Isolasi Dan Karakterisasi Protein Bioaktif Dari Spons Aaptos Sp.

Sebagai Zat
Antioksidan

Isnaningsih1), Ahyar Ahmad2), Seniwati Dali2)

1)
Program Sarjana Universitas Hasanuddin
2)
Jurusan Kimia Universitas Hasanuddin

ABSTRAK

Penelitian uji bioaktivitas fraksi protein yang diisolasi dari spons Aaptos sp. yang
terdapat diperairan pulau Barang Lompo Sulawesi Selatan sebagai zat antioksidan.
Protein tersebut diisolasi menggunakan buffer Tris (hidroksimetil) amino metana.
Fraksinasi protein dari ekstrak kasar menggunakan metode sating out dengan
penambahan ammonium sulfat pada tingkat kejenuhan 0-20%, 20-40%, 40-60%, dan 60-
80%. Pemurnian protein dilakukan dengan cara dialisis menggunakan kantong selofan.
Kadar protein ditentukan berdasarkan metode Lowry. Kadar protein tertinggi terdapat
pada fraksi 40-60% sebesar 395,69 mg. Pengujian aktivitas antioksidannya menggunakan
metode DPPH. Aktivitas antioksidan yang kuat terdapat pada fraksi protein 20-40%
kejenuhan dengan nilai IC50 sebesar 0,110 mg/mL. Sedangkan aktivitas antioksidan lemah
ditunjukkan oleh fraksi protein 0-20%, 40-60%, dan 60-80% kejenuhan dengan nilai IC 50
masing-masing sebesar 0,360 mg/mL, 0,323 mg/mL, dan 0,387 mg/mL. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa fraksi-fraksi protein tersebut mempunyai aktivitas antioksidan yang
mampu mencegah terjadinya proses oksidasi.

Kata kunci : Spons Aaptos sp., Fraksi protein, Antioksidan, DPPH.

PENDAHULUAN

Indonesia khususnya Sulawesi Selatan kaya akan sumber daya alam laut yang
bermanfaat bagi manusia. Salah satunya adalah ekosistem terumbu karang. Ekosistem
terumbu karang merupakan bagian dari ekosistem laut yang menjadi sumber kehidupan
bagi keanekaragaman biota laut. Telah ditemukan berbagai jenis spons yang dapat hidup
dalam ekosistem terumbu karang (Muniarsih dan Rachmaniar, 1999).
Pada penelitian ini, kami mengambil spons Aaptos sp. yang merupakan salah satu
genus spons yang banyak diteliti kandungan dan aktivitas senyawa bioaktifnya. Spons ini
banyak mengandung senyawa alkaloid yang memiliki aktivitas antioksidan. Pola makan
yang tidak benar menyebabkan terbentuknya radikal bebas di dalam tubuh. Radikal bebas
ini akan menjadi racun bagi tubuh yang selanjutnya merusak fungsi sel tubuh dan dapat
menyebabkan penyakit degeneratif (Hernani, 2005).
Berdasarkan informasi tersebut maka dapat diduga adanya senyawa bioaktif yang
bersifat polar seperti protein, yang diproduksi dalam tubuh spons Aaptos sp. sehingga
dilakukan penelitian ini untuk mengisolasi senyawa bioaktif dari kelompok protein dari
spons Aaptos sp. berasal dari pulau Barang Lompo Sulawesi Selatan yang dapat
digunakan sebagai bahan antioksidan yang baru.
 METODE PENELITIAN

1. Isolasi Protein Bioaktif Spons

Spons Aaptos sp. dipotong-potong kecil lalu ditimbang sebanyak 500 g berat
segar, dihaluskan dengan blender menggunakan 500 mL pelarut buffer A, kemudian
disaring dengan kain saring. Kemudian filtrat yang di peroleh dibeku-cairkan sebanyak 2-
3 kali lalu disentrifugasi pada 6000 rpm 4 oC selama 30 menit, selanjutnya supernatannya
difraksinasi.

2. Fraksinasi dan Dialisis

Ekstrak kasar sampel spons difrasinasi dengan menggunakan amonium sulfat
pada tingkat kejenuhan masing-masing : 0-20%, 20-40%, 40-60% dan 60-80%, kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm dengan suhu 4 oC selama 30 menit.
Endapan-endapan yang diperoleh setelah fraksinasi dari masing-masing tingkat
kejenuhan amonium sulfat ditambahkan 5 mL buffer B kemudian didialisis dalam
sejumlah buffer C. Masing-masing fraksi protein tersebut dimasukkan dalam kantong
selofan dengan dipastikan bahwa kantong selofan itu tidak bocor atau rusak. Selofan yang
telah diisi dengan fraksi protein dimasukkan ke dalam gelas kimia yang berisi larutan
buffer C lalu diaduk dengan pengaduk magnetic stirrer. Dialisis terus dilakukan sampai
larutan buffer C tidak berwarna lagi.

3. Penentuan Kadar Protein

Penentuan kadar protein ditentukan berdasarkan metode Lowry dengan
menggunakan bovine serum albumin (BSA) sebagai standar. Kedalam gelas kimia
dimasukkan 4 mL larutan sampel ditambahkan 5,5 mL pereaksi Lowry B, dihomogenkan
lalu dibiarkan selama 10-15 menit pada suhu kamar, selanjutnya ditambahkan 0,5 mL
pereaksi Lowry A, dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit. Diukur absorbannya
pada max. Penentuan kadar protein dilakukan dengan cara mensubtitusikan absorbansi
larutan kedalam persamaan regresi kurva kalibrasi larutan standar protein.

4. Uji Aktifitas Antioksidan Dengan Metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)

Fraksi protein 0-20% kejenuhan dengan variasi konsentrasi 0,1 mg/mL, 0,2
mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL dan 0,5 mg/mL, lalu masing-masing dimasukkan ke
dalam Labu ukur 5 mL, Kemudian ditambahkan 0.5 mL larutan DPPH 0,1 mM. Volume
dicukupkan sampai 5 mL, kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 30 menit,
selanjutnya serapannya diukur pada panjang gelombang maksimum. Perlakuan yang
sama dilakukan pada masing-masing fraksi 20-40%, 40-60%, dan 60-80%. Dilakukan
juga pengukuran absorbansi blanko. Hasil penetapan antioksidan dibandingkan dengan
vitamin C sebagai control positif. Besar daya antioksidan dihitung dengan rumus:

% Aktivitas Antioksidan = x 100 %

 HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Isolasi, Fraksinasi dan Penentuan Kadar Protein Spons

Spesies spons yang digunakan pada penelitian ini adalah Aaptos sp.yang
diperoleh dari perairan pulau Barang Lompo. Spons tersebut dipotong-potong kecil dan
ditimbang sebanyak 500 g kemudian diblender dengan buffer A. Selanjutnya disaring
dengan menggunakan kain kasa (kain saring) untuk memisahkan ampas sel dan filtrat.
Filtrat yang diperoleh kemudian dibeku-cairkan sebanyak 2-3 kali agar semua sel dapat
pecah dengan sempurna. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm pada
suhu 4oC selama 20 menit. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi
berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga
substansi yang lebih berat akan mengendap di dasar (Holme and Peck, 1993).
Ekstrak kasar hasil sentrifugasi kemudian difraksinasi dengan menggunakan
amonium sulfat pada tingkat kejenuhan 0-20% (F 1), 20-40% (F2), 40-60% (F3), dan 60-
80% (F4) kemudian disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm dengan 4 oC selama 30
menit. Sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan jenis protein berdasarkan tingkat
kelarutannya dalam air. Adapun Metode yang digunakan untuk memisahkan protein,
didasarkan pada prinsip bahwa protein kurang larut ketika berada pada daerah yang
konsentrasi kadar garamnya tinggi (Mayes, dkk., 1990). Pengaruh penambahan garam
terhadap kelarutan protein berbeda-beda, tergantung pada konsentrasi dan jumlah muatan
ionnya dalam larutan. Semakin tinggi konsentrasi dan jumlah muatan ionnya, semakin
efektif garam dalam mengendapkan protein.
Pengukuran kadar protein masing-masing fraksi berdasarkan metode lowry
dengan menggunakan Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai standar (Colowick dan
Kaplan, 1957).

Tabel 1. Konsentrasi protein dari masing-masing fraksi protein

Volume
Absorbansi Kons. Protein Total Protein
No Fraksi Protein setiap fraksi
(A) (mg/mL) (mg)
(mL)
1 Ekstrak Kasar 0,512 9,90 700 6930
2 0-20 % 0,438 4,05 29,54 119,63
3 20-40% 0,690 7,11 29,7 211,16
4 40-60% 0,428 7,85 26 204,10
5 60-80% 0,290 2,25 30 67,50
. Hasil pengukuran kadar protein yang telah dilakukan seperti yang tertera pada
Tabel 1 menyatakan bahwa konsentrasi tertinggi ditunjukkan pada fraksi 40-60%
kejenuhan yaitu sebesar 7,85 mg/mL, sedangkan konsentrasi terendah ditunjukkan pada
fraksi 60-80% kejenuhan yaitu sebesar 2,25 mg/mL. Dimana pada tabel tersebut
menunjukkan konsentrasi yang berbeda-beda pada setiap fraksi protein. Hal tersebut
mengindikasikan bahwa protein yang mengendap dari tiap fraksi merupakan protein yang
berbeda jenisnya. Protein tersebut mengendap berdasarkan perbedaan kelarutan didalam
air. Protein yang kelarutannya rendah dalam air akan terlebih dahulu mengendap
dibandingkan dengan protein yang kelarutannya tinggi dalam air. Fraksi protein hasil
dialisis tersebut selanjutnya diuji aktivitas antioksidannya dengan metode DPPH (1,1-
Diphenyl-2-picrylhidrazyl).

2. Uji Aktifitass Antioksidan Dengan Metode DPPH

Uji aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode ini berdasarkan dari
hilangnya warna ungu akibat tereduksinya DPPH oleh antioksidan. Intensitas warna dari
larutan uji diukur melalui spektrofotometri UV-Vis (Molyneux, 2004). Hasil pengukuran
aktivitas antioksidan masing-masing fraksi protein spons Aaptos sp. dengan variasi
konsentrasi dapat dianalisis dari hasil pengukuran absorbansi pada panjang gelombang
maksimum 510 nm dan absorbansi kontrol sebesar 0,518 yang dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Aktivitas antioksidan fraksi protein dan Asam Askorbat

Aktivitas Antioksidan (%)

No Konsentrasi (mg/mL) Fraksi Protein Pembanding
0-20 % 20-40 % 40-60 % 60-80 % Asam askorbat
1 0,1 18,91 47,29 29,53 11,19 52,57
2 0,2 27,41 59,93 38,8 27,22 63,51
3 0,3 40,92 70,23 49,42 41,11 71,81
4 0,4 54,24 78,11 56,56 52,5 87,06
5 0,5 69,49 87,06 65,25 62,16 98,26

Berdasarkan tabel 2 diatas menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan terbesar

terdapat pada fraksi protein 20-40 % dengan konsentrasi 0,1 mg/mL sebesar 47,29 % dan
konsentrasi 0,5 mg/mL sebesar 87,06 % sedangkan aktivitas antioksidan terkecil terdapat
pada fraksi protein 60-80 % dengan konsentrasi 0,1 mg/mL sebesar 11,19 % dan
konsentrasi 0,5 mg/mL sebesar 62,16 %. Adapun sebagai pembanding berupa asam
askorbat memiliki aktivitas antioksidan yang jauh lebih besar dibandingkan semua fraksi
protein tersebut yaitu pada konsentrasi 0,1 mg/mL sebesar 52,57 % dan konsentrasi 0,5
sebesar 98,26 %.
Berdasarkan data aktivitas antioksidan yang diperoleh maka dapat dibuat
persamaan regresi linear yang menyatakan hubungan antara konsentrasi larutan uji (x)
dengan antivitas antioksidan (y) sehingga diperoleh nilai IC 50 yang merupakan
konsentrasi larutan uji yang diperlukan untuk meredam DPPH sebesar 50 % (Molyneux,
2004). Nilai IC50 berbanding terbalik dengan aktivitas antioksidan suatu senyawa yang
terkandung didalam fraksi protein maupun asam askorbat. Semakin kecil nilai IC 50 maka
semakin besar aktivitas antioksidannya. Dari data perhitungan yang telah dilakukan,
didapatkan data nilai IC50 yang ditunjukkan pada Tabel 3.
Tabel 3. Nilai IC50 dari masing-masing fraksi protein dan asam askorbat

No Larutan Uji IC50 (mg/mL)

1 Fraksi protein 0-20 % 0,360
2 Fraksi protein 20-40 % 0,110
3 Fraksi protein 40-60 % 0,323
4 Fraksi protein 60-80 % 0,387
5 Asam askorbat 0,085

Tabel 3 diatas menunjukkan adanya aktivitas antioksidan yang terdapat didalam

masing-masing fraksi protein. Namun berdasarkan nilai IC 50 yang diperoleh fraksi protein
0-20 %, 40-60 %, dan 60-80 % kejenuhan mempunyai aktivitas antioksidan yang lemah
dengan nilai IC50 masing-masing sebesar 0,360 mg/mL, 0,323 mg/mL, dan 0,387 mg/mL
sedangkan fraksi protein 20-40 % kejenuhan dan asam askorbat sebagai pembanding
mempunyai aktivitas antioksidan yang kuat dengan nilai IC 50 sebesar 0,110 mg/mL dan
0,085 mg/mL. Menurut Molyneux (2004), suatu senyawa dikatakan berpotensi sebagai
antioksidan kuat jika memiliki nilai IC50 kurang dari 0,150 mg/mL.

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan

bahwa protein bioaktif dari spons Aaptos sp. pada masing-masing fraksi protein diisolasi
dan diendapkan berdasarkan perbedaan kelarutannnya didalam air. Fraksi-fraksi protein
tersebut mempunyai aktivitas antioksidan yang mampu mencegah terjadinya proses
oksidasi. Aktivitas antioksidan yang kuat terdapat pada fraksi protein 20-40% kejenuhan
dengan nilai IC50 sebesar 0,110 mg/mL. Sedangkan aktivitas antioksidan lemah
ditunjukkan oleh fraksi protein 0-20%, 40-60%, dan 60-80% kejenuhan dengan nilai IC 50
masing-masing sebesar 0,360 mg/mL, 0,323 mg/mL, dan 0,387 mg/mL.

SARAN

Penelitian selanjutnya sebaiknya dilakukan uji aktivitas antikanker pada masing-

masing fraksi protein tersebut. Dimana antioksidan mampu menetralkan radikal bebas
yang dapat menimbulkan penyakit degeneratif seperti kanker, sehingga dapat
memberikan informasi secara lengkap hubungan linear antara aktivitas antioksidan dan
aktivitas antikanker.

DAFTAR PUSTAKA

Colowick, S.P., dan Kaplan, N.O.1957, Methods In Enzymology, Academic Press Inc,
New York, 291.
Hernani dan Rahardjo, M., 2005, Tanaman Berkhasiat Antioksidan, Penebar Swadaya,
Depok.
Holme, D.J., and Peck Hazel, 1993, Analytical Biochemistry Second Edition, Longman
Scientific & Technical, New York.

Mayes, P.A., Granner, D.K., Rodwell, V.W., dan Martin, D.W., 1990, Biokimia Harper
Edisi 20, Penerbit Buku Kedokteran, Jakarta.

Muniarsih, T., dan Rachmaniar, R., 1999, Isolasi Substansi Bioaktif Antimikroba dari
Spons Asal Pulau Pari Kepulauan Seribu, Prosidings Seminar Bioteknologi
Kelautan Indonesia I 98, Jakarta 14 15 Oktober 1998: 151 158, Lembaga
Ilmu Pengetahuan Indonesia Jakarta, 1999.

Molyneux, P., 2004, The use of stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for
estimating antioksidan activity, Songklanakarin J Sci Technol 26(2):211-219.