CROMATOGRAFA DE

AMINOCIDOS

Objetivos
Aplicarlatcnicadecromatografaparalaseparacindeunamezclade
aminocidos.
Explicarlosfundamentosdelaseparacinenlacromatografaencapa
fina.
Analizarlosfactoresquemodificanlaresolucindestatcnica.



Antecedentesacadmicos
Fundamentosdelacromatografa.
Estructuraqumicadelosaminocidos.
Propiedadesfisicoqumicasdelosaminocidos.
Clasificacindelosaminocidos.
Pruebasparalaidentificacindeaminocidos.

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BioqumicaCelularydelosTejidosI

Introduccin
Los aminocidos son compuestos orgnicos que conforman la unidad
fundamentaldelasprotenas;poseendosgruposfuncionalescaractersticos:
ungrupoaminoNH2yungrupocarboxlicoCOOH.
Engeneral,todoslosaminocidosdeunhidrolizadodeprotenasondeltipo
alfa,quecorrespondenalasiguientefrmulageneral(Fig.1):
Uncarbonoconungrupoamino(NH2),ungrupocarboxlico(COOH)yun
grupolateralR(Fig.1).

Fig.1.Estructurageneraldelosaminocidos.

ElgrupoRrepresentaelesqueletocarbonadocaractersticodelaminocido
encuestinyqueeselqueledistinguedelosdems.
Los aminocidos pueden ser clasificados de acuerdo a su carcter cido o
bsico.Aspodranser:
a)Neutros:alifticos,aromticos,azufrados,secundarios.
b)cidos.
c)Bsicos.
No obstante; tiene ms inters y significacin para su anlisis
conformacional, el mtodo de clasificacin basado en la polaridad de sus
grupos R, cuando se hallan en disolucin acuosa en un pH prximo a 7.0
(Tabla1).

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 Cromatografadeaminocidos

Tabla1.Clasificacindeaminocidosdeacuerdoasupolaridad
Tipo Ejemplo Esructura

Alanina(ALA)


Valina(VAL)

Leucina(LEU)
CongrupoRno
polares
Isoleucina(ILE)

Metionina(MET)


Glicina(GLY)

Aminocido
Serina(SER)


Treonina(THR)
CongrupoR
polaressin
carga
Tirosina(TYR)

Glutamina(GLN)

cidoasprtico
CongrupoR
(ASP)
cargados
negativamente cidoglutmico
(GLU)


CongrupoR Lisina(LYS)
cargados
positivamente
Arginina(ARG)

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BioqumicaCelularydelosTejidosI

Precisamenteporsuscaractersticasdepolaridad,losaminocidosomezclas
de ellos son susceptibles a anlisis cromatogrfico. Entre los mtodos de
cromatografa en un plano estn la cromatografa en capa fina (CCF) y la
cromatografa en papel (CP). En ambos casos se emplea una capa plana y
relativamente delgada de un material que a la vez es la fase de soporte, o
bien, cubre una superficie de vidrio, plstico o metal. La fase mvil se
desplaza por la fase estacionaria por accin capilar, a veces ayudada por la
gravedadoporlaaplicacindeunpotencialelctrico.
Pormediodelacromatografapuedensepararseunamezcladeaminocidos
sobreunmediodesostn,losdistintosaminocidospresentesenlamezcla
son arrastrados a distintas velocidades sobre un soporte que puede ser
papel, slica gel o una columna con resina adsorbente o de intercambio
inico.
Cuandoseutilizalacromatografaenplacafina,larelacinentreladistancia
que recorre la muestra desde el punto de aplicacin sobre la distancia que
recorre el eluyente da un valor denominado Rf (razn de frentes), que es
caracterstico para cada sustancia y en nuestro caso para cada aminocido
(Fig.2.)

Fig.2.RepresentacindelclculodeRf

Debido a que en general, los aminocidos son solubles en agua y mucho

menos solubles en disolventes orgnicos, los valores de Rf (Tabla 2) se

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 Cromatografadeaminocidos

incrementan con el contenido de agua en el eluyente y disminuyen con el

aumentodepesomolecularyelpuntodeebullicindeleluyente.
ValoresRfdealgunos
aminocidos
Alanina 0.38
Arginina 0.28
cidoasprtico 0.24
cidoglutmico 0.3
Glicina 0.26
Histidina 0.48
Isoleucina 0.85
Leucina 0.73
Lisina 0.14
Metionina 0.4
Fenilalanina 0.71
Serina 0.27
Treonina 0.35
Tirosina 0.47
Valina 0.6

Tabla2.ValoresdeRfdeaminocidos,usandocomoeluyentebutanolcido
acticoaguaenproporcin12:3:5.

MaterialyEquipo
Placadevidriode20x20cm.
Estufa.
Papelfiltrodeporoabierto.
Cmaradeelucin.
Capilaressinheparina.
Aspersores.
Guantesdesechables

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BioqumicaCelularydelosTejidosI

Vasodeprecipitadodeunlitro
Agitadordevidrio


Reactivos
Mezclaeluyente.Butanol:AcidoActico:Agua(4:1:1)
Solucionesdeaminocidosaunaconcentracinde1mg/10mL
Mezcla problema de algunos aminocidos de las soluciones
anteriores.
Solucindeninhidrinaal0.2%(0.2g/100mL)enacetonaobutanol)
Slicagel
Hidrxidodesdio10mM

Mtodo
1. Previamente preparar la placa cromatogrfica sobre un vidrio de 20 x 20
cm,colocandounasolucinespesadeslicagelenhidrxidodesodio10mM
ydejarsecar(Fig.3).
2.Activarconanticipacinlasplacascromatogrficasdentrodeunaestufaa
90Cpor1hora(Fig.4).

Fig.3.Placacromatogrfica.Fig.4.Estufaparalaactivacindeplacas.

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 Cromatografadeaminocidos

2. Con un da de anticipacin llenar la cmara de elucin con

aproximadamente 200 mL de la mezcla eluyente e introducir un cuadro de
papel filtro de 20 x 20 cm, con el objetivo de que al usarla se encuentre
saturada(Figs.5y6).

Fig.5.LlenadodecmaradeelucinFig.6.Saturacindelacmara

3.Colocarlaplacaactivadasobreunahojacuadriculadademaneraquesirva
dereferenciaparaaplicarlasmuestras2cmporencimadelbordeinferior
de la placa (Fig. 7) con la ayuda de un capilar estirado con calor. Las
muestras deben tener 2 cm de separacin entre s; despus de cada
aplicacin se deber esperar a que el estndar o mezcla de aminocidos
seque perfectamente para volver a aplicar. Con la finalidad de ahorrar
tiempo para permitir la elucin al menos 4 horas, la aplicacin de
aminocidostambinpuedehacerseconanticipacin.

Fig.7.Aplicacindeestndaresymezclasdeaminocidos.

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BioqumicaCelularydelosTejidosI

4. Una vez aplicados los estndares y la mezcla de aminocidos, colocar la

placadentrodelacmaracromatogrficaqueapartirdeestemomentose
encontrarfijaynivelada(Fig.8).

Fig.8.Introduccindelaplacadentrodelacmaradeelucin.

5.Dejarcorrerlaelucinysacarlasplacasdelacmaracuandoeleluyente
est aproximadamente 2 cm antes del borde (Fig. 9). Inmediatamente
despus desacarlasplacas,marcarconunlpizelfrente deleluyente(Fig.
10).

Fig.9.Elucin.Fig.10.Frentedeleluyente.

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 Cromatografadeaminocidos

6. Dejar secar las placas en la campana de

extraccinydespusconayudadeunaspersor
aplicar la solucin de ninhidrina. Colocar en
estufa a 110C por 10 minutos para revelar la
presenciadeaminocidos(Fig.11).

Precaucin: La ninhidrina debe manipularse

conguantesdebidoasutoxicidad.
Fig.11.ManejodeNinhidrina.

Resultados
- Tomarunafotografadelaplacarevelada.
- Calcular los Rf de cada uno de los estndares de aminocidos y
determinarqueaminocidoscontenalamezclaproblema.

Cuestionario
1.Culessonlasaplicacionesdelacromatografa?

2. Indiquecomorealizaraunacromatografabidimensional.

3. Culeslareaccindelosaminocidosconlaninhidrina?

4. Qu otros reactivos pueden utilizarse para desarrollar color en una

cromatografadeaminocidos?

5. Qu ventajas presenta la ninhidrina en comparacin de los otros

reactivosquedesarrollanelcolor?

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BioqumicaCelularydelosTejidosI

Referencias
1. AguilarSantelises L, Garcadel Valle A, CoronaOrtega MT, Rangel
Corona R, CruzMilln M. Antologa del laboratorio de Bioqumica
CelularydelosTejidosI(complemento).Mxico:FESZaragoza,UNAM;
2008.
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estructural.Mxico:Alfaomega;2005.
3. Crouch D, Holler F, Skoog D. Principios de anlisis instrumental.
Mxico:CengageLearning.6ed.;2008.
4. AguilarL.,EscalanteR.ManualdeprcticasdeBioqumicaCelularyde
losTejidosMxico:FacultaddeEstudiosSuperioresZaragoza;2008.
5. Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. Harper: Bioqumica
ilustrada.28aed.MxicoDF:McGrawHillInteramericana;2010.

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