LAPORAN RESMI PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

Pewarnaan Spora dan Kapsul Bakteri

Oleh:

Nama : Putu Pradnya Candra Asih

NPM : 2013210185

Kelas : A

Tanggal Praktikum: Senin, 29 September 2014

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PANCASILA
JAKARTA
2014
I. Pendahuluan

1.1 Latar Belakang

Bakteri merupakan jasad renik yang memiliki morfologi, struktur, dan sifat-
sifat yang khas. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan
air di mana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Melihat dan mengamati
bakteri yang disuspensikan dengan mata telanjang sangatlah sulit. Ukurannya
yang kecil, bersifat transparan, dan tidak berwarna mengakibatkan sel bakteri
semakin susah untuk diamati. Selain itu, bakteri sulit dilihat dengan cahaya
karena tidak mengabsorbsi atau membiaskan cahaya, sehingga digunakan zat
warna untuk mewarnai mikroorganisme. Salah satu cara untuk mengamati
bentuk sel bakteri patogen sehingga mudah untuk diidentifikasi adalah dengan
metode pewarnaan. Pewarnaan spora dan kapsul merupakan salah satu teknik
untuk melihat struktur bakteri patogen.
Teknik pewarnaan ini disebut teknik pewarnaan diferensial yang digunakan
untuk mewarnai bagian sel agar dapat dibedakan dari selnya, seperti pewarnaan
flagella, pewarnaan kapsul, pewarnaan sopra, dan pewarnaan inti. Teknik ini
maksudkan untuk mengidentifikasi setiap spesies guna membantu diagnosis
suatu penyakit oleh bakteri patogen. Prinsip dasar dari pewarnaan adalah ikatan
ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari
pewarnaanyang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan
listrik baik pada komponen seluler maupun pada zat pewarna. Berdasarkan
adanya muatan ini, maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
Teknik pewarnaan membutuhkan ketelitian dan kecermatan bekerja serta
mengikuti aturan dasar yang berlaku. Dalam praktikum kali ini, dilakukan
percobaan pewarnaan mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat
bagian-bagian bakteri.

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimana cara mengidentifikasi bakteri patogen?
2. Bagaimana letak serta bentuk dari spora dan kapsul pada bakteri setelah
dilakukan pewarnaan?
3. Warna apa yang dihasilkan setelah dilakukan pewarnaan pada suspensi
bakteri?

1.3 Tujuan
1. Melakukan teknik pewarnaan spora dan teknik pewarnaan kapsul pada
bakteri untuk identifikasi.
2. Mengamati dan menganalisis hasil reaksi-reaksi pewarnaan di bawah
mikroskop.

1.4 Manfaat
1. Dapat melakukan teknik pewarnaan spora dan teknik pewarnaan kapsul.
2. Dapat membedakan bagian-bagian dari bakteri, berupa kapsul dan spora.
3. Dapat menganalisis hasil reaksi-reaksi pewarnaan di bawah mikroskop.

II. Tinjauan Pustaka

2.1 Pewarnaan Spora

Anggota dari genus Clostridium dan Desulfotomaculum dan genus aerobic
Bacillus adalah contoh dari organisme yang mempunyai kemampuan untuk
hidup baik secara metabolik sel vegetatif atau sebagai resisten yang tinggi,
inaktif metabolik sel disebut spora. Ketika kondisi lingkungan menjadi tidak
menguntungkan untuk aktivitas sel, walaupun dengan keadaan sumber nutrisi
yang sangat kurang, sel ini memiliki kemampuan untuk mengalami sporogenesis
dan berkembangnya intraseluler yang baru yang dinamakan dengan endospora,
yang mana dikelilingi oleh lapisan tahan air yang disebut selubung spora.
Dalam kondisi yang terus memburuk, endospora dilepaskan dari sel
vegetatif menjadi sel yang berdiri sendiri yang disebut spora. Karena komposisi
kimia yang dimiliki lapisan spora, spora dapat tahan terhadap efek merusak dari
reagen yang berlebihan serta terhadap pewarnaan bakteri. Dengan kembalinya
kondisi lingkungan yang menguntungkan, spora yang bebas dapat kembali
menjadi sel vegetatif secara metabolik. Harus ditekankan bahwa sporogenesis
bukanlah alat reproduksi, melainkan hanya mekanisme yang menjamin
kelangsungan hidup sel di bawah semua kondisi lingkungan. Dalam praktiknya,
pewarnaan spora menggunakan dua reagen yang berbeda.
Spesies-spesies tertentu bakteri menghasilkan spora, di luar sel vegetatif
(eksospora) atau di dalam sel vegetatif (endospora). Ini adalah tubuh yang
secara metabolik dorman, dihasilkan pada fase yang lanjut pada pertumbuhan
sel dan pada kondisi-kondisi yang sesuai akan berkecambah dan menghasilkan
sel-sel yang sama seperti asalnya atau vegetatif. Spora bersifat tahan terhadap
bahan fisik dan kimiawi. Endospora hanya terdapat pada bakteri. Merupakan
tubuh berdinding tebal, sangat refraktif, dan sangat resisten. Dihasilkan oelh
semua spesies bakteri Bacillus, Clostridium, dan Sporosarcina. Bakteri yang
mampu membentuk endospora dapat tumbuh dan bereproduksi selama banyak
generasi sebagai sel vegetatif. Namun, pada beberapa tahapan di dalam
pertumbuhannya, terjadi sintesis protoplasma baru di dalam sitoplasma
vegetatifnya yang dimaksudkan untuk menjadi spora.
Salah satu ciri unik endospora bakteri ialah susunan kimiawinya. Semua
endospora bakteri mengandung sejumlah besar asam dipikoglinat, yaitu
substansi yang tidak terdeteksi pada sel-sel vegetatif. Sesungguhnya, asam
tersebut merupakan 5 sampai 10 persen berat kering endospora. Sejumlah
besar kalsium juga terdapat dalam endospora dan diduga bahwa lapisan korteks
terbuat dari kompleks Ca2+ asam dipikoglinat-peptidoglikan. Diameter spora
dapat lebih besar atau lebih kecil dari diameter sel vegetatifnya, karena itu
adanya letak serta ukuran endospora sangat bermanfaat di dalam pencirian dan
identifikasi bakteri.
Spora bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha
mengamankan diri terhadap pengaruh buruk dari luar. Spora bakteri mempunyai
fungsi untuk melindungi diri terhadap faktor luar yang tidak menguntungkan.
Dibandingkan dengan sel vegetatifnya, spora sangat resisten terhadap kondisi-
kondisi fisik yang kurang menguntungkan seperti suhu tinggi dan kekeringan
serta terhadap bahan-bahan kimia seperti desinfektan. Endospora hanya
terdapat pada bakteri, merupakan tubuh dinding yang tebal yang sangat
refraktif, dan sangat resisten. Dihasilkan oleh semua spesies basillus, clostidum,
dan sporosarcina. Bakteri yang mampu membentuk endospora dapat tumbuh
dan bereproduksi selama banyak generasi sehingga sel vegetatif. Namun pada
beberapa tahapan di dalam pertumbuhanya, terjadi sintesis protoplasma baru
dalam sitoplasma vegetatifnya yang di maksudkan untuk menjadi spora.
Bentuk spora ada yang bulat, ada pula yang bulat panjang. Hal ini
tergantung oleh spesisesnya endospora ada yang lebih kecil ada pula yang lebih
besar dari pada diameter sel induk. Letak sel di dalam sel serta ukurannya dalam
pembentukanya tidaklah sama bagai semua spesies. Bentuk, lokasi, dan ukuran
relatif spora yang dibentuk terhadap sel induk adalah oval, terminal; rektangular,
terminal; rektangular, subterminal; rektangular, sentral; sirkular, terminal; sirkular,
sentral; dan bentuk klub, terminal. Pada umumnya sporulasi itu mudah terjadi
jika keadaan medium memburuk dan zat-zat yang timbul sebagai zat-zat
pertukaran zat bertimbun-timbun.
Faktor-faktor luar lainnya merugikan tetapi pada beberapa spesies mampu
membentuk spora meskipun tidak terganggu oleh faktor luar. Sporulasi dapat di
cegah, jika selalu diadakan pemindahan ke medium yang baru, beberapa
spesies bakteri dapat kehilangan kemampuannya untuk membentuk spora-spora
 dapat tumbuh lagi menjadi bakteri apabila keadaan di luar menguntungkan.
Mula-mula air meresap ke dalam spora, kemudian spora mengembang dan kulit
spora menjadi retak karenanya keretakan ini dapat terjadi pada salah satu
ujung. Tetapi juga dapat terjadi di tengah-tengah spora. Hal ini merupakan ciri
khas bagi beberapa spesies bacillus, jika kulit spora pecah di tengah-tengah,
maka masing-masing pecahan merupakan suatu tutup pada kedua ujung bakteri.

2.2 Pewarnaan Kapsul

Kapsul adalah lapisan luar yang bersifat seperti gelatin, disekresikan oleh
sel. Berfungsi mengelilingi dan melekat pada dinding sel. Kapsul tidak umum
untuk semua organisme bakteri. Sel-sel yang memiliki kapsul berat umumnya
virulen dan mampu menghasilkan penyakit, karena strukturnya berfungsi
melindungi bakteri terhadap aktivitas fagositosis normal sel inang. Ukuran kapsul
sangat dipengaruhi oleh medium tempat ditumbuhkannya bakteri itu. Pada
beberapa kejadian, tebalnya kapsul jauh lebih besar dari pada selnya. Karena
kekentalannya, kapsul tidak akan mudah berdifusi lepas dari sel dan karenanya
menyelubungi dinding sel. Bahan lendir yang lebih mudah larut yang
diekskresikan oleh sel melebur di dalam medium tempat tumbuhnya organisme
tersebut. Produksi tipe-tipe tertentu bahan kapsul dapat sangat menambah
kekentalan medium tempat organisme itu dibiakkan.
Kapsul bakteri penting artinya baik bagi bakterinya maupun bagi organisme
lain. Bagi bakteri, kapsul merupakan penutup lindung dan juga berfungsi sebagai
gudang cadangan makanan. Kapsul bakteri-bakteri penyebab penyakit tertentu
menambah kemampuan bakteri tersebut untuk menginfeksi. Bila bakteri itu
kehilangan kapsulnya sama sekali, maka bakteri tersebut dapat kehilangan
virulensinya dan dengan demikian kehilangan kemampuannya sebagai
penyebab infeksi. Bahan kimia kapsul yang utama terdiri dari polisakarida
kompleks seperti levans, dekstran, dan selulosa. Pewarnaan kapsul lebih sulit
daripada jenis lain dari prosedur pewarnaan diferensial karena bahan kapsul
yang larut dalam air dan dapat lepas dan dihapus dengan pencucian kuat.
Pewarnaan tidak boleh dipanaskan karena penyusutan sel yang dihasilkan dapat
menciptakan zona bening di sekitar organisme yang merupakan artefak dan
dapat salah untuk proses pewarnaan kapsul. Pewarnaan kapsul menggunakan
dua reagen.
Pewarnaan kapsul bertujuan untuk membedakan kapsul dari sel bakteri.
Pewarnaan kapsul disebut juga pewarnaan negatif, karena materi yang akan
dilihat (kapsul) tidak diwarnai, yang diwarnai adalah daerah latar belakang dan
badan sel bakterinya. Kapsul tidak dapat diwarnai dengan pewarna asam
maupun basa karena kapsul adalah materi yang tidak memiliki muatan. Sebelum
dilakukan pewarnaan dan diamati, sel bakteri harus difiksasi dulu pada object
glass. Fiksasi bertujuan untuk menginaktivasi enzim yang mungkin dapat
merusak morfologi atruktur sel sehingga sel tidak berubah saat diwarnai dan
diamati.

III. Metodologi

Sebelum melakukan teknik pewarnaan sporan dan bakteri, disiapkan alat-alat

berupa object glass bersih, tabung reaksi bersih, sengkelit/jarum Ose, pembakar
spiritus, pipet tetes bersih, penjepit kayu, mikroskop, kertas saring, dan kertas lensa.
Disiapkan juga bahan-bahan yang meliputi kultur/biakan Bacillus subtilis, Klebsiella
pneumoniae berumur 3 hari dalam media Nutirent Agar miring, minyak inersi, dan
xylol. Bahan berupa pereaksi dan zat warna yang terdiri dari gentian violet, karbol
Fuchsin, NaCl 0,9% (NaCl fisiologis), methylen blue, tinta Cina, H2SO4 1%.

3.1 Pewarnaan Spora

Sebelum masuk ke Laboratorium Mikrobiologi praktikan memakai jas
laboratorium yang bersih lengkap dengan masker, penutup kepala, dan sarung
 tangan, kemudian mensterilkan diri sendiri sebelum memulai pekerjaan dengan
cara mencuci tangan dengan sabun di wastafel, lalu tangan dibersihkan lagi
dengan alkohol 70%. Bersihkan pula meja laboratorium dengan alkohol 70% dan
diletakkan 2 lampu spiritus yang telah diberi jarak sekitar 20 cm. Pengerjaan
dilakukan di antara 2 lampu spiritus agar dicapai media yang steril. Teknik
pengerjaan ini disebut teknik aseptis.
Disiapkan alat-alat berupa tabung reaksi bersih, object glass, mikroskop,
lampu spiritus, dan kertas saring serta bahan-bahan yang berupa kultur bakteri
dari Nutrient Agar miring, NaCl 0,9%, karbol Fuchsin, H2SO4 1%, dan methylen
blue. Dibuat suspensi bakteri pekat dalam 0,5 mL NaCl 0,9% dalam tabung
reaksi bersih kemudian ditambahkan karbol Fuchsin (pewarna primer) sama
banyaknya dengan NaCl tadi (0,5 mL). Dipanaskan suspensi tersebut di atas api
kecil selama 6 menit atau di dalam water bath 80 selama10 menit.
Setelah dilakukan pemanasan terhadap suspensi, dibuat preparat dari
suspensi tersebut di atas object glass, dikeringkan dan difiksasi (direkatkan).
Direndam suspensi yang telah difiksasi dengan H2SO4 1% untuk membuang
kelebihan zat warna yang berlebihan selama 1-3 detik. Dibilas air kran sebagai
decolorizing agent dengan melewatkan air kran tersebut di ibu jari atau telunjuk
agar bakteri yang telah direkatkan tidak hilang saat pencucian. Preparat bakteri
yang telah dibilas dituangi dengan methylen blue dan didiamkan selama 2-4
menit. Dibuang zat warna dengan dibilas air kran. Dikeringkan dengan kertas
saring atau didiamkan di udara. Diamati hasil pewarnaan di bawah mikroskop.

3.2 Pewarnaan Kapsul

Disiapkan alat-alat berupa object glass, mikroskop, lampu spiritus, dan
kertas saring serta bahan-bahan yang berupa kultur bakteri dari Nutrient Agar
miring, NaCl 0,9%, tinta Cina, dan karbol Fuchsin. Langkah awal diteteskan NaCl
0,9% di atas alas object glass, kemudian ditanamkan 1 mata sengkelit atau
secukupnya biakan bakteri. Diletakkan di sebelah campuran tadi satu tetes tinta
Cina, dicampurkan tinta Cina dengan bakteri dengan cara menghapuskannya
dengan alat object glass lain seperti membuat preparat rekatan darah.
Dikeringkan preparat yang telah dihapuskan dengan cara difiksasi. Dituangi
karbol Fuchsin dan didiamkan selama 5-10 menit. Zat warna yang berlebih
dibuang dan dibilas dengan air kran. Dikeringkan preparat di antara kertas saring
atau di udara dan diamati hasil pewarnaan.

IV. Hasil Praktikum dan Pembahasan

Jenis Pewarnaan Gambar Keterangan

Nama bakteri: Bacillus
subtilis
Bentuk: Basil/batang
Spora Warna sel bakteri: Ungu
Warna dan bentuk spora:
merah oval
Letak spora: Terminal
Nama bakteri: Klebsiella
pneumoniae
Bentuk dam warna sel:
Basil dan merah
Warna latar belakang:
Kapsul Hitam
Bentuk dan warna
selubung: Basil dan tidak
berwarna
Zat warna: Karbol Fuchsin,
tinta Cina
 1. Pada bakteri Bacillus subtilis spora yang terbentuk dengan hasil pewarnaan akan
berwarna merah dan bakterinya sendiri akan berwarna biru/ungu.
2. Bentuk spora pada bakteri Bacillus subtilis adalah oval dengan letak terminal
terhadap sel induk.
3. Pada bakteri Bacillus subtilis spora tersebut merupakan alat untuk
mempertahankan hidup, di mana spora akan muncul jika bakteri merasa kurang
mendapat nutrisi, suhu yang tidak mendukung pertumbuhannya, dan karena
adanya senyawa kimia yang mengancam kehidupannya.
4. Jenis spora yang diamati pada praktikum kali ini adalah endospora.
5. Pada bakteri Klebsiella pneumoniae kapsul yang terbentuk terlihat menyelubungi
badan sel bakteri. Berupa suatu bagian yang tidak berwarna dengan latar
belakang hitam.
6. Bentuk kapsul yang terlihat pada Klebsiella pneumoniae adalah oval dan tidak
berwarna.
7. Pewarnaan kapsul disebut juga sebagai pewarnaan negatif, karena materi yang
akan dilihat (kapsul) itu sendiri tidak diwarnai, yang diwarnai adalah daerah latar
belakang dan badan sel bakterinya.
8. Kapsul tidak dapat diberi zat warna dengan pewarna asam maupun pewarna
basa karena kapsul adalah materi yang tidak memiliki muatan (muatan positif
atau muatan negatif).
9. Kapsul dan spora umumnya ditemukan pada bakteri yang memiliki patogenitas
tinggi, di mana kapsul dan spora akan melindungi sel bakteri dari mekanisme
fagositosis sel inang dan digunakan juga sebagai gudang makanan cadangan.
10. Bila bakteri kehilangan kapsul, maka ia dapat kehilangan virulensinya dan
dengan demikian kehilangan kemampuannya menyebabkan infeksi.
11. Kapsul berupa lapisan lendir yang menyelubungi dinding sel dan bila ditemukan
di dalam makanan, maka makanan tersebut akan menjadi berlendir.

V. Kesimpulan
1. Cara menidentifikasi bakteri patogen salah satunya dengan pewarnaan bakteri
diferensial, yaitu pewarnaan spora dan pewarnaan bakteri.
2. Letak spora saat dilakukan pewarnaan adalah terminal terhadap sel bakteri,
sedangkan bentuk kapsul saat dilakukan pewarnaan adalah lonjong dan tak
berwarna.
3. Warna yang dihasilkan spora setelah dilakukan teknik pewarnaan adalah
berwarna merah, dan kapsul tidak berwarna.

VI. Daftar Pustaka

1. Cappuccino, James dan Natalie Sherman. -. Microbiology a Laboratory Manual
Eight Edition. Pearson Benjamin Cummings. New York. hal.
2. Pelczar, Michael J. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Universitas Indonesia Press.
Jakarta. hal. 112-113 dan hal. 123-128

VII. Lampiran

Pewarnaan Kapsul (Klebsiella

pneumoniae)
Pewarnaan Spora (Bacillus subtilis)