Anda di halaman 1dari 9

TEKNIK BIOKIMIA

ANDITA UTAMI, M.Si

KELOMPOK IV
Imam Yusuf Hanura F1C114001
Nevira Tria Yesicha F1C114034
Abdi Wahyudi F1C114051
Siti Aisyah F1C115004
Giotama Demando F1C115016
Puja Iklima F1C115024
Rinaldi Satria F1C115027

CHROMATOGRAPHIC
METHODS FOR PROTEIN PURIFICATION

KELOMPOK IV
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS JAMBI
JURUSAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM, PROGRAM STUDI KIMIA
I. Kromatografi Pertukaran Ion

Kromatografi pertukaran ion didasarkan pada interaksi ionik antara fase


diam yang bermuatan positif (+) atau negatif (-) dengan fase gerak yang
muatannya berlawanan. Fase gerak yang muatannya berlawanan dengan fase
diam akan tertahan, sedangkan yang muatannya sama akan lolos (Gambar 1).

Gambar 1. Kromatografi Pertukaran Ion

1.1 Sifat-sifat Protein Bermuatan


Protein adalah ampholit kompleks yang memiliki muatan positif dan
negatif. Titik isoelektrik (pI) dari protein (pH dimana muatan adalah nol)
tergantung pada proporsi residu asam amino yang terionisasi dalam strukturnya.
Muatan positif biasanya diberikan oleh arginin, lisin, dan histidin, tergantung
dari pH bufer di sekitarnya. Amina bebas juga memberikan muatan positif pada
pH <8. Muatan negatif biasanya diberikan oleh residu aspartat dan glutamat dan
karboksil. Hampir semua residu ini terionisasi pada pH >6. Pada pH >8, sistein
mungkin juga akan terionisasi.
Gugus bermuatan hampir selalu berada di bagian permukaan dari
protein. Pengecualian untuk metallo protein, dimana ion logam internal sering
dikoordinasikan oleh residu bermuatan. Efek dari gugus tetangga dan posisi
dalam struktur tersier akan mempengaruhi pKa untuk gugus rantai samping.
Pengaruh gabungan dari semua rantai samping yang bermuatan akan
memberikan pH isoelektrik yang berbeda-beda, tergantung pada pH zat terlarut.
Umumnya, kromatografi pertukaran anion dilakukan di atas pH
isoelektrik, sedangkan kromatografi kation dilakukan di bawah pH isoelektrik.
Interval pH dilakukan di wilayah pH dimana protein bersifat stabil. Untuk
memperoleh adsorpsi yang baik, pH bufer yang dipilih haruslah berada
setidaknya 1 unit di atas (pertukaran anion) atau di bawah (pertukaran kation)
pH isoelektrik. Interaksi antara protein dan penukar ion tidak hanya bergantung
pada titik isoelektrik dan kekuatan ion, tetapi juga pada distribusi muatan di
permukaan protein.

1.2 Fase Diam


Sifat-sifat penukar ion juga akan mempengaruhi pemisahan. Penukar ion
diklasifikasikan sebagai lemah atau kuat (Gambar 2).

Gambar 2. Kurva Ionisasi Beberapa Penukar Ion yang Umum Digunakan

Penukar ion golongan kuat memiliki gugus fungsi, misalnya sulfonat dan
amonium kuarterner, dengan nilai pKa di luar rentang pH 4-10. Sebaliknya,
penukar ion golongan lemah memiliki gugus fungsi ionik, misalnya karboksilat
dan dietil amonium. Dengan demikian, protein golongan lemah membutuhkan
pH yang sangat tinggi atau sangat rendah untuk terionisasi dan hanya dapat
dipisahkan menggunakan penukar ion kuat. Sebaliknya, protein golongan kuat
untuk beberapa alasan sangat baik dimurnikan menggunakan penukar ion
lemah, seperti mencegah denaturasi dan meningkatkan resolusi pemurnian.

1.3 Fase Gerak


Konduktivitas dan pH rendah memberikan hasil pemurnian yang lebih
baik. Pilihan bufer juga memengaruhi pemisahan. Sebaiknya gunakan bufer yang
stabil dan mudah untuk dihilangkan.

Strategi Elusi
Biasanya, protein dengan muatan yang sama seperti resin akan melewati
kolom tanpa teradsorpsi, sedangkan protein dengan muatan berlawanan akan
teradsorpsi. Jika komponen sampel terhambat secara berbeda-beda, dan
dipisahkan dengan komponen pelarut yang konstan, komposisi bufer tidak perlu
diubah, dinamakan elusi isokratik.
Strategi umum untuk mencapai elusi adalah dengan meningkatkan
konsentrasi garam non bufer, seperti NaCl. Ion-ion ini bersaing dengan protein
untuk berikatan dengan resin. Protein dengan muatan lemah terelusi pada
konsentrasi garam rendah, sedangkan protein kuat terelusi pada konsentrasi
garam yang lebih tinggi.
Perubahan bufer untuk elusi dapat ditambahkan secara bertahap, dengan
elusi bertahap atau kontinu. Dalam elusi gradien (Gambar 3) konsentrasi bufer
berubah bertahap terus menerus.

Gambar 3. Kromatogram Menggunakan Elusi Gradien

1.4 Kelebihan
Kromatografi pertukaran ion adalah salah satu teknik pemurnian protein
yang paling sering digunakan untuk memisahkan protein, polipeptida, asam
nukleat, polinukleotida, dan biomolekul lainnya. Keuntungan metode ini adalah
elusi umumnya dilakukan pada kondisi ruang sehingga protein dapat
mempertahankan konformasi asli selama proses kromatografi. Kelebihan lain dari
metode ini adalah proses pemisahan yang mudah dan resin penukar ion dapat
dibersihkan dan dipakai hingga ratusan siklus. Kekurangan metode ini hanya
keterbatasan dalam selektivitas.
II. Kromatografi Afinitas

Kromatografi afinitas memanfaatkan ikatan antara ligan dengan suatu


protein tertentu dalam melakukan pemurnian. Sebuah ligan spesifik digunakan
untuk mengelusi protein tertentu (Gambar 4). Ikatan yang terjadi antara protein
dengan ligan adalah reversibel. Karena ligan bersifat spesifik, maka komponen
sampel yang tidak diinginkan akan lolos.

Gambar 4. Matriks Afinitas Mengikat Protein Target: A) Matriks; B) Spacer

Arms; C) Ligan; dan D) Protein Target

2.1 Fase Diam


Bahan gel yang ideal harus memiliki karakteristik tertentu, seperti
memiliki gugus fungsi yang spesifik untuk dapat berikatan secara kovalen dengan
protein target, memiliki luas permukaan yang relatif besar, stabil, inert dalam
bufer, dan memiliki pori untuk menghindari interaksi non spesifik dengan
protein. Fase diam yang populer adalah agarosa. Juga tersedia beberapa matriks
sintesis, seperti ikat silang dekstran, polistirena, poliakrilamida, selulosa, kaca
berpori, dan silika.

Ligan
Ligan yang digunakan harus mampu membentuk kompleks reversibel
dengan protein yang akan diisolasi. Stabilitas kompleks harus cukup tinggi.
Namun, dalam prosedur pencucian untuk memisahkan kompleks harus mudah
dilakukan. Ligan yang dipilih juga harus kompatibel dengan pelarut.

Spacer Arms
Untuk menghilangkan halangan sterik antara matriks dan ligan (agar
protein target mudah diikat), maka ditambahkan spacer arms. Spacer arms
berfungsi untuk memberi jarak antara matriks dengan ligan. Panjang optimal
spacer arms adalah 6-10 atom karbon.

Ligan Kopling
Umumnya, prosedur untuk mobilisasi ligan terdiri dari tiga langkah.
Pertama, matriks diaktifkan untuk membuatnya reaktif terhadap gugus fungsi
pada ligan. Kedua, ligan kovalen dihubungkan melalui beberapa reaksi kimia.
Terakhir, gugus fungsi aktif yang tidak bereaksi dinonaktifkan menggunakan
molekul yang cocok, seperti etanolamin. Metode untuk aktivasi dapat bervariasi
tergantung jenis ligan dan matriks. Beberapa metode yang umum digunakan
dapat dilihat pada tabel berikut.
Tabel 1. Beberapa Metode Umum Mobilisasi

2.2 Fase Gerak


Dalam kromatografi afinitas, kondisi bufer harus dioptimalkan untuk
memastikan bahwa molekul target berinteraksi secara efektif dengan ligan dan
dapat mempertahankan ikatan sebelum dielusi, sedangkan interaksi non spesifik
diminimalkan. Pada kebanyakan kasus, bufer juga digunakan untuk mencuci zat
terikat dari kolom tanpa mengelusi molekul target.
Variasi laju aliran dapat menunjukkan efek monumental pada tingkat
keberhasilan kromatografi ini. Bila sampel dipompa terlalu cepat maka ikatan
ligan dengan molekul target mungkin saja tidak terjadi.

Strategi Elusi
Prinsip desorpsi adalah mengubah kesetimbangan ikatan substansi
terserap dari fase gerak ke fase diam. Interaksi ligan dengan protein biasanya
didasarkan pada kombinasi interaksi elektrostatik dan hidrofobik dan ikatan
hidrogen. Yang melemahkan interaksi tersebut mungkin dapat berfungsi sebagai
eluen non spesifik yang efektif.
Perubahan pH menghasilkan perubahan tingkat ionisasi dari gugus-
gugus fungsi pada ligan dan pada molekul target. Karena itu, metode yang sering
digunakan untuk mengelusi ikatan kuat pada substansi non spesifik adalah
dengan menurunkan pH bufer (Gambar 5). Namun, dengan mempertimbangkan
stabilitas ikatan antara matriks, ligan, dan molekul terikat.

Gambar 5. Kromatografi Afinitas Menggunakan pH Bufer Rendah

Ketika ikatan didominasi oleh interaksi hidrofobik yang kuat, metode elusi
ekstrem kadang kala harus digunakan, seperti mengurangi polaritas termasuk
menggunakan garam cahotropic atau menggunakan agen denaturasi pada bufer.

2.3 Kelebihan
Kromatografi afinitas adalah pemurnian yang menyederhanakan proses
isolasi dengan menggunakan ligan yang mempunyai sisi pengikatan spesifik.
Sehingga, secara teoritis metode ini mampu memberikan tingkat pemurnian yang
sangat tinggi.

2.4 Penerapan
Kromatografi afinitas memiliki beberapa aplikasi dalam pemurnian
protein, seperti misalnya: immunoaffinity, pemurnian imunoglobulin, pemurnian
glycoconjugates, pemurnian DNA-binding protein, pemurnian reseptor protein,
pemurnian enzim, pemurnian dengan menggunakan dye ligan sintesis, isolasi sel,
dan isolasi nukleotida.
III. Kromatografi Pemisahan Ukuran

Semua teknik yang telah dibahas sebelumnya memisahkan protein


menurut beberapa sifat yang didasarkan pada interaksi dengan matriks tertentu
dan dengan demikian menimbulkan permasalahan untuk protein tanpa sifat-sifat
tersebut. Dalam metode ini, matriks terdiri dari partikel berpori dan pemisahan
terjadi berdasarkan perbedaan ukuran dan bentuk molekul (Gambar 6). Teknik
ini terkadang disebut sebagai filtrasi gel.

Gambar 6. Filtrasi Gel, Pemisahan Berdasarkan Ukuran Partikel

3.1 Saringan Molekuler


Meskipun pemisahan ini sering dianggap sesuai dengan berat molekul,
lebih tepatnya adalah karena perbedaan diferensial atau inklusi dalam partikel
berpori. Kemudahan difusi bergantung pada volume hidrodinamik, yaitu volume
yang timbul akibat gerakan molekul dalam air. Perbedaan antara volume
hidrodinamik dan berat molekul adalah bentuk partikel. Protein cenderung
berbentuk globular, sedangkan DNA atau polisakarida cenderung linear. Molekul
linear memiliki volume hidrodinamik jauh lebih besar daripada molekul globular,
sehingga molekul DNA 10.000 MW akan terelusi lebih dahulu daripada protein
10.000 MW.

3.2 Fase Diam


Matriks yang digunakan biasanya berupa polimer alam seperti agarosa
atau dekstran, tapi juga dapat terdiri dari polimer sintesis seperti poliakrilamida.
Gel dapat dibentuk melalui ikat silang untuk membentuk jaringan tiga dimensi.
Ukuran pori berbeda dapat diperoleh dengan memodifikasi jumlah ikat silang.
Banyak gel telah tersedia secara komersial dengan berbagai porositas. Silika
berpori makro juga telah digunakan, tetapi harus dilapisi dengan lapisan
hidrofilik untuk mencegah denaturasi protein.

3.3 Fase Gerak


Berbeda dengan jenis media lainnya, selektivitas matriks pada
kromatografi jenis ini tidak diatur dengan mengubah komposisi fase gerak. Fase
gerak adalah fase pembawa dan bukan salah satu faktor besar yang
mempengaruhi pemurnian. Namun, sampel mungkin memerlukan bufer dengan
pH tertentu untuk mempertahankan struktur dan aktivitas biologisnya.

Strategi Elusi
Karena molekul tidak terserap dan hanya tertahan pada matriks, protein
yang terelusi adalah yang memiliki ukuran besar terlebih dahulu. Tidak ada
sistem gradien yang diperlukan.

3.4 Kelebihan
Metode ini memberikan resolusi paling rendah dibandingkan metode lain.
Namun, metode ini seering digunakan karena kinerja yang sederhana dan
beberapa kelebihan yang tidak ditemukan dalam metode lain. Kelebihan utama
metode ini adalah tidak terjadinya interaksi kimia, sehingga tidak mempengaruhi
aktivitas biologis dari sampel yang ingin dimurnikan.

3.5 Penerapan
Metode ini memiliki berbagai penerapan baik dalam preparatif dan analisis
pemurnian protein. Porositas matriks dipilih sesuai tujuan. Contoh aplikasi dari
metode ini adalah pertukaran bufer, fraksionasi protein, dan penentuan ukuran
molekul.