Tecnolgico de Estudios Superiores

de Ecatepec

Divisin de Ingeniera Qumica

Bioqumica

Materia: MICROBIOLOGA
Profesora:
DRA. JOSEFINA PEREZ VARGAS

Prctica # 1 Tincin de Gram

Grupo: 3651

Equipo 4
Jimnez Gmez Beatriz
Adriana
Jurez Molina Karen
Martnez Hernndez Emmanuel
Ramrez Gmez Itzel Berenice
Ramrez Vlez Mayra
Rodrguez Jurez Monserrat
Rueda Rojas Jaime Ivn
Tenorio Snchez Daniela
Viveros Aguilar Areli

Fecha de entrega:
28 de Septiembre 2017
Contenido
INTRODUCCIN ............................................................................................................................. 1
Tinciones simples ...................................................................................................................... 1
Tinciones diferenciales .............................................................................................................. 1
Tincin de Gram ........................................................................................................................ 1
OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 2
A N T E C E D E N T E S ................................................................................................................... 2
M E T O D O L O G A..................................................................................................................... 3
R E S U L T A D O S ......................................................................................................................... 4
C O N C L U S I N ......................................................................................................................... 5
ANEXOS ......................................................................................................................................... 5
Anexo 1. Tincin diferencial de Gram ....................................................................................... 5
BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................................ 7
INTRODUCCIN

Una tincin es: Es el proceso por el cual las molculas de un colorante se

adsorben a una superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las
clulas de los microorganismos y poder realizar la observacin en microscopio
ptico. Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el
medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente
sin algn tratamiento previo. (santambrosio y ortega,2009)
La gran variedad de tinciones, ayudan a la identificacin de organismos
presentes en diferentes muestras. Permiten observar las preparaciones durante
mayor tiempo. La formacin de color se toma como resultado positivo e indica la
presencia del microorganismo en cuestin, mientras que la no formacin de color
es indicativo de su ausencia. Las tinciones son una manera prctica para
identificar los microorganismos ya que sus membranas se pintan para poder
diferenciar unos de los otros y realizar un examen ms detallado de la clula.
Las diferentes tinciones en el laboratorio microbiolgico tienen una utilidad
fundamental para el diagnstico y tratamiento oportuno de mltiples patologas
de etiologa infecciosas.( Tortora,Gerard J.(2007))

Tinciones simples
Una solucin simple es una solucin acuosa o alcohlica de un colorante bsico
nico. Aunque los diferentes colorantes se unen de forma especfica a las
distintas partes de las clulas, el propsito principal de una tincin simple es
destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las
estructuras celulares bsicas. El colorante se aplica al extendido fijado mediante
un tiempo determinado y luego se lava: a continuacin el porta objetos se seca
y se examina. En ocasiones se agrega una sustancia qumica a la solucin para
intensificar la coloracin; este aditivo se denomina mordiente. Algunas de las
tinciones simples utilizadas con frecuencia en el laboratorio son el azul de
metileno, la carbolfuesina el violeta de genciana (cristal violeta) y la safranina.
(Tortora,Gerard J.(2007))

Tinciones diferenciales
A diferencia de las tinciones simples, las tinciones diferenciales reaccionan de
modo diferente con las distintas clases de bacterias y por lo tanto pueden ser
empleadas para establecer una distincin entre ellas. Las tinciones diferenciales
utilizadas con ms frecuencia para las bacterias son la tincin de Gram y la
tincin cido-alcohol resistencia.

Tincin de Gram
La tincin de Gran fue desarrollada por el bacterilogo dans Hans Christian
Gram en 1884y es uno de los procedimientos de tincin ms tiles porque
1
permite clasificar las bacterias en dos grandes grupos: Grampositivas y
Gramnegativa.

OBJETIVOS
Realizar tcnicas sencillas para la observacin de microorganismos
Tener conocimientos previos de la preparacin de tinciones
Conocer y realizar adecuadamente el manejo del microscopio ptico para
la observacin de bacterias

ANTECEDENTES

Desde los inicios de la bacteriologa, la coloracin de Gram se ha convertido en

una herramienta fundamental para la taxonoma e identificacin bacteriana. Fue
ideada por el dans Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), un investigador
que trabajaba en el laboratorio de Carl Friedlander, el descubridor de la Klebsiella
pneumoniae. Friedlander haba mencionado la tcnica de su ayudante en una
publicacin de 1883, sin darle la valoracin debida y el 15 de marzo de 1884
Gram hizo su propia publicacin. En los aos siguientes la utilidad de la tcnica
se hizo evidente, hasta que en 1889, en la famosa serie que publicaba la editorial
Mason et fils en Pars, en el de Microbiologa se recomienda someter a todos los
cultivos a la tincin de Gram, como primera orientacin diagnstica. A pesar de
que con este valioso aporte Hans C. J. Gram entraba en la galera de los
inmortales, se cree que no supo valorar la trascendencia de su mtodo de
coloracin y esto se pudo observar cuando escribi He publicado un mtodo,
aunque estoy consciente de que todava es defectuoso e imperfecto; pero deseo
que en manos de otros investigadores pueda resultar de utilidad. Hoy en da la
coloracin de Gram es una de los pilares del diagnstico temprano de las
infecciones bacterianas (Jacome, 2013)

Posteriormente, el conocimiento de las estructuras de las membranas

bacterianas, en cuanto al aspecto fsico y su composicin molecular demostraron
que la coloracin de Gram distingue dos grupos de bacterias muy diferentes. Las
bacterias Gram positivas que presentan una gruesa capa de peptidoglicano, y
las Gram negativas con una delgada capa de peptidoglicano, a la que se le
superpone una capa de lipopolisacridos-lipoprotena, denominada membrana
externa. La presencia de esta membrana, marca la diferencia entre las bacterias
Gram negativas y las Gram positivas carentes de dicha estructura.
Las clulas Gram positivas debido a sus gruesa paredes de peptidoglicano y la
poca cantidad de lpidos no son permeables al alcohol acetona (decolorante)
puesto que este deshidrata la pared celular y cierra los poros, alterando y

2
afectando el pequeo espacio entre las molculas. El complejo cristal violeta-
yodo queda atrapado dentro de la pared celular tiendo a las bacterias Gram
positivas de color azul. Las bacterias Gram negativas tienen espacios en la
estructura de su pared celular y el alcohol acetona es un solvente de lpidos que
acta sobre la membrana exterior de la pared celular afectando la membrana
citoplasmtica donde se unen las molculas que componen el peptidoglicano.
De igual manera, la delgada capa de peptidoglicano no es capaz de retener el
complejo cristal violeta-yodo lo cual obliga a las clulas Gram negativas a
decolorarse, necesitando entonces la adicin de la safranina o la fuscina como
colorante de contraste para colorearse de rosado. (Ines, 2013)

METODOLOGA

tranfrir una pequea

muestra y fijarla en el
esterilizar el asa. dejar enfriar
porta objetos teniendo
cuidado de no quemarla

agregar lugol, dejar empapar la muestra con

enjuagar el cristal violeta
reposar por 1 min. y cristal violeta y esperar
con agua destilada.
lavar con agua. de 30a 60 S.

agregar safranina
agragar alcohol acetona
cubriendo la muestra
dejar reposar 15seg. y observar al microscopio.
por 15 seg. lavar y dejar
lavar
secar

3
RESULTADOS

Una vez realizado el mtodo de la

tincin de Gram, en esta muestra se
observaron e identificaron bacilos
Gram positivo, teidos de color
violeta.
La pared de la clula gram-positiva es
gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de peptidoglicano
(anexo 1)

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CONCLUSIN

La tincin es de importancia en el rea microbiana ya que, permite el estudio de

la estructura interna de la clula bacteriana, esta proporciona contrastes entre el
microorganismo y en el medio que se rodea, con ello permitiendo diferenciar
varios tipos morfolgicos. En todas las tinciones simples sin utilizacin de color
se puede donar que no se alcanza a ver la forma del microorganismo que se
encuentra en la muestra por la razn de que el colorante ayuda a distinguir la
forma del microrganismo. En cambio en las tinciones diferenciales en la cual se
realiz la tcnica de Gram se logra distinguir la forma del microorganismo y as
mismo poner clasificarlos en Gram positivo o Gram negativo

ANEXOS

Anexo 1. Tincin diferencial de Gram (santambrosio y ortega,2009)

Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien
la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las
bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en
este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga
elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de
bacterias). Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente:
el Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se
cubre con solucin Yodada durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo con agua,
decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina
(color de contraste) durante 1 2 min. Lavar y secar. Las bacterias gram-
positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias
constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula
bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir
la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez
es el peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en
varias capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico.
Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula gram-positiva es
peptidoglicano. La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una
capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una
membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas.
Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es peptidoglicano.

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Descripcin de la tincin de GRAM:
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una
solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son
lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las
clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn teidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El
ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El
I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta.
De nuevo tanto las clulas grampositivas como las gramnegativas se encuentran
en la misma situacin. Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una
mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-
cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras
que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos
de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se
debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la
mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana
exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana
citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano
es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora.
Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas
(tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente,
provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la
pared celular. Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava
azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las
clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es
un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la
coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras que las
grampositivas permanecen azules. Bacillus anthracis (Gram positivo)
Pseudomonas aeruginosa (Gram negativo) Deben destacarse algunos aspectos
cruciales de la tincin de Gram: 1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder
al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas.
2) EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del
tiempo para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas. 3) Cultivos de
ms de 24 horas de teidos pueden perder su habilidad de retener el complejo
cristal violeta - yodo.

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BIBLIOGRAFIA

Ines, Morales Parra Gloria. (2013). La coloracin de gram y su importancia en

el diagnstico microbiolgico. 27/septiembre/2017, de portalesmedicos.com
Sitio web: https://www.revista-portalesmedicos.com/revista-medica/coloracion-
gram-diagnostico-microbiologico/
Jacome, Luis Esau Lopez. (2013). Las tinciones bsicas en el laboratorio de
microbiologa. 27/septiembre/2017, de pdf Sitio web:
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
Tortora,Gerard J.(2007). Introduccion a la microbiologa Panamericana 9 ed.
Buenos Aires pags. 69-72
Santambrosio.E, Ortega.M, Garibaldi. P . (2009). Tincin y observacin de
microorganismos. . 24/09/2017, de Universidad Tecnologica Nacional Sitio web:
https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/pr
actico4.pdf