-masing sudah dibagi tugas
Untuk mencari artikel atau jurnal yang berhubungan dengan tema paper ini baik melalui
media elektronik ataupun media cetak.
Cara Mengolah Data
Pertama kami melakukan browsing untuk mencari data mentah. Data mentah untuk
menentukan nilai IC50 adalah persen inbihisi dan konsentrasi sampel. Setelah itu kami
membuat hubungan antara inhibisi dan konsentrasi sampel melalui grafik dimana inhibisi
terletak pada sumbu Y dan konsentrasi sampel pada sumbu X. Melalui microsoft excel kami
mencari persamaan regresi linear y = a(x) + b. Setelah kami mendapatkan persamaan variabel
Y merupakan sebuah tetapan yang bernilai 50, dan X adalah nilai IC50.

Alat Untuk Mendapatkan Data

Alat untuk mendapatkan data adalah laptop dan internet sebagai media utama untuk
browsing mendapatkan data mentah dan program excel untuk membuat grafik hubungan
antara persen inhibisi dan konsentrasi sampel untuk menentukan nilai IC50.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Mekanisme kerja antioksidan

Mekanisme kerja antioksidan memiliki dua fungsi. Fungsi pertama merupakan fungsi
utama dari antioksidan yaitu sebagai pemberi atom hidrogen. Antioksidan (AH) yang
mempunyai fungsi utama tersebut sering disebut sebagai antioksidan primer. Senyawa ini
dapat memberikan atom hidrogen secara cepat ke radikal lipida (R*, ROO*) atau
mengubahnya ke bentuk lebih stabil, sementara turunan radikal antioksidan (A*) tersebut
memiliki keadaan lebih stabil dibanding radikal lipida.
Fungsi kedua merupakan fungsi sekunder antioksidan, yaitu memperlambat laju
autooksidasi dengan berbagai mekanisme diluar mekanisme pemutusan rantai autooksidasi
dengan pengubahan radikal lipida ke bentuk lebih stabil (Gordon,1990).
Penambahan antioksidan (AH) primer dengan konsentrasi rendah pada lipida dapat
menghambat atau mencegah reaksi autooksidasi lemak dan minyak. Penambahan tersebut
dapat menghalangi reaksi oksidasi pada tahap inisiasi maupun propagasi. Radikal-radikal
antioksidan (A*) yang terbentuk pada reaksi tersebut relatif stabil dan tidak mempunyai
cukup energi untuk dapat bereaksi dengan molekul lipida lain membentuk radikal lipida
baru (Gordon, 1990).
Inisiasi :R* + AH RH + A*
Propagasi : ROO* + AH ROOH + A*

Uji Aktivitas Antioksidan dengan metode DPPH

Menurut Falisca Amelinda berdasarkan studi literatur IC50 bisa digunakan sebagai
parameter bukan hanya untuk antioksidan saja tapi untuk antikanker, antiplasmodium,
antitoksikitas dan lain sebagainya. Tetapi dalam hal ini kami membahas secara spesifik IC50
sebagai parameter antioksidan. Ada beberapa metode untuk menguji aktivitas oksidan antara
lain yaitu metode DPPH (2,2-difenil-1- pikrilhidrazil), FRAP (ferric reducing antioxidant
power) dan CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity dan linoeattiosianat. Dalam
paper ini uji aktivitas antioksidan difokuskan menggunakan metode DPPH (2,2-difenil-1-
pikrilhidrazil). Metode uji DPPH merupakan metode pengujian aktivitas antioksidan yang
paling cocok bagi komponen antioksidan yang bersifat polar, karena kristal DPPH hanya
dapat larut dan memberikan absorbansi maksimum pada pelarut etanol ataupun metanol
seperti yang dikemukakan oleh Amrun dan Umiyah (2005). Secara umum berikut merupakan
uji aktivitas antioksidan yang menggunakan metode DPPH. Uji aktivitas antioksidan ekstrak
suatu sampel dilakukan dengan metode DPPH (Blois 1985 dalam Hanani et al., 2005).
Ekstrak kasar sampel dilarutkan dalam metanol. hingga diperoleh konsentrasi yang bervariasi
dinyatakan dalam ppm. Antioksidan sintetik BHT (butilhidroksitoluena) digunakan sebagai
pembanding dan kontrol positif dilarutkan dalam pelarut metanol dengan konsentrasi
tertentu. Larutan DPPH dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol.
dengan konsentrasi tertentu juga. Larutan ekstrak dan larutan antioksidan BHT masing-
masing diambil beberapa ml dan direaksikan larutan DPPH dalam tabung reaksi yang
berbeda. Reaksi berlangsung pada suhu tertentu selama beberapa menit kemudian diukur
absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV VIS pada panjang gelombang 515-517
nm. Absorbansi larutan blanko diukur untuk melakukan perhitungan persen inhibisi. Larutan
blanko dibuat dengan mereaksikan pelarut metanol dengan larutan DPPH dalam tabung
reaksi. Aktivitas antioksidan dinyatakan dalam persen inhibisi untuk mengetahui nilai IC50.

Perhitungan Untuk Menentukan IC50

Menurut Mifta Fauziah berdasarkan studi literatur untuk menentukan IC50, diperlukan
persamaan kurva standar dari % inhibisi sebagai sumbu y dan konsentrasi fraksi antioksidan
sebagai sumbu x. IC50 dihitung dengan cara memasukkan nilai 50% ke dalam persamaan
kurva standar sebagai sumbu y kemudian dihitung nilai x sebagai konsentrasi IC50. Semakin
kecil nilai IC50 menunjukkan semakin tinggi aktivitas antioksidannya (Molyneux 2004).
Dalam hal ini diharapkan bahwa radikal bebas dapat ditangkap oleh senyawa antioksidan
hanya dengan konsentrasi yang kecil.

Persen inhibisi dan IC50

Persen inhibisi adalah perbandingan antara selisih dari absorbansi blanko dan
absorbansi sampel dengan absorbansi blanko. Persen inhibisi digunakan untuk menentukan
persentase hambatan dari suatu bahan yang dilakukan terhadap senyawa radikal bebas.
Persen inhibisi dihitung dengan rumus berikut:
Pi = [(Ab-As)/Ab] x 100%
Keterangan:
Pi : Persen inhibisi
Ab : Absorbansi blanko
As : Absorbansi sampel

Gambar. 1 (romansyah, 2011)

 Berikut ini % inhibisi contoh sampel karang lunak Sarcophyton sp. alami ulangan 1
dengan pelarut metanol p.a. 200 ppm.
% inhibisi = [(1,947-1,597) / 1,947] x 100%
= [0,35 / 1,947] x 100%
= 0,17976 x 100%
= 17, 97%

Nilai persen inhibisi yang telah dihitung dari setiap konsentrasi (200-800 ppm)
selanjutnya digunakan untuk perhitungan IC50. IC50 atau inhibitor Concentration 50% adalah
nilai konsentrasi suatu bahan untuk menghambat aktivitas DPPH sebesar 50%. Nilai
konsentrasi dari larutan yang telah diencerkan dari ekstrak dan persen inhibisi diplotkan
masing-masing pada sumbu x dan y. Kemudian nilai IC50 dihitung dengan regresi linear
y = a(x) + b, dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x sebagai IC 50.
Contoh:
Tabel Pengamatan 1

Konsentrasi Inhibisi
Sampel
200 17,98
400 19,16
600 21,16
800 25,42

Grafik Persamaan Regresi Untuk menentukan nilai IC50

inhibisi
30
25 y = 0,0122x + 14,85
20 R = 0,9228 inhibisi
15
Linear (inhibisi)
10
5 Linear (inhibisi)
0
0 500 1000

Y =0,0122x + 14,85
50 = 0,0122x + 14,85
X =2881, 14

X= Nilai IC50
IC50= 2881,14 ppm
KESIMPULAN

DAFTAR PUSTAKA
Amrun, M.H., & Umiyah. Pengujian Antiradikal Bebas Difenilpikril Hidrazil (DPPH)
Ekstrak Buah Kenitu (Chrysophyllum Cainito L.) Dari Daerah Sekitar Jember. 2005. J. Ilmu
Dasar, 6(2):110-114.
Damayanthi, Evi, Lilik Kustiyah, Mahani Khalid, Henry Farizal, Aktivitas Antioksidan
Bekatul Lebih Tinggi Dari Pada Jus Tomat Dan Penurunan Aktivitas Antioksidan Serum
Setelah Intervensi Minuman Kaya Antioksidan, 2010, 5(3), 205-210.
Hanani, E., A. Munim, & R. Sekarini. 2005. Identifikasi Senyawa Antioksidan Dalam Spons
Callyspongia Sp. Dari Kepulauan Seribu. Majalah Ilmu Kefarmasian, 2(3): 127-133.
Widyastuti, Niken. Pengukuran Aktivitas Antioksidan Dengan Metode CUPRAC, DPPH,
Dan FRAP Serta Korelasinnya Dengan Fenol Dan Flavonold Pada Enam Tanaman, 2010.