CUESTIONARIO PRACTICA NO.

8 AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIN DE
MICROORGANISMOS.

1. Que aplicaciones practicas tienen los mtodos de cuantificacin de

microorganismos?
La medida cuantitativa del desarrollo de los microorganismos nos permite juzgar
que un conjunto de condiciones han sido buenas porque las bacterias se desarrollan
rpidamente, pero la cosecha final total puede no ser tan grande como las obtenidas con
otro conjunto de condiciones en las que el desarrollo de las bacterias se inicia lentamente
pero se continua aumentando durante un periodo mas largo. Es importante para interpretar
las diferentes respuestas del desarrollo hipottico de la misma bacteria en medios de
composicin diferente.

2. Que tcnicas se emplean comnmente para lograr el aislamiento de bacterias y

obtener cultivos puros?

Podemos distinguir dos tipos, aquellos que se realizan en medios lquidos y los que se
realizan en medios slidos.

a) Medio lquido:

- tcnica de dilucin lmite o diluciones en serie: si el microorganismo que se busca en un

cultivo mixto se encuentra en mayor cantidad que cualquiera de los otros microorganismos,
es posible obtenerlo en cultivo puro mediante una serie de diluciones en tubo, del medio de
cultivo apropiado. Cuando la muestra est muy diluida contendr solamente la bacteria que
buscamos. Es recomendable confirmar mediante el procedimiento de la siembra en placa la
pureza del cultivo que se aisl de la manera descrita.

b) Medio slido:

- tcnica de siembra por estras en placa: con un asa de platino se pasa una porcin de la
muestra a la superficie de un medio de cultivo hecho a base de agar y se siembra en el
medio por estras.

- tcnica de siembra por difusin en placa (distribucin del inoculo de manera homognea
por toda la placa -al azar-): se usa una varilla de cristal estril para esparcir la muestra. Esta
operacin hace posible adelgazar la muestra de tal manera que en la superficie del agar
queden las bacterias separadas unas de otras.

- tcnica de vertido en placa (tambin distribucin de manera homognea): el medio (agar)

se mantiene en estado lquido para permitir que el inoculo se distribuya adecuadamente en
el medio. Una vez sembrado el medio se pone en cajas de Petri, se deja solidificar y
despus se incuba. Como algunos microorganismos quedan atrapados entre el agar, se
observarn colonias tanto en la superficie como entre el medio cuando ste solidifica.

Aislamiento directo en medio selectivo y diferencial (Tcnica de enriquecimiento del

cultivo): el principio de esto es procurar un ambiente de cultivo diseado (medio de
composicin conocida y condiciones especficas de incubacin) que puedan favorecer el
desarrollo de cierto tipo concreto de bacterias que necesitemos pero que no sea adecuado
para las dems.

Tcnica de aislamiento de una sola clula mediante un micromanipulador. Se asla una

sola clula utilizando este aparato

3. Mencione 5 medios de cultivo selectivos (y/o diferenciales) as como las bacterias

generalmente --------- en cada uno de ellos.

Medio de cultivo selectivo y/o diferencial Bacterias que crecen

Agar Eosina-azul de metileno Enterobacteriaceae sp. Klebsiella, Eschericea
EMB coli. Serratia, Hafnia
Agar MacConkey Agar selectivo para el aislamiento de
Salmonellas, Shighellas y, bacterias coliformes.
Enterobacteriaceae sp.
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Salmonella typhimurium
Shigella flexneri
Proteus mirabilis
Enterococcus faecalis
Agar Loewenstein-Jensen Mycobacterium sp.
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium avium
Mycobacterium gordonae
Mycobacterium bovis

4. Que ventajas y desventajas encuentra entre los siguientes mtodos de

aislamiento:
a) Por estra cruzada.
Ventajas. Se puede utilizar esta tcnica en lugar de placas vertidas; permite el desarrollo de
las colonias puras por separado; puede o no realizarse una dilucin.
Desventajas. El estriado debe hacerse paciente y cuidadosamente; debe tenerse mucho
cuidado de no contaminar la placa al abrir la caja petri; se debe permitir que el agar este
bien endurecido antes de la siembra y al hacer las estras no debe romperse el medio

b) Por diluciones seriadas.

Ventajas. Permite aislar un tipo de microorganismo de un cultivo mixto para obtener
finalmente puro.
Desventajas. Solamente es til cuando la bacteria que se intenta aislar esta presente en
cantidades mucho mayores que las otras con las que se encuentra mezclada.

5. Describa el mtodo de cuantificacin de la gota o de Miles y Misra.

Consiste en una sobre las placas de agar algunas gotas del material. Despus de
incubacin, se cuenta las colonias en la superficie sembrada.
 Se preparan cuentagotas que den 50 gotas. Son pipetas pasteur que se pasan a travs
del agujero no. 59 (0,95mm) de un calibrador de alambre Starratt y que se corta
exactamente por encima del orificio. Cuando se prueben, deben dar gotas de 0,02ml, es
decir, 50 gotas por ml. Se permite una tolerancia de 2 gotas. La placa de un medio
conveniente se seca muy bien antes de su empleo. Se dejan gotear al menos cinco gotas que
cada dilucin de la muestra sobre todo placa, desde una altura no mayor de dos centmetros
(para evitar salpicaduras). Se vuelva colocar la tapa, pero no se invierten las placas hasta
que las gotas estn secas. Despus de incubarlas, se escogen las placas que tengan colonias
aisladas en el rea en la que echan unas gotas, de preferencia y los que hayan dado menos
de 40 colonias por gotas (el ideal es de 10 a 20). Se cuentan las colonias de cada gota
utilizando una lupa. Se divide el nmero total de colonias contadas por el nmero de gotas
determinado, y se multiplica por 50 (para convertir la cifra a colonias por ml) y por la
dilucin emplear.
Este mtodo se apresta a una normalizacin arbitraria; por ejemplo, haca en menos
de 10 colonias en 5 gotas de la muestra, sta cifra indica en que al menos de 100
colonias/ml en tal muestra. Si son numerosas (ms de 40 colonias), entonces el recuento de
colonias por ml es mayor de 2000.

6. Describa el fundamento bsico de los siguientes instrumentos tiles para realizar

una cuenta total de clulas en suspensin.
a) Cmara de conteo. es una placa de 2-3 mm de gruesa con un rea en el centro,
llamada la plataforma, que se haya rodeada por algn anillo excavado, la que es 0,02 mm
ms baja que el resto de la placa. La parte superior de la placa est esmerilada, de forma
que cuando un cubreobjetos pticamente plano se pone sobre el centro de la depresin, la
profundidad es uniforme. Sobre la plataforma ah un rea de 1 mm2 dividida en 400
pequeos cuadros, cada uno de los cuales tiene un rea de 0,0025mm2. El volumen sobre
cada cuadrado es de 0,02 x 0,0025mm3; esto es 0, 00005 ml. a la suspensin iba a ser
contada se le aaden unas gotas de formalina. Se coloca una asa de la suspensin sobre el
rea cuadrculas y se pone en cubreobjetos. Si el cubreobjetos se aplican correctamente,
aparecern entre las dos superficie ptica planas crculos concntricos coloreados llamados
anillos de Newton. Se dejan sedimentar las bacterias durante 5 minutos.
Se examina bajo objetivo de 0,4mm, con luz reducida, si es posible que en contraste
de fase o en campo oscuro. Se cuentan las bacterias en 50-10 cuadros escogidos al azar, de
forma que la cifra total contada sea de 500 aproximadamente. Se divide sta cifra por el
nmero de cuadros contados. Se multiplica por 20 000000 y por el factor de la dilucin
original para obtener el nmero de bacterias por ml. Se repite dos veces ms y se halla la
media de los tres recuentos.

b) Nefelmetro. Instrumento para medir partculas suspendidas en un lquido. Esto lo

hace empleando una fotocelda colocada en un ngulo de 90 con respecto a una fuente
luminosa. La densidad de partculas es entonces una funcin de la luz reflejada por las
partculas a la fotocelda. Cuanta ms luz se refleje en una determinada densidad de
partculas depende de las propiedades de las partculas como su forma, color y
reflectividad. Estableciendo a una correlacin de trabajo entre turbidez y slidos
suspendidos (que ms til, pero generalmente una ms difcil de cuantificacin de
partculas) debe ser establecido independientemente para cada situacin. La unidad de
turbidez para un nefelmetro calibrado se llama Unidad de Turbidez Nefelomtrica, NTU
UTN.

c) Contador Coulter (Coulter Counter). El instrumento emplea un sistema de

medicin no ptico que provee un rango de medicin que excede las 6000 clulas
individuales por segundo con un intervalo de conteo de 15 segundos. Una suspensin de
clulas sanguneas es pasada a travs de un pequeo orificio simultneamente con una
corriente elctrica. Las clulas sanguneas individuales pasando a travs del orificio
producen un cambio de resistencia en el orificio el cual est determinado por el tamao de
la clula. El sistema cuenta las clulas individuales y provee distribucin de tamaos. El
nmero de clulas contadas por muestra es aproximadamente 100 veces mayor que los
recuentos microscpicos, reduciendo el error estadstico aproximadamente 10 veces.

El nmero de pulsos elctricos indica la cantidad de partculas que pasan a travs de

la apertura y el tamao de los pulsos es proporcional al volumen de las partculas. Los
contadores COULTER realizan este recuento por triplicado para eritrocitos, leucocitos y
plaquetas

7. Describa el fundamento bsico de las siguientes tcnicas tiles para realizar la

cuenta viable de clulas bacterianas en suspensin.
a) Tincin vital. Son tinciones que se utilizan para preparados en fresco, es decir,
sobre microorganismos que sern observados vivos. Los colorantes utilizados no matan al
microorganismo ya que se concentra en el soma de los mismos sin afectar la viabilidad. los
colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los
materiales celulares. Muchos colorantes utilizados son molculas cargadas positivamente
(cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados
negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ej: azul de
metileno, cristal violeta y safranina. Otros colorantes son molculas cargadas
negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados
positivamente, tales como muchas protenas. Ej: la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo.
Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se
combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la
localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Ej: negro Sudn.

b) Filtracin. Los lquidos que contienen las bacterias se hacen pasar a travs de un
filtro que retienen los grmenes. Se deja despus que el filtro absorba un medio de cultivo y
se incuba, pudiendo contarse las colonias que se desarrollen.
Lo aparatos portafiltros estn hechos de metal o de vidrio y se componen de un
embudo inferior, que llevan una plataforma de cartn comprimido rodeado de un anillo de
goma de silicona. Los filtros Francisco derivados de ester de celulosa poroso, de unos
120m de grueso. Los poros de las caras superiores tienen un dimetro de 0,5-1,0m,
agrandndose a 3-5m en la cara inferior. De esta forma, las bacterias quedan detenidas en
la parte superior, pero el medio de cultivo puede llegar fcilmente a ella por capilaridad. En
la superficie de cada filtro hay marcada una cuadrcula para facilitar el recuento.

c) Mtodo de diluciones seriadas. Si el microorganismo que se busca en un cultivo

mixto se encuentra en mayor cantidad que cualquiera de los otros microorganismos, es
posible obtener lo en cultivo puro mediante una serie de diluciones en tubo, del medio de
cultivo apropiado. Cuando la nuestra es que muy diluida contendr solamente la bacteria
que se busca. Es recomendable confirmar mediante el procedimiento de la siembra en placa
la pureza del cultivo que se aisl de la manera descrita.

8. Indique como se prepara de manera general un tubo para trabajar la escala de

McFarland.

Mtodo de preparacin del 0,5 estndar de McFarland

Reactivos:
1% Cloruro de Bario (BaCl2) anhdrido
1% cido sulfrico (H2SO4) puro y fro

Mtodo de Preparacin:
1. Aadir 0,5 mL de 1% BaCl2 a 99,5 mL de 1% de H2SO4.
2. Revuelva para mantener en suspensin.
3. Mezclar completamente ante de proceder al siguiente paso.
4. Distribuya 5 mL de la solucin de McFarland en tubos de dimetros similares.
Se sugiere usar los mismos tubos que se utilizan rutinariamente para ajustar la densidad de
las suspensiones antes de la inoculacin.
5. Cuando estos estndares estn en suspensin completa, la turbidez equivale a un cultivo
que contiene 1,5 x 108 clulas.
6. Los tubos que contienen la solucin de 0.5 McFarland se deben guardar en un lugar
oscuro, a temperatura ambiente.

9. Como se realiza la cuantificacin de hongos y bacterias filamentosas?

| Se puede emplear el medio de cultivo desarrollado por Schaufus para el recuento de
hongos y levaduras en productos azucarados y otras muestras, por la tcnica de filtracin
por membrana.
Siembra
- Filtrar la muestra a analizar. El volumen que se filtra depende de la probable
contaminacin de la muestra.
- Embeber la almohadilla con el caldo m-Recuento de Hongos y Levaduras hasta la
saturacin (la cantidad de medio de cultivo depende del grado de absorcin de la misma).
- Apoyar la membrana filtrante sobre la almohadilla embebida con el medio de cultivo.
- Incubar las placas a 30 C durante 72 horas.

El recuento debe hacerse en aquellas placas que contengan entre 20 y 200 UFC.
Un conteo inferior escapa a los lmites de error del mtodo. La concentracin microbiana
debe expresarse como el nmero de Hongos y Levaduras presentes en 100 ml de la
muestra.

Recuento de hongos y levaduras = N de colonias X 100

ml de muestra filtrada