UJI SENSITIVITAS ANTIMIKROORGANISME DENGAN METODE DILUSI

1. TUJUAN :
Mampu melakukan penentuan MIC dan MBC suatu antimikrobia menggunakan teknik
dilusi dan mikrodilusi.
2. DASAR TEORI:
Konsentrasi hambatan minimumadalah konsentrasi antibiotik terendah yang
masih dapat menghambat pertumbuhan organisme tertentu. KHM dapat ditentukan
dengan prosedur tabung dilusi.prosedur ini digunakan untuk menentukan konsentrasi
antibiotik ang masih efektif untuk mencegah pertumbuhan pantogen dan
mengindikasikan dosis antibioik yang efektif dalam mengontrol infeksi pada pasien.
MIC suatu obat antimikroba yang dapat ditentukan dengan penggunaan serangkaian
tabung reaksi, yang masing-masing mengandung medium pertumbuhan ditambah
antimikroba dengan konsentrasi meningkat bertahap.
Menggunakan 1 seri tabung reaksi yang diisi media cair dan jumlah zat tertentu
sel mikroba yang di uji. Kemudian masing-masing tabung diisi dengan bahan yang
telah di encerkan secara serial. Selanjutnya seri tabung di inkubasi pada suhu 37 C
selama 18-24 jam dan diamati terjadinya kekeruhan pada tabung. Konsentrasi yang
rendah bahan pada tabung yang ditunjukan dengan hasil biakan yang mulai tampak
jernih ( tidak ada pertumbuhan mikroba) adalah KHM dari bahan uji. Konsentrasi
terendah pada obat pada biakan padat yang ditunjukan dengan tidak adanya
pertumbuhan koloni mikroba adalah KBM dari bahan terhadap bakteri uji
Resistensi bakteri adalah suatu sifat tidak terganggunya kehidupan sel bakteri oleh
antimikrobia. Secara umum resistensi di bagi dalam 3 kelompok:
Resistensi genetic
Terjadi mutasi spontan pada gen bakteri sehingga terjadi perubahan pada bakteri yang
semula sensitive terhadap suatu antimikrobia menjadi resisten. Bakteri dapat berubah
menjadi resisten akiba tmemperoleh suatu elemen pembawa factor resisten. Cara
transformasifactor resisten bakteri terjadi dengan jalan bekteri menginporlasi
factorresisten langsung dari media sekitarnya (lingkungan).
 Resisten non genetic
Bakteri dalam keadaan istirahat, biasanya tidak dipengaruhi oleh antimikrobia bakteri.
Bakteri ini dikenal sebagai persistem. Bila berubah menjadi aktif kembali, bakteri
kembali bersifat sensitiveterhadap antimikroba semula
Resistensi silan
Resistensi silang adalah keadaan resisten terhadap antimikrobayang juga
memperlihatkan sifat resisten terhadap antimikroba yang lain. Pada resisten silang,
sifat resistensi ditentukan oleh suatu lokusgenetic. Resistensi silang biasanya terjadi
antara antimikrobia dengan struktur yang hampir sama, misalnya antara beberapa
derivat tetetrasiklin.
Mekanisme resisten kuman terhadap antimikroba ada 5 yaitu :
1. Perubahan tempat kerja obat pada mikroba.
2. Mikroba menurunkan permeabilitasnya sehingga obat sulitmasuk ke dalam sel.
3. Mikroba membentuk jalan pintas untuk menghindari tahapyang dihambat oleh
mikroba.
4. Meninggkatkan produk enzim yang dihambat oleh antimikroba.
5. Inaktivasi oleh mikroba

DILUSI PADAT ATAU CAIR

Pada prinsipnya antibiotik diencerkan hingga beberapa konsentrasi. Pada delusi cair,
masing-masing konsentrasi obat ditambah suspensikuman dalam media. Sedangkan pada
delusi pada tiap konsentrasi obat dicampur dengan media agar, lalu ditambah kuman . (Lay,
1994)
Metode yang dapat dijadikan alternatif untuk menentukan konsentrasi hambat
tumbuh minimum ekstrak tanaman adalah metode dilusi yang mencakup makrodilusi
dan mikrodilusi. Metode mikrodilusi sedang dikembangkan karena memiliki
sensitivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan teknik difusi agar. Sensitivitas
mikrodilusi mencapai 30 kali lebih sensitif. Teknik mikrodilusi dapat digunakan untuk
beberapa sampel yang berbeda dengan jumlah sampel yang sedikit. Hal ini sangat
berguna jika jumlah senyawa antibakteri yang didapatkan sedikit dan terbatas. Teknik
mikrodilusi juga dapat membedakan antara efek bakteriostatik dan bakterisidal serta
dapat menentukan nilai konsentrasi hambat tumbuh minimum (KHTM) Mikrodilusi
tidak membutuhkan waktu yang lama karena pengujian dilakukan dalam waktu satu
kali pada satu microplate dengan jumlah sumur yang banyak. Metode mikrodilusi ini
dapat digunakan untuk berbagai macam mikroorganisme, murah, dan menghasilkan
hasil dapat diulang. Mikrodilusi menggunakan sampel yang diencerkan secara berseri.
Dasar penentuan antimikroba secara invitro adalah MIC (minimum inhibition
concentration) dan MBC (minimum bactericidal concentration). MIC merupakan
konsentrasi terendah bakteri yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri dengan
hasil yang dilihat dari pertumbuhan koloni pada agar atau kekeruhan pada pembiakan
kaldu. Sedangkan MBC adalah konsentrasi terendah antimikroba yang dapat
membunuh 99,9% pada biakan selama waktu yang ditentukan. Agar antimikroba
efektif pada MIC atau MBC. Sedapat mungkin mencapai tempat infeksi. Absorpsi
obat dan distribusi antimikroba akan mempengaruhi dosis, rute dan frekuensi
pemberian antimikroba untuk mendapatkan dosis efektif di tempat terjadinya infeksi.
Penentuan konsentrasi minimum antibiotik yang dapat membunuh bakteri /
minimumbactericidal concentration (MBC) dilakukan dengan menanam bakteri pada
perbenihan cair yang digunakan untuk MIC ke dalam agar kemudian diinkubasi
semalam pada 37C. MBC adalah ketika tidak terjadi pertumbuhan lagi pada agar.
Dengan teknik dilusi memungkinkan penentuan kualitatif dan kuantitatif dilakukan
bersama-sama.MIC dapat membantu dalam penentuan tingkat resistensi dan dapat
menjadi petunjuk penggunaan antimikroba. Kerugiannya metode ini tidak efisien
karena pengerjaannya yang rumit, memerlukan banyak alat-alat dan bahan serta
memerlukan ketelitian dalam proses pengerjaannya termasuk persiapan konsentrasi
antimikroba yang bervariasi

Kloramfenikol ( INN ) adalah bakteriostatik antimikroba. Hal ini dianggap sebagai

prototipikal antibiotik spektrum luas , di samping tetrasiklin. Kloramfenikol termasuk
ke dalam golongan antibiotik penghambat sintesis protein bakteri. Kloramfenikol
diisolasi pertama kali pada tahun 1947 dari Streptomyces venezuelae terisolasi oleh
David Gottlieb, dan diperkenalkan ke dalam praktik klinis pada tahun 1949, di bawah
nama dagang Chloromycetin. Ini adalah yang pertama antibiotik akan diproduksi
secara sintetis dalam skala besar. Karena ternyata Kloramfenikol mempunyai daya
antimikroba yang kuat maka penggunaan Kloramfenikol meluas dengan cepat sampai
pada tahun 1950 diketahui bahwa Kloramfenikol dapat menimbulkan anemia aplastik
yang fatal. Karena fungsi dengan menghambat bakteri protein sintesis, kloramfenikol
memiliki spektrum yang sangat luas kegiatan: ini aktif terhadap Gram-positif bakteri
(termasuk strain sebagian besar MRSA ), Gram-negatif dan bakteri anaerob. Hal ini
tidak aktif terhadap Pseudomonas aeruginosa , Klamidia , atau Enterobacter spesies.
Ini memiliki beberapa aktivitas terhadap Pseudomonas Burkholderia , namun tidak
lagi secara rutin digunakan untuk mengobati infeksi yang disebabkan oleh organisme
ini (itu telah digantikan oleh seftazidim dan meropenem ).
karenakloramfenikol memiliki aktivitas antimikroba berspektrum luas. Galur dianggap
peka apabila dapat dihambat oleh konsentrasi 8 g/ml atau kurang, kecuali N.
gonnorhoeae, S. pneumoniae, dan H. influenza, yang memiliki batas MIC yang lebih
rendah. Kloramfenikol terutama bersifat bakteriostatik, walupun dapat bersifat
bakterisida terhadap spesies tertentu, seperti N. gonnorhoeae, S. pneumoniae, dan H.
influenza. Lebih dari 95% galur bakteri gram-negatif berikut ini dihambat secara in
vitro oleh kloramfenikol 8,0 g/ml atau kurang., yakni N. gonnorhoeae, S.
pneumoniae, dan H. influenza. Demikian juga, kebanyakan juga bakteri anaerob,
termasuk kokus gram-positif dan Clostridium spp, serta batang-batang negative
termasuk B. fragilis dihambat oleh obat ini pada konsentrasi tersebut. Beberapa kokus
gram-positifaerob, termasuk Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae
(streptokokus kelompok B), dan S. pneumonia peka terhadap 8 g/ml. galur S. aerus
cenderung tidak begitu rentan, dengan MIC yang lebih besar dari 8 g/ml.
kloramfenikol aktif terhadap Mycoplasma, Chlamydia, dan Rickettsia..
Salmonella adalah suatu genus bakteri enterobakteria gram-negatif berbentuk
tongkat yang menyebabkan tifoid, paratifod, dan penyakit foodborne. Spesies-spesies
Salmonella dapat bergerak bebas dan menghasilkan hidrogen sulfida. Salmonella
dinamai dari Daniel Edward Salmon, ahli patologi Amerika, walaupun sebenarnya,
 rekannya Theobald Smith(yang terkenal akan hasilnya pada anafilaksis) yang pertama
kali menemukan bakterium tahun 1885 pada tubuh babi.
Salmonella adalah penyebab utama dari penyakit yang disebarkan melalui
makanan (foodborne diseases). Pada umumnya, serotipe Salmonella menyebabkan
penyakit pada organ pencernaan. Penyakit yang disebabkan oleh Salmonella disebut
salmonellosis. Ciri-ciri orang yang mengalami salmonellosis adalah diare, keram
perut, dan demam dalam waktu 8-72 jam setelah memakan makanan yang
terkontaminasi oleh Salmonella. Gejala lainnya adalah demam, sakit kepala, mual dan
muntah-muntah. Tiga serotipe utama dari jenis S. enterica adalah S. typhi, S.
typhimurium, dan S. enteritidis. S. typhi menyebabkan penyakit demam tifus (Typhoid
fever), karena invasi bakteri ke dalam pembuluh darah dan gastroenteritis, yang
disebabkan oleh keracunan makanan/intoksikasi. Gejala demam tifus meliputi demam,
mual-mual, muntah dan kematian. S. typhi memiliki keunikan hanya menyerang
manusia, dan tidak ada inang lain. Infeksi Salmonella dapat berakibat fatal kepada
bayi, balita, ibu hamil dan kandungannya serta orang lanjut usia.
Untuk menumbuhkan Salmonella dapat digunakan berbagai macam media, salah
satunya adalah media Hektoen Enteric Agar (HEA). Media lain yang dapat digunakan
adalah SS agar, bismuth sulfite agar, brilliant green agar, dan xylose-lisine-
deoxycholate (XLD) agar. HEA merupakan media selektif-diferensial. Media ini
tergolong selektif karena terdiri dari bile salt yang berguna untuk menghambat
pertumbuhan bakteri gram positif dan beberapa gram negatif, sehingga diharapkan
bakteri yang tumbuh hanya Salmonella. Media ini digolongkan menjadi media
diferensial karena dapat membedakan bakteri Salmonella dengan bakteri lainnya
dengan cara memberikan tiga jenis karbohidrat pada media, yaitu laktosa, glukosa, dan
salisin, dengan komposisi laktosa yang paling tinggi. Salmonella tidak dapat
memfermentasi laktosa, sehingga asam yang dihasilkan hanya sedikit karena hanya
berasal dari fermentasi glukosa saja. Hal ini menyebabkan koloni Salmonella akan
berwarna hijau-kebiruan karena asam yang dihasilkannya bereaksi dengan indikator
yang ada pada media HEA, yaitu fuksin asam dan bromtimol blue.

3. ALAT DAN BAHAN:

 Alat:
1. Pipet volume
2. Spuit
3. Tabung reaksi
4. Rak tabung reaksi
5. Koran
6. Inkubator
7.
Bahan:
1. Antibiotik kloramphenicol konsentrasi 200 ppm
2. LDF ( larutan dapar fosfat)
3. Suspensi Salmonella typosa

4. CARA KERJA:
Ambil 10 tabung reaksi diberi label 1-10
Tambahkan 1 cc LDR pada tabung reaksi no.2-9
Tambahkan 1 cc antibiotik kloramphenikol pada tabung reaksi no.1 dan 2
Lakukan pengenceran bertingkat dengan cara tabung reaksi no.2 dihomogenkan
dengan cara ditepuk-tepuk minimal 25 kali,kalau sudah homogen ambil 1 ml
masukkan no.3
No.3 dihomogenkan diambil 1 ml masukkan no.4
No.4 dihomogenkan diambil 1 ml masukkan no.5
No.5 dihomogenkan diambil 1 ml masukkan no.6
No.6 dihomogenkan diambil 1 ml masukkan no.7
No.7 dihomogenkan diambil 1 ml masukkan no.8
No.8 dihomogenkan diambil 1 ml masukkan no.9
No.9 dihomogenkan diambil 1 ml lalu buang
Tambahkan 1 cc suspensi salmonella typosa pada tabung reaksi no.2-10
Ikat dan bungkus dengan koran lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370 C
Setelah 24 jam kemudian lihat masing-masing tabung reaksi,lalu amati
 tabung no.1 sebagai kontrol antibiotik cairannya harus paling jernih karena tidak ada
bakteri.sedangkan tabung reaksi no.10 isinya bakteri seharusnya paling keruh

5. HASIL PENGAMATAN

Nomer Tabung reaksi konsentrasi Keterangan

1 200 Sangat jernih
2 100 Jernih
3 50 Jernih
4 25 Jernih
5 12,5 Agak keruh
6 6,25 Keruh
7 3,125 Keruh
8 1,562 Keruh
9 0,781 Keruh
10 0,391 Sangat keruh

Setelah didiamkan selama 24 jam pada incubator pada suhu 370C, salah satu larutan
pada no.1,2,3 dan 4 dilakukan subkultur pada media BSA ditanam di cawan
petri.setelah ditanam diinkubasi selama 48 jam pada suhu 370C

Berikut adalah gambar dari hasil inkubasi bakteri salmonella pada media BSA yang dimana
pada media diambil polesan dari tabung reaksi nomor 2 yang menunjukkan adanya
kejerniahan dari pengenceran pada 8 tabung tersebut, 2 tabung sebagai control antibiotika dan
control bakteri. Pada gambar dapat dilihat tidak terbentuk fish eye (mata ikan) pada media
BSA yang telah diinkubasi yang menandakan bahwa hasil praktikum ini menunjukkan MBC
(minimumbactericidal concentration) yang dimana MBC menandakan tidak terjadinya
pertumbuhan pada media BSA.

6. PEMBAHASAN
 MIC (Minimum Inhibitory Cincentration) adalah konsentrasi terendah dari antimikrobia
yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme, sedangkan MBC (Minimum
Bakteriofag Concentration) adalah konsentrasi terendah dari antimikrobia yang dapat
berfungsi untuk membunuh mikroorganisme. Parameter antara MIC dan MBC berbeda, untuk
MIC parameternya yaitu adanya kekeruhan namun tidak terlalu pekat sedangkan untuk MBC
parameternya yaitu kejerinhan yang menyekuruh. Terdapat pula istilah bakteriostatik dan
bakteriosidal. Bakteriostatik adalah senyawa kimia yang dapat menghambat pertumbuhan
bakteri, sedangkan bakteriosidal adalah senyawa kimia yang dapat membunuh bakteri.
Praktikum ini digunakan kontrol positif (+) serta kontrol (-). Kontrol positif berisi media dan
bakteri yang bertujuan untuk mengamati pertumbuhan bakteri. Untuk kontrol negatif hanya
berisi media yang digunakan sebagai pembanding tingkat parameter kejernihan. Metode dilusi
dibedakan menjadi dua yaitu dilusi cair(broth dilution) dan dilusi padat (solid dilution).
Metode dilusi cair mengukur kadar hambat minimum (KHM/MIC) dan kadar bunuh
bakteri(KBM/MBC). Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri pengenceran agen
antimikrobia pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen
antimikrobia pada kadar terkecil yang terlihat jenis tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji
ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutmya
dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan
diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah diinkubasi
ditetapkan sebagai KHM. Sedangkan metode dilusi padat atau solid dilution test, metode ini
serupa dengan metode dilusi cair namuun menggunakan metode padat. Keuntungan metode
ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji
beberapa mikroba uji. Pada hari kedua diamati tabung yang menunjukan pertumbuhan dengan
cara dikocok. Apabila tabung terlihat keruh (+) menandakan bahwa telah terjadi pertumbuhan
bakteri di dalam tabung dan apabila tabung terlihat jernih (-) menandakan tidak terjadinya
pertumbuhan bakteri atau telah terjadi penghambatan pertumbuhan bakteri oleh antibiotik
yang ditambahkan. Pada keadaan ini disebut MIC (Minimum inhibitory concentration) atau
konsentrasi terendah bahan antimicrobial yang mengahambat pertumbuhan. Dari hasil
percobaan didapatkan tabung 1,2,3 dan 4 berwarna bening,terutama untuk tabung 1 paling
jernih yang menunjukkan tidak terjadi pertumbuhan bakteri di dalam tabung tersebut.sehingga
tabung no.1 karena tidak ada bakteri dijadikan sebagai control antibiotik, sedangkan pada
tabung no.2,3 dan 4 agak jernih dibanding tabung-tabung yang lain. Hal ini menandakan
antibiotic pada tabung no.2,3 dan 4 mampu menghambat pertumbuhan bakteri. Sedangkan
pada tabung 5,6,7,8,9,dan 10 berwarna keruh yang menunjukkan terjadi pertumbuhan bakteri
di dalam tabung tersebut. Hal ini menandakan bahwa tidak dapat menghambat pertumbuhan
bakteri. Tabung no.10 paling keruh karena isinya hanya ada bakteri,sehingga dijadikan control
bakteri.semakin kekanan bakterinya semakin tumbuh dengan ditandai larutan semakin keruh.
dan ini di tunjukkan dengan pengujian dengan media BSA dimana diketahui media BSA
merupakan media yang spesifik untuk bakteri Salmonella, BSA tersebut berisi Bismuth Sulfit
Agar dan dimana pada media tersebut akan muncul koloni seperti mata ikan (Fish Eye) yang
menandakan adanya bakteri Salmonella thypi dan pada hasil praktikum kali ini tidak
menunjukkan adanya koloni mata ikan tersebut pada media BSA yang telah diinkubasikan
untuk menumbuhkan dari bakteri yang telah sebelumnya dipulaskan pada media BSA dari
tabung reaksi nomor 2 yang menunjukkan adanya kejernihan pada tabung tersebut, kejernihan
dan kekeruhan tersebut ditentukan dengan melihat dari acuan yaitu control bakteri dan control
antibiotiknya.Dengan tidak terbentukkan koloni mata ikan pada media menunjukkan bahwa
hasilnya adalah MBC (minimumbactericidal concentration) yang dimana MBC menandakan
tidak terjadinya pertumbuhan pada media BSA, dan dimana artinya pada konsentrasi 100 ppm
(konsentrasi antibiotika pada tabung yang dipulaskan atau tabung nomor 2) antibiotic itu
efektif terhadap bakteri untuk menghambat pertumbuhannya dan artinya mengindikasikan
bahwa pada dosis tesebut antibiotic efektif dalam mengontrol infeksi pada pasien yang
terjangkit penyakit yang disebabkan oleh bakteri Salmonella

7. KESIMPULAN
Pada hasil praktikum kali ini dalam penentuan kadar hambat minimal antibiotika dapat
disimpulkan :
Pada tabung nomor 1 merupakan control antibiotika dan pada tabung nomor 10
kontrol dari bakteri
Konsentrasi yang menunjukkan kejernihan ada pada tabung reaksi nomor 2
Media BSA yang digunakan atau Bismuth Sulfit Agar merupakan media yang paling
spesifik untuk bakteri Salmonella sp
 Tanda spesifik untuk bakteri mengetahui adanya bakteri salmonella pada media BSA
dapat dilihat dari pertumbuhan koloninya yang berbentuk mata ikan (fish eye) dimana
lingkaran luar berwarna merah lingkaran dalam berwarna hitam dan pinggirannya
berbentuk goresan seperti goresan pensil.
Hasil dari media BSA akan menunjukkan bahwa terjadi MBC pada hasilnya yang
menandakan bahwa pada konsentrasi tersebut dapat membunuh bakteri atau
menghambat pertumbuhan bakteri Salmonella thypii. Dimana konsentrasi antibiuotik
tersebut menunjukkan bahwa antibiotic tersebut masih efektif untuk mencegah
pertumbuhan bakteri Salmonella thypii

8. DAFTAR PUSTAKA
http://nurulfitriramadhani.blogspot.com/2013/01/uji-potensi-antimikrobial-
menggunakan.html
http://rizkaselaladora.blogspot.com/2011/07/kloramfenikol.html
Tim Penyusun, 2014. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Farmasi, Fakultas Farmasi
Universitas Setia Budi, Surakarta