Cara Kerja HPLC

Iim Nurhidayat Instrumentalis Analisis Jurnal Materi

Skema kerja HPLC

Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit
berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam)
dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC
dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi
untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan
kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai kedektetor (waktu retensinya)
akan berbeda, hal ini akan teramati pada spectrum yang puncak-puncaknya
terpisah. Ukuran skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan
hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester <
golongan keton < golongan alcohol < golongan asam.

1. Pompa
Pompa pendeteksian tetap dapat dibedakan menjadi pompa torak dan
pompa semprit. Pompa torak menghasilakan aliran yang berdenyut jadi
memerlukan peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan
garis alas detector yang stabil jika detector peka terhadap aliran. Pompa
semprit menghasilkan aliran yang tak terbatas.
2. Injector
Cuplikan harus dimasukan kedalam pangkal kolom (kepala kolom),
diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom.
Ada dua ragam utama aliran henti dan pelarut mengalir. Ada 3 macam
system injector, yaitu:
a. Stop flow : aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir,
system tertutup dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena
difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.
b. Septum : septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang
digunakan pada kromatografi gas. Injector ini dapat digunakan pada kinerja
sampa 60 70 atmosfir. Tapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-
pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat
jarum injector) dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Loop vaive : tipe injector ini umumnya digunakan untuk menginjeksi
volume lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis (dengan
menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat
diinjeksikan secara manual). Pada posisi load, sampel diisikan ke dalam loop
pada kinerja atmosfir, bila valve difungsikan, maka sampel akan masuk
dalam kolom.

3. Kolom
Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan
analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom
dapat dibagi menjadi kolom analitik dan kolom preparative.
4. Detector
Detector diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di
dalam eluen kolom dan mengatur jumlahnya. Detector yang baik sangat
peka, tidak banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar dan
menggapai semua jenis senyawa.
Jenis-jenis detector :
UV/Vis
Retraktif indeks (RI) detector
Konduktifitas decetor
Elektroimia detector
PDA
ELSD
 MS dectetor
5. Fase gerak
Fase gerak memiliki syarat-syarat :
Murni, tanpa cemaran
Tidak bereaksi dengan kemasan
Sesuai dengan detector
Dapat melarutkan cuplikan
Mempunyai viskositas rendah
Memungkinkan memperoleh dengan mudah cuplikan jika diperlukan
Harganya wajar