Kromatografi Gas

Definisi dan Fungsi Kromatografi Gas

Secara etimologi, kromatografi berasal dari bahasa Yunani yang berarti warna
dan tulis. Kromatografi gas (GC) merupakan jenis kromatografi yang digunakan
dalam kimia organik untuk pemisahan dan analisis. Kromatografi gas adalah proses
pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya dengan menggunakan gas sebagai fase
bergerak yang melewati suatu lapisan serapan (sorben) yang diam.
Kromatografi gas termasuk dalam salah satu alat analisa (analisa kualitatif dan analisa
kuantitatif), kromatografi gas dijajarkan sebagai cara analisa yang dapat digunakan untuk
menganalisa senyawa-senyawa organik. Ada dua jenis kromatografi gas, yatiu kromatografi
gas padat (KGP) dan kromatografi gas cair (KGC). Pada kromatografi gas padat (KGP)
terdapat adsorbsi dan pada kromatografi gas cair (KGC) terdapat partisi (larutan).
Kromatografi gas padat (KGP) digunakan sebelum tahun 1800 untuk memurnikan gas. Metode
ini awalnya kurang berkembang. Penemuan jenis jenis
padatan baru sebagi hasil riset memperluas penggunaan metode ini.
Kelemahan metode ini mirip dengan kromatografi cair padat. Sedangkan kromatografi
gas cair sering disebut oleh para pakar kimia organik sebagai kromatografi fasa uap. Pertama
kali dikenalkan oleh James dan Martin pada tahun 1952. Metode ini paling banyak digunakan
karena efisien, serba guna, cepat dan peka. Cuplikan dengan ukuran beberapa microgram
sampel dengan ukuran 10 gram masih dapat dideteksi. Komponen cuplikan harus mempunyai
tekanan beberapa torr pada suhu kolom.
Komponen Kromatografi Gas
Pada dasarnya komponen penting yang harus ada pada setiap alat kromatografi gas
adalah :
1. Tangki pembawa gas
2. Tempat injeksi
3. Kolom
4. Detektor
5. Rekoder

Tangki Pembawa Gas

1
 Disebut juga gas pengangkut/ pemasok gas (carrier gas) ditempatkan dalam silinder
bertekanantinggi. Biasanya tekanan dari silinder sebesar 150 atm. Tetapi tekanan ini sangat
besar untukdigunakan secara Iansung. Gas pengangkut harus memenuhi persyaratan :
1. Harus inert, tidak bereaksi dengan cuplikan, cuplikan-pelarut, dan material dalam
kolom
2. Murni dan mudah diperoleh serta murah
3. Sesuai atau cocok untuk detektor
4. Harus mengurangi difusi gas
Gas gas yang sering dipakai adalah helium, argon, nitrogen, karbondioksida, dan
hidrogen. Pemilihan gas pengangkut atau pembawa ditentukan oleh detektor yang digunakan.
Tabung gas pembawa dilengkapi dengan pengatur tekanan keluaran dan pengukur tekanan.
Sebelum masuk ke kromatografi, ada pengukur kecepatan aliran gas serta sistem penapis
molekuler untuk memisahkan air dan pengotor gas lainnya. Pada dasarnya kecepatan alir gas
diatur melalui pengatur tekanan dua tingkat yaitu pengatur kasar (coarse) pada tabung gas
dan pengatur halus (fine) pada kromatografi. Tekanan gas masuk ke kromatograf (yaitu
tekanan dari tabung gas) diatur pada 10-50 psi (di atas tekanan ruangan) untuk memungkinkan
aliran gas 25-150 mL/menit pada kolom terpaket dan 1-25 mL/menit untuk kolom kapiler.
Tempat Injeksi
Dalam kromatografi gas cuplikan harus dalam bentuk fase uap. Gas dan uap dapat
dimasukkan secara langsung. Tetapi kebanyakan senyawa organik berbentuk cairan
dan padatan. Hingga dengan demikian senyawa yang berbentuk cairan dan padatan pertama-
tama harus diuapkan. Ini membutuhkan pemanasan sebelum masuk dalam kolom.
Tempat injeksi dari alat GLC/KGC selalu dipanaskan. Dalam kebanyakan alat, suhu
dari tempat injeksi dapat diatur. Aturan pertama untuk pengaturan suhu ini adalah bahwa suhu
tempat injeksi sekitar 50C lebih tinggi dari titik didih campuran dari cuplikan yang
mempunyai itik didih yang paling tinggi. Bila tidak diketahui titik didih komponen dari
cuplikan maka harus mencoba - coba.
Sebagai tindak lanjut suhu dari tempat injeksi dinaikkan. Jika puncak- puncak yang
diperoleh lebih baik, ini berarti bahwa suhu percobaan pertama terlalu rendah.
Namun demikian suhu tempat injeksi tidak boleh terlalu tinggi, sebab kemungkinan akan
terjadi perubahan karena panas atau penguraian dari senyawa yang akan dianalisa.
Cuplikan dimasukkan ke dalam kolom dengan cara menginjeksikan melalui tempat injeksi.
Hal ini dapat dilakukan dengan pertolongan jarum injeksi yang sering disebut "a gas tight
syringe". Perlu diperhatikan bahwa tidak boleh menginjeksikan cuplikan terlalu banyak, karena

2
GC sangat sensitif. Biasanya jumlah cuplikan yang diinjeksikan pada waktu kitamengadakan
analisa 0,5 -50 ml untuk gas dan 0,2 - 20 ml untuk cairan.

Kolom
Ada dua jenis kolom yang digunakan dalam GC :
1. Kolom kemas, yaitu berupa tabung yang terbuat dari gelas atau steinstless berisi suatu
padatan inert yang dikemas secara rapi. Kolom ini memiliki ukuran panjang 1,5-10 m
dan diameter 2,2-4 nm.
2. Kolom kapiler, yang biasanya terbuat dari silica dengan lapisan poliamida. Kolom jenis
ini biasanya memiliki ukuran panjang 20-26 m dengan diameter yang sangat kecil.
Detektor
Detektor berfungsi sebagai pendeteksi komponen-komponen yang telah dipisahkan dari
kolom secara terus-menerus, cepat, akurat, dan dapat melakukan pada suhu yang lebih tinggi.
Fungsi umumnya mengubah sifat-sifat molekul dari senyawa organik menjadi arus listrik
kemudian arus listrik tersebut diteruskan ke rekorder untuk menghasilkan
kromatogram.Detektor yang umum digunakan :
1. Detektor hantaran panas (Thermal Conductivity Detector_ TCD)
2. Detektor ionisasi nyala (Flame Ionization Detector_ FID)
3. Detektor penangkap elektron (Electron Capture Detector _ECD)
4. Detektor fotometrik nyala (Falame Photomertic Detector _FPD)
5. Detektor nyala alkali
6. Detektor spektroskopi massa

Detector yang paling umum digunakan dalam GC adalah detector ionisasi nyala (FID)
dan detector kondutivitas termal (TCD). Keduanya peka terhadap berbagai komponen dan
dapat berfungsi pada berbagai konsentrasi. Sementara TCD pada dasarnya universal dan dapa
tdigunakan untuk mendeteksi setiap komponen selain gas pembawa (selama

3
konduktivitasmereka berbeda dari gas pembawa, suhu detektor),dalam jumlah besar sensitif
terutama untukhidrokarbon. Sedangkan FID tidak dapat mendeteksi air. TCD adalah detector
non-destruktif,sedangkan FID adalah detector destruktif. Biasanya detector ini akan
dihubungkan denganSpektrokopi Masa, sehingga akan menjadi rangkaian alat GC-MS.
Adapun salah satu bentukdari FID adalah sebagai berikut :

Recorder
Rekorder berfungsi sebagai pengubah sinyal dari detektor yang diperkuat melalui
elektrometer menjadi bentuk kromatogram. Dari kromatogram yang diperoleh dapat dilakukan
analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif dengan cara membandingkan waktu retensi
sampel dengan standar. Analisis kuantitatif dengan menghitung luas area maupun tinggi dari
kromatogram. Sinyal analitik yang dihasilkan detektor disambungkan
oleh rangkaian elektronik agar bisa diolah oleh rekorder atau sistem data.
Sebuah rekorder bekerja dengan menggerakkan kertas dengan kecepatan tertentu. Di
atas kertas tersebut dipasangkan pena yang digerakkan oleh sinyal keluaran detektor
sehingga posisinya akan berubah-ubah sesuai dengan dinamika keluaran penguat sinyal
detektor. Hasil rekorder adalah sebuah kromatogram berbentuk pik-pik dengan pola yang
sesuai dengan kondisisampel dan jenis detektor yang digunakan.
Ada beberapa detektor yang dapat digunakan dalam kromatografi gas. Detektor
yang berbeda akan memberikan berbagai jenis selektivitas. Detektor non selektif merespon
senyawa kecuali gas pembawa. Detektor selektif meresponi berbagai senyawa dengan sifat
fisik atau kimia umum dan detektor khusus menanggapi suatu senyawa kimia tunggal. Detektor
juga dapatdikelompokkan ke dalam concentration dependant detectors and mass flow
dependant detectors.
Sinyal dari concentration dependant detector terkait dengan konsentrasi zat terlarut
dalam detektor, dan biasanya Pengenceran sampel akan menurunkan respon detektor.
Mass flow dependant detectors biasanya menghancurkan sampel dan

4
sinyal tersebut tergantung dengan laju di mana molekul-molekul zat terlarut menuju ke
detektor.
Prinsip Kerja Kromatografi Gas
Prinsip kerja dari kromatografi
gas adalah gas pembawa lewat melalui satu
sisi detektor kemudian memasuki kolom. Di
dekat kolom ada suatu alat di mana sampel
sampel bisa dimasukkan ke dalam gas
pembawa (tempat injeksi). Sampel sampel
tersebut dapat berupa gas atau cairan yang
volatil (mudah menguap). Lubang injeksi
dipanaskan agar sampel teruapkan dengan
cepat.
Aliran gas selanjutnya menemui kolom, kolom merupakan jantung instrumen tempat di
mana kromatografi berlangsung. Kolom berisi suatu padatan halus dengan luas permukaan
yang besar dan relatif inert. Namun padatan tersebut hanya sebuah
penyangga mekanika untuk cairan. Sebelum diisi ke dalam kolom, padatan tersebut di
impregnasi dengan cairan yang diinginkan yang berperan sebagai fasa diam atau stasioner
sesungguhnya, cairan ini harus stabil dan non volatil pada temperatur kolom dan harus sesuai
dengan pemisahan tertentu. Setelah muncul dari kolom itu, aliran
gas lewat melalui sisi lain detektor. Maka elusi zat terlarut dari kolom mengatur ke tidak
seimbangan antara dua sisi detektor yang direkam secara elektrik.
Cara Kerja Kromatografi Gas
Mengaktifkan GC
1. Aktifkan Un-interrupable Power Supply (UPS) jika ada
2. Buka katup gas (alirkan gas ke GC)
Gas helium (He) sebagai gas pembawa (carier)
Gas nitrogen (N2) sebagai carier dan make up gas (FID)
Gas hidrogen (H2) sebagai gas pembakar (FID)
Gas compress air sebagai gas pembakar (FID)
3. Aktifkan komputer
4. Aktifkan Gas Chromatography (GC) dengan tombol On/Off berada di sisi kiri bawah,
tunggu hingga GC selesai initialisasi dan self test (kira-kira 2 menit)

5
 5. Aktifkan software chemstation. Double program click kiri icon instrument 1 online
atau klik start Instrument 1 online
6. Pastikan menu berada pada Load Method (Conditioning Method)
7. Sebelum digunakan, pastikan kolom sudah dikondisikan pada 20oC di bawah suhu
maksimum kolom atau di atas suhu operasional tetapi tidak diperbolehkan melewati
suhu maksimal kolom seperti yang tertera di tag kolom
8. Conditioning GC selama 30 menit. Pilih metode yang ingin digunakan untuk analisa
(Method and Run Control)
Analisis Sampel
1. Isi Operator Sample Info Isi identitas sampel melalui : Run Control Name, Sub
Directory (untuk memudahkan pencarian data, gunakan tanggal hari ini), Nama Signal,
Nama Sample, komentar bila ada
2. Apabila menggunakan Sequence, isi identitas sampel melalui : Sequence
Isi Operator Name, Sub Directory (untuk memudahkan Parameter pencarian data, gu
nakan tanggal hari ini), Pastikan Data file Prefix/Counter, Nama Signal, Counter.
3. Pastikan Parts of Method to Run berada pada According to Runtime Checklist
4. Tunggu status di komputer ready (warna hijau) atau pada display GC Ready For
Injection dan lampu indikator not ready (warna merah) pada GC off
5. Pastikan icon Sequence aktif dengan cara pilih Run Control
6. Tunggu hingga analisa selesai, hasil analisa akan tercetak secara otomatis

Kromatogram Gas Dari Suatu Campuran Hidrokarbon Normal

Mematikan GC
1. Turunkan suhu inlet dan detector tanpa mematikan gas carrier
2. Tunggu hingga di suhu oven, inlet, dan detector berada pada suhu di bawah 50oC
3. Close software chemstation : File
4. Tekan tombol off (matikan GC)

6
 5. Matikan UPS jika ada
6. Tutup kembali katup gas hidrogen, helium, nitrogen, dan compress air
Sampel Yang Dapat Dianalisa GC
1. Produk gas alam
2. Kemurnian pelarut
3. Asam lemak
4. Residu pestisida
5. Polusi udara
6. Alkohol
7. Steroid
8. Minyak atsiri
9. Flavor
10. Ganja (mariyuana)

HPLC

Definisi dan Fungsi HPLC

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau Kromatografi cair
berperforma tinggi merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya
disertai dengan tekanan tinggi. HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan
perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa
cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk
memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif
antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detector serta integrator akan
mendapatkan kromatogram. Kromatogram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu
senyawa. Adapun fungsi HPLC adalah sebagai berikut :
1. HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan
pestisida
2. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat
dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair
3. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan
dengan kolom butiran berlapis zat berpori
4. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
5. Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air

7
 6. Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia
7. Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa
Komponen HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas : wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase
gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
1. Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu
laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur
yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-
komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan
elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase
diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya
polaritas pelarut.
Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari
partikel-partikel kecil. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab
adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga
akan mengacaukan analisis.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah
campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan
dengan fase normal adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang

8
terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini
kurang umum dibanding dengan fase terbalik.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang
umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang
digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan
fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan
harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin
proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari
gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu pompa dengan tekanan konstan, dan pompa
dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan
sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
3. Tempat Injeksi

Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari
tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)
internal atau eksternal.

4. Kolom dan Fase Diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom
merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses
pemisahan solut/analit.

9
 Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,
Silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan
silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti
klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan
gugus-gugus fungsional yang lain.
5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu : detektor universal
(yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif)
seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa, serta golongan detektor yang
spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-
Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik
detektor seperti berikut :

Detektor Sensitifitas Kisaran Karakteristik

(g/ml) linier
Absorbansi Uv-vis
Fotometer filter 5 x 10-10 104 Sensitivitas bagus, paling
Spektrofotometer 5 x 10-10 105 sering digunakan, selektif
spektrometer photo-diode > 2 x 10-10 105 terhadap gugus-gugus dan
array struktur-struktur yang tidak
jenuh.
Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat bagus,
selektif, Tidak peka
terhadap perubahan suhu
dan kecepatan alir fase
gerak.
Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal
akan tetapi sensitivitasnya
sedang. Sangat sensitif
terhadap suhu, dan tidak
dapat digunakan pada elusi
bergradien.
Elektrokimia
Konduktimetri 10-8 104 Peka terhadap perubahan
Amperometri 10-12 105 suhu dan kecepatan alir fase
gerak, tidak dapat
digunakan pada elusi
bergradien. Hanya
mendeteksi solut-solut

10
 ionik. Sensitifitas sangat
bagus, selektif tetapi timbul
masalah dengan adanya
kontaminasi elektroda.

Prinsip Kerja HPLC

Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen
untuk mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi
pada HPLC adalah untuk :
a. Meningkatkan deteksi
b. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak
kromatografi yang lebih baik
c. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik
d. Menstabilkan analit yang sensitif
Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UV-Vis sehingga
banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor
yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di samping itu, juga
dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu
berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri.
Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni: produk
yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat
membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri ; proses
derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %) ; produk hasil
derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi ; serta sisa pereaksi untuk
derivatisasi harus tidak menganggu pemisahan kromatografi.

Hasil Analisa HPLC

11
Spektrofotometer

Definisi dan Fungsi Spektrofotometer

Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk
mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan
panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa
yang disebut kuvet. Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap
dan sisanya akan dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang
dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet. Sesuai dengan namanya
adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari
spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas
cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk
mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau
diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang.
Komponen Spektrofotometer
Secara garis besar spektrofotometer terdiri dari 4 bagian penting yaitu :
1. Sumber Cahaya
Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran radiasi
yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah tampak,
ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat rambut terbuat
dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah panjang
gelombang (l ) adalah 350 2200 nanometer (nm).
2. Monokromator
Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya polikromatis
menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu (monokromatis) yang bebeda
(terdispersi).
3. Cuvet

12
 Cuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat contoh atau
cuplikan yang akan dianalisis. Cuvet biasanya terbuat dari kwars, plexigalass, kaca, plastic
dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm dan tinggi 5 cm. Pada pengukuran di
daerah UV dipakai cuvet kwarsa atau plexiglass, sedangkan cuvet dari kaca tidak dapat dipakai
sebab kaca mengabsorbsi sinar UV. Semua macam cuvet dapat dipakai untuk pengukuran di
daerah sinar tampak (visible).
4. Detektor
Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai
panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi sinyal listrik yang selanjutnya
akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk jarum penunjuk atau angka digital.
Dengan mengukur transmitans larutan sampel, dimungkinkan untuk menentukan
konsentrasinya dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Spektrofotometer akan mengukur
intensitas cahaya melewati sampel (I), dan membandingkan ke intensitas cahaya sebelum
melewati sampel (Io). Rasio disebut transmittance, dan biasanya dinyatakan dalam persentase
(% T) sehingga bisa dihitung besar absorban (A) dengan rumus A = -log %T.
Prinsip Kerja Spektrofotometer
Sinar berasal dari dua lampu yang berbeda, yaitu lampu wolfram untuk sinar Visible
(sinar tampak = 38 780nm) dan lampu deuterium untuk sinar Ultra Violet (180-380nm) pada
video lampu yang besar. Pilih panjang gelombang yang diinginkan/diperlukan. Kuvet, ada dua
karena alat yang dipakai tipe double beam, disanalah kita menyimpan sample dan yang satu
lagi untuk blanko. Detektor atau pembaca cahaya yang diteruskan oleh sampel, disini terjadi
pengubahan data sinar menjadi angka yang akan ditampilkan pada reader.
Yang harus dihindari adanya cahaya yang masuk ke dalam alat, biasanya pada saat
menutup tenpat kuvet, karena bila ada cahaya lain otomatis jumlah cahaya yang diukur menjadi
bertambah.
Langkah langkah untuk kalibrasi spektrofotometer sebagai berikut. Kalibrasi yang
dimaksud ini adalah men-seting blank alat spektrofotometer, sebelum digunakan untuk
analisis. Secara umum adalah :
1. Nyalakan alat spektrofotometer
2. Isi kuvet dengan larutan blanko (aquades)
3. Diseting/diatur panjang gelombang untuk kalibrasi.
keterangan: 0%T itu diukur saat kuvet dalam keadaan kosong. 100%T itu diukur saat kuvet
dalam keadaan terisi larutan.
4. Kuvet berisi larutan blanko dimasukkan ke spektrofotometer

13
 5. Lalu tekan tombol 0 ABS 100%T, tunggu sampai keluar kondisi setting blank (dalam
bentuk teks)
Hasil Analisa Spektrofotometer
Hasil yang diperoleh dari spektrofotometer adalah seperti berikut ini :

Autoclave

Definisi dan Fungsi Autoclave

Autoclave adalah suatu lat yang terdapat di ruang laboratorium yang berfungsi sebagai
alat yang mensterilisaikan suatu benda dengan cara menggunakan uap bersuhu dan bertekanan
tinggi (1210C, 15 lbs). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon
tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch) selama kurang lebih 15 menit. Penurunan
tekanan pada autoklaf tidak dimaksudkan untuk membunuh mikroorganisme, melainkan
meningkatkan suhu dalam autoklaf.
Beberapa jenis autoclave adalah :
1. Gravity Displacement Autoclave
2. Prevacuum atau High Vacuum Autoclave
3. Steam-flush pressure-pulse
Autoclave yang banyak digunakan dalam mikrobiologi,
kedokteran, tato, tindik, ilmu kedokteran hewan, mikologi,
kedokteran gigi, perawatan kaki dan fabrikasi prosthetics.
Mereka bervariasi dalam ukuran dan fungsi tergantung pada
media yang akan disterilkan.
Autoclave juga banyak digunakan untuk menyembuhkan komposit dan dalam
vulkanisasi karet. Panas tinggi dan tekanan yang otoklaf memungkinkan membantu untuk
memastikan bahwa sifat fisik terbaik yang repeatably dicapai. Industri kedirgantaraan dan

14
sparmakers (untuk perahu layar khususnya) memiliki otoklaf lebih dari 50 kaki panjang,
beberapa lebih dari 10 kaki lebar.
Komponen Autoclave
Diagram autoklaf vertical :
1. Tombol pengatur waktu mundur (timer)
2. Katup pengeluaran uap
3. Pengukur tekanan
4. Kelep pengaman
5. Tombol on-off
6. Termomete
7. Lempeng sumber panas
8. Aquades (H2O)
9. Sekrup pengaman
10. Batas penambahan air
Prinsip Kerja Autoclave
1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air
kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut.
Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.
2. Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol beretutup ulir, maka tutup
harus dikendorkan.
3. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang
keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu.
4. Nyalakan autoklaf. Diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121 C.
5. Tunggu samapai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan
terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup (dikencangkan)
dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 15 dimulai sejak tekanan mencapai 2
atm.
6. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun
hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge menunjuk
ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan
hati-hati.
Autoklaf terutama ditujukan untuk membunuh endospora, yaitu sel resisten yang
diproduksi oleh bakteri, sel ini tahan terhadap pemanasan, kekeringan, dan antibiotik. Pada
spesies yang sama, endospora dapat bertahan pada kondisi lingkungan yang dapat membunuh

15
sel vegetatif bakteri tersebut. Endospora dapat dibunuh pada suhu 100 C, yang merupakan
titik didih air pada tekanan atmosfer normal. Pada suhu 121 C, endospora dapat dibunuh
dalam waktu 4-5 menit, dimana sel vegetatif bakteri dapat dibunuh hanya dalam waktu 6-30
detik pada suhu 65 C.
Perhitungan waktu sterilisasi autoklaf dimulai ketika suhu di dalam autoklaf mencapai
121C. Jika objek yang disterilisasi cukup tebal atau banyak, transfer panas pada bagian dalam
autoklaf akan melambat, sehingga terjadi perpanjangan waktu pemanasan total untuk
memastikan bahwa semua objek bersuhu 121 C untuk waktu 10-15 menit. Medium yang akan
disterilkan ditempatkan di dalam autoclave selama 15-20 menit, hal ini bergantung pada
banyak sedikitnya barang yang perlu disterilkan. Medium yang akan disterilkan ditempatkan
dalam beberapa botol yang agak kecil daripada dikumpul dalam satu botol yang besar. Setelah
pintu autoclave ditutup rapat, barulah kran pada pipa uap dibuka dan temperatur akan terus-
menerus naik sampai 121oC. Perpanjangan waktu juga dibutuhkan ketika cairan dalam volume
besar akan diautoklaf karena volume yang besar membutuhkan waktu yang lebih lama untuk
mencapai suhu sterilisasi. Performa autoklaf diuji dengan indicator biologi, contohnya Bacillus
stearothermophilus.
Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan
selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan.
Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan :
Penguraian gula
Degradasi vitamin dan asam-asam amino
Inaktifasi sitokinin zeatin riboside
Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar

AAS

Definisi dan Fungsi AAS

Atomic Absorption Spectrophotometry (AAS) atau Spektrofotometri Serapan Atom
adalah salah satu jenis analisa spektrofometri dimana dasar pengukurannya adalah pengukuran
serapan suatu sinar oleh suatu atom, sinar yang tidak diserap, diteruskan dan diubah menjadi
sinyal listrik yang terukur. AAS pertama kali diperkenalkan oleh Welsh (Australia) pada tahun
1955. AAS merupakan suatu metode yang populer untuk analisa logam, karena disamping
sederhana, ia juga sensitif dan selektif. Metode ini sangat tepat untuk analisis Zat pada

16
konsentrasi rendah. Teknik ini mempunyai beberapa kelebihan di bandingkan metode
spektroskopi emisi konvensional.
Sekitar 67 unsur telah dapat ditentukan dengan cara AAS. Banyak penentuan unsur-
unsur logam yang sebelumnya dilakukan dengan metoda polarografi, kemudian dengan metoda
spektrofotometri UV-VIS, sekarang banyak diganti dengan metoda AAS.
Komponen AAS

1. Sumber Radiasi Resonansi

Sumber radiasi resonansi yang digunakan adalah lampu katoda berongga (Hollow
Cathode Lamp) atau Electrodeless Discharge Tube (EDT). Elektroda lampu katoda berongga
biasanya terdiri dari wolfram dan katoda berongga dilapisi dengan unsur murni atau campuran
dari unsur murni yang dikehendaki.
Tanung lampu dan jendela (window) terbuat dari silika atau kuarsa, diisi dengan gas
pengisi yang dapat menghasilkan proses ionisasi. Gas pengisi yang biasanya digunakan ialah
Ne, Ar atau He.
Pemancaran radiasi resonansi terjadi bila kedua elektroda diberi tegangan, arus listrik
yang terjadi menimbulkan ionisasi gas-gas pengisi. Ion-ion gas yang bermuatan positif ini
menembaki atom-atom yang terdapat pada katoda yang menyebabkan tereksitasinya atom-
atom tersebut. Atom-atom yang tereksitasi ini bersifat tidak stabil dan akan kembali ke tingkat
dasar dengan melepaskan energy eksitasinya dalam bentuk radiasi. Radiasi ini yang dilewatkan
melalui atom yang berada dalam nyala.
2. Atomizer
Atomizer terdiri atas Nebulizer (sistem pengabut), spray chamber, dan burner (sistem
pembakar) :
Nebulizer berfungsi untuk mengubah larutan menjadi aerosol (butir-butir kabut dengan
ukuran partikel 15 20 m) dengan cara menarik larutan melalui kapiler (akibat efek

17
 dari aliran udara) dengan pengisapan gas bahan bakar dan oksidan, disemprotkan ke
ruang pengabut. Partikel-partikel kabut yang halus kemudian bersama-sama aliran
campuran gas bahan bakar, masuk ke dalam nyala, sedangkan titik kabut yang besar
dialirkan melalui saluran pembuangan.
Spray chamber berfungsi untuk membuat campuran yang homogen antara gas oksidan,
bahan bakar dan aerosol yang mengandung contoh sebelum memasuki burner.
Burner merupakan sistem tepat terjadi atomisasi yaitu pengubahan kabut/uap garam
unsur yang akan dianalisis menjadi atom-atom normal dalam nyala.
3. Monokromator
Setelah radiasi resonansi dari lampu katoda berongga melalui populasi atom di dalam
nyala, energy radiasi ini sebagian diserap dan sebagian lagi diteruskan. Fraksi radiasi yang
diteruskan dipisahkan dari radiasi lainnya. Pemilihan atau pemisahan radiasi tersebut dilakukan
oleh monokromator.
Monokromator berfungsi untuk memisahkan radiasi resonansi yang telah mengalami
absorpsi tersebut dari radiasi-radiasi lainnya. Radiasi lainnya berasal dari lampu katoda
berongga, gas pengisi lampu katoda berongga atau logam pengotor dalam lampu katoda
berongga. Monokromator terdiri atas sistem optik yaitu celah, cermin dan kisi.
4. Detektor
Detektor berfungsi mengukur radiasi yang ditransmisikan oleh sampel dan mengukur
intensitas radiasi tersebut dalam bentuk energi listrik.
5. Rekorder
Sinyal listrik yang keluar dari detektor diterima oleh piranti yang dapat
menggambarkan secara otomatis kurva absorpsi.
6. Lampu Katoda
Lampu katoda merupakan sumber cahaya pada AAS. Lampu katoda memiliki masa
pakai atau umur pemakaian selama 1000 jam. Lampu katoda pada setiap unsur yang akan diuji
berbeda-beda tergantung unsur yang akan diuji, seperti lampu katoda Cu, hanya bisa digunakan
untuk pengukuran unsur Cu. Lampu katoda terbagi menjadi dua macam, yaitu :
Lampu Katoda Monologam untuk mengukur 1 unsur
Lampu Katoda Multilogam untuk pengukuran beberapa
logam sekaligus, hanya saja harganya lebih mahal
Lampu katoda berfungsi sebagai sumber cahaya untuk memberikan energi sehingga
unsur logam yang akan diuji, akan mudah tereksitasi. Selotip ditambahkan, agar tidak ada

18
ruang kosong untuk keluar masuknya gas dari luar dan keluarnya gas dari dalam, karena bila
ada gas yang keluar dari dalam dapat menyebabkan keracunan pada lingkungan sekitar.
7. Tabung Gas
Tabung gas pada AAS yang digunakan merupakan tabung gas yang berisi gas asetilen.
Gas asetilen pada AAS memiliki kisaran suhu 20.000K, dan ada juga tabung gas yang berisi
gas N2O yang lebih panas dari gas asetilen, dengan kisaran suhu 30.000K. Regulator pada
tabung gas asetilen berfungsi untuk pengaturan banyaknya gas yang akan dikeluarkan, dan gas
yang berada di dalam tabung. Spedometer pada bagian kanan regulator merupakan pengatur
tekanan yang berada di dalam tabung. Pengujian untuk pendeteksian bocor atau tidaknya
tabung gas tersebut, yaitu dengan mendekatkan telinga ke dekat regulator gas dan diberi sedikit
air, untuk pengecekkan. Bila terdengar suara atau udara, maka menendakan bahwa tabung gas
bocor, dan ada gas yang keluar. Hal lainnya yang bisa dilakukan yaitu dengan memberikan
sedikit air sabun pada bagian atas regulator dan dilihat apakah ada gelembung udara yang
terbentuk.
8. Ducting
Ducting merupakan bagian cerobong asap untuk menyedot asap atau sisa pembakaran
pada AAS, yang langsung dihubungkan pada cerobong asap bagian luar pada atap bangunan,
agar asap yang dihasilkan oleh AAS, tidak berbahaya bagi lingkungan sekitar. Asap yang
dihasilkan dari pembakaran pada AAS, diolah sedemikian rupa di dalam ducting, agar polusi
yang dihasilkan tidak berbahaya.
Penggunaan ducting yaitu, menekan bagian kecil pada ducting kearah miring, karena
bila lurus secara horizontal, menandakan ducting tertutup. Ducting berfungsi untuk menghisap
hasil pembakaran yang terjadi pada AAS, dan mengeluarkannya melalui cerobong asap yang
terhubung dengan ducting.
9. Kompresor
Kompresor merupakan alat yang terpisah dengan main unit, karena alat ini berfungsi
untuk mensuplai kebutuhan udara yang akan digunakan oleh AAS, pada waktu pembakaran
atom.
10. Burner
Burner merupakan bagian paling terpenting di dalam main unit, karena burner berfungsi
sebagai tempat pancampuran gas asetilen, dan aquabides, agar tercampur merata, dan dapat
terbakar pada pemantik api secara baik dan merata. Lobang yang berada pada burner,
merupakan lobang pemantik api, dimana pada lobang inilah awal dari proses pengatomisasian
nyala api.

19
11. Buangan pada AAS
Buangan pada AAS disimpan di dalam drigen dan diletakkan terpisah pada AAS.
Buangan dihubungkan dengan selang buangan yang dibuat melingkar sedemikian rupa, agar
sisa buangan sebelumnya tidak naik lagi ke atas, karena bila hal ini terjadi dapat mematikan
proses pengatomisasian nyala api pada saat pengukuran sampel, sehingga kurva yang
dihasilkan akan terlihat buruk. Tempat wadah buangan (drigen) ditempatkan pada papan yang
juga dilengkapi dengan lampu indicator. Bila lampu indicator menyala, menandakan bahwa
alat AAS atau api pada proses pengatomisasian menyala, dan sedang berlangsungnya proses
pengatomisasian nyala api. Selain itu, papan tersebut juga berfungsi agar tempat atau wadah
buangan tidak tersenggol kaki. Bila buangan sudah penuh, isi di dalam wadah jangan dibuat
kosong, tetapi disisakan sedikit, agar tidak kering.
Prinsip Kerja AAS
Prinsip dasar dari pengukuran secara AAS ini adalah, proses penguraian molekul
menjadi atom dengan batuan energi dari api atau listrik. Atom yang berada dalam keadaan
dasar ini bisa menyerap sinar yang dipancarkan oleh sumber sinar, pada tahap ini atom akan
berada pada keadaan tereksitasi. Sinar yang tidak diserap oleh atom akan diteruskan dan
dipancarkan pada detektor, kemudian diubah menjadi sinyal yang terukur. Panjang gelombang
sinar bergantung pada konfigurasi elektron dari atom sedangkan intensitasnya bergantung pada
jumlah atom dalam keadaan dasar, dengan demikian AAS dapat digunakan baik untuk analisa
kuantitatif maupun kualitatif.

Spektrofotometri serapan atom (AAS) adalah suatu metode analisis yang didasarkan
pada proses penyerapan energi radiasi oleh atom-atom yang berada pada tingkat energi dasar
(ground state). Penyerapan tersebut menyebabkan tereksitasinya elektron dalam kulit atom ke
tingkat energi yang lebih tinggi. Keadaan ini bersifat labil, elektron akan kembali ke tingkat
energi dasar sambil mengeluarkan energi yang berbentuk radiasi.

20
 Dalam AAS, atom bebas berinteraksi dengan berbagai bentuk energi seperti energi
panas, energi elektromagnetik, energi kimia dan energi listrik. Interaksi ini menimbulkan
proses-proses dalam atom bebas yang menghasilkan absorpsi dan emisi (pancaran) radiasi dan
panas. Radiasi yang dipancarkan bersifat khas karena mempunyai panjang gelombang yang
karakteristik untuk setiap atom bebas.
Adanya absorpsi atau emisi radiasi disebabkan adanya transisi elektronik yaitu
perpindahan electron dalam atom, dari tingkat energi yang satu ke tingkat energi yang lain.
Absorpsi radiasi terjadi apabila ada elektron yang mengabsorpsi energi radiasi sehingga
berpindah ke tingkat energi yang lebih tinggi. Emisi terjadi apabila ada elektron yang berpindah
ke tingkat energi yang lebih rendah sehingga terjadi pelepasan energi dalam bentuk radiasi.
Panjang gelombang dari radiasi yang menyebabkan eksitasi ke tingkat eksitasi tingkat-1
disebut panjang gelombang radiasi resonansi. Radiasi ini berasal dari unsur logam/metalloid.
Radiasi resonansi dari unsur X hanya dapat diabsorpsi oleh atom X, sebaliknya atom X tidak
dapat mengabsorpsi radiasi resonansi unsur Y. Tak ada satupun unsur dalam susunan berkala
yang radiasi resonansinya menyamai unsur lain.
Hal inilah yang menyebabkan metode AAS sangat spesifik dan hampir bebas gangguan
karena frekuensi radiasi yang diserap adalah karakteristik untuk setiap unsur. Gangguan hanya
akan terjadi apabila panjang radiasi resonansi dari dua unsur yang sangat berdekatan satu sama
lain.
Hasil Analisa AAS

21
 DAFTAR PUSTAKA

Amalia. 2015. Autoclave. (Online) https://www.scribd.com/doc/259996853/Autoclave.

Diakses pada tanggal 19 Mei 2017.

Harmita. 2015. Spektrofotometer Serapan Atom. (Online)

staff.ui.ac.id/system/files/users/.../anfiskimssaatauaasdr.harmita.pdf. Diakses pada
tanggal 19 Mei 2017.

Hudahud. 2015. Makalah Spektrofotometer. (Online)

https://www.scribd.com/doc/292396252/MAKALAH-SPEKTROFOTOMETER-
pdf. Diakses pada tanggal 19 Mei 2017.

Kayoaory, Jhayn. 2014. Makalah Kromatografi Gas. (Online)

https://www.scribd.com/doc/244988181/MAKALAH-KROMATOGRAFI-GAS-
pdf. Diakses pada tanggal 19 Mei 2017.

Ramadiyanti, Dwina. 2017. HPLC. (Online)

https://www.academia.edu/5267709/HPLC_LENGKAP_HPLC_ADALAH_HPLC_
High_Performance_Liquid_Chromatography. Diakses pada tanggal 19 Mei 2017.

22