Anda di halaman 1dari 11

LAPORAN PRAKTIKUM DASAR-DASAR GENETIKA

ACARA VI
EKSTRAKSI DNA

Nama : Rika Laila Alifah


No. Induk Mahasiswa : 16/395768/PN/14619
Golongan : A1
Asisten : 1. Ahmad Khorudin Setyo Nugroho
2. Audya Hayu Kusumastuti

Laboratorium Pemuliaan Tanaman dan Genetika


Depertemen Budidaya Pertanian
Fakultas Pertanian
Universitas Gadjah Mada
2017
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang

Dalam mempelajari genetika unsur yang paling dominan dipelajari di dalamnya yaitu
menyangkut DNA. DNA (Deoxyribonucleic acid) adalah suatu materi yang terdapat pada tubuh
manusia dan semua makhluk hidup yang diwarisi secara turun menurun. Semua sel pada tubuh
memiliki DNA yang sama dan sebagian besar terdapat pada nukleus. DNA juga dapat ditemukan
pada mitokondria (Campbell et al., 2004). DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula
deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. Struktur DNA
pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan Francis Crick.Watson dan Crick menyimpulkan
bahwa struktur DNA merupakan rantai ganda (double helix).
Untuk mendapatkan DNA murni dapat dilakukan dengan metode isolasi DNA atau ekstraksi
DNA. Isolasi DNA merupakan salah satu tahap penting dalam kegiatan berbasis molekuler.
Dibutuhkan DNA dengan kualitas yang baik untuk berbagai kegiatan seperti pemanfaatan marka
molekuler, pembuatan pustaka genom, hingga sekuensing. Permasalahan utama yang sering
muncul dalam proses isolasi DNA tanaman adalah kehadiran senyawa kontaminan pada sampel
yang diisolasi seperti senyawa polisakarida, polifenol, protein, RNA, dan senyawa metabolit
sekunder yang terdapat pada tumbuhan obat ( Varma et al,2007 cit Nugroho et al, 2015).

DNA dapat diperoleh dari suatu makhluk hidup dengan suatu proses ekstraksi, sehingga
memudahkan untuk mengidentifikasi DNA yang disebut proses isolasi DNA. Ada tiga langkah
utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat
seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Melalui proses tersebut DNA dipisahkan dari
komponen seluler lain seperti protein, RNA (Riboksi nukleat acid), dan lemak ( Langga, 2012).
Salah satu kesulitan isolasi DNA tanaman selain dapat terkontaminasi oleh polisakarida dan
metabolit sekunder lainnya yaitu proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini
disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada jenis tanaman
kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat sehingga kehaditan kontaminasi
tersebut dapat mengganggu kerja enzim.

B. Tujuan
1. Melakukan ekstraksi DNA dengan metode konvensional dan CTAB
2. Mengetahui kemurnian dan konsentrasi DNA melalui metode konvensional dan CTAB
II. ISI
(HASIL DAN PEMBAHASAN)
A. Hasil Percobaan
Table A.1 Hasil ekstraksi DNA dengan metode konvensional
Sampel Kemurnian Konsentrasi (ng/l)
Buah mangga 1,444 2.597

Buah strawberry 1,500 300

Buah pepaya 1,000 -200

Table A.2 Hasil ekstraksi DNA dengan metode CTAB


Sampel Kemurnian Konsentrasi (ng/l)
Buah mangga 1,000 100

Buah strawberry 1,167 699

Buah papaya 1,000 200

Daun jagung 2,000 1998

Daun cabai 1,545 3397

Daun tomat 2,000 200

B. Pembahasan
Isolasi DNA merupakan suatu kegiatan yang dilakukan untuk mendapatkan DNA murni atau
memurnikan DNA (Suryo, 2012). Dalam melakukan isolasi DNA atau ekstraksi DNA ada dua
prinsip yang digunakan yaitu sentrifungsi dan presipitasi. Sentrifungsi merupakan teknik untuk
memisahkan campuran berdasarkan berat molekulnya. Molekul yang mempunyai berat molekul
besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas.
Menurut Campbell, 2002 hasil sentrifungsi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah
yaitu bagian atas yang disebut supranatan dan bagian bawah yang disebut pelet. Sedangkan
presipitasi merupakan prinsip yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari
campuran.
Melalui proses isolasi DNA, DNA dipisahkan dari komponen seluler lain seperti protein,
RNA (Riboksi nukleat acid), dan lemak. Banyak metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA,
tergantung spesimen yang akan dideteksi. Metode tersebut pada dasarnya memiliki prinsip yang
sama, namun ada beberapa hal tertentu yang biasanya digunakan modifikasi untuk dapat
menghancurkan inhibitor yang ada di dalam masing-masing sumber specimen. Secara umum
isolasi DNA memiliki 3 langkah utama dalam prosesnya yaitu antara lain perusakan dinding sel
(lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA
(Langga, 2012).
Isolasi DNA dapat dilakukan dengan dua metode yaitu metode konvensional dan metode
CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide). Pada metode konvensional dilakukan dengan cara
manual yaitu dengan penggerusan menggunakan mortar dan pestel dan pemberian larutan lisis
buffer yang terbuat dari garam dan sabun dengan perbandingan 1:2. Sedangkan metode CTAB
dilakukan dengan pemberian senyawa kimia buffer Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
(CTAB) untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan DNA. CTAB merupakan detejen
kationik yang bersifat melarutkan membran plasma dan membentuk kompleks ikatan dengan
fruktan serta senyawa polisakarida lainnya yang nantinya dapat dihilangkan selama penambahan
senyawa kloroform (Nugroho et al,2015). Metode CTAB ini merupakan perkembangan dari
metode konvensional. Beberapa metode ekstraksi DNA dikembangkan unutk mendapatkan hasil
terbaik. Namun pengembangan metode ekstraksi DNA biasanya diikuti dengan konsekuensi
peningkatan biaya yang dibutuhkan. Hal lain yang menjadi masalah dalam ekstraksi DNA adalah
lamanya waktu unutk proses ekstraksi sehingga harus menunggu berjam- jam untuk mendapatkan
DNA yang baik (Sunarno et al, 2014).
Pada praktikum Dasar- Dasar Genetika acara VI berjudul Ekstraksi DNA yang dilakukan pada
hari Senin 25 September 2017 di Laboratorium Pemuliaan Tanaman dan Genetika, Depertemen
Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada ini isolasi DNA yang dilakukan
dengan metode konvensional dan metode CTAB kemudian membandingkan kemurnian dan
konsentrasi yang dihasilkan antara kedua metode tersebut. Secara umum kemurnian dan
konsentrasi yang dihasilkan cenderung lebih akurat dengan metode CTAB, hal ini disebabkan
karena pada metode konvensional umumnya cenderung tingkat kontaminasinya lebih besar.
Adapun alat dan bahan yang diperlukan pada metode konvensional yaitu antara lain plastik dengan
klem, kertas saring, gelas beker, pengaduk, sabun, garam, dan sampel buah (mangga, stroberi,
papaya), dan alcohol 70%. Sedangkan alat dan bahan yang digunakan untuk metode CTAB antara
lain spektrofotometer, microtip, microtube, micropipet, centrifuge, freezer, mortar, pestel, vorteks,
sampel buah (mangga, pepaya, stroberi) 0,1 gr, sampel daun (cabe, bunga kertas, jagung) 0,1 gr,
buffer CTAB, aquadest, alkohol (etanol atau isopropanol), CIAA (isoamil alkohol), dan kloroform.
Pada metode konvensional hal pertama yang dilakukan yaitu sampel buah (manga, stroberi,
papaya) yang sudah dikupas/ dibersihkan, dimasukkan ke dalam plastic dengan klem lalu
digerus/ditumbuk sampai halus. Penggerusan ini dilakukan dengan tujuan untuk memecahkan
dinding sel sehingga sel-sel pada buah dapat keluar. Disamping dilakukan penggerusan, dibuat
larutan lisis yang terdiri dari campuran sabun dan garam dengan perbandingan 2 :1, dalam proses
pencampuran diusahakan tidak terbentuk busa karena hal tersebut dapat mengganggu proses
selanjutnya. Setelah larutan lisis selesai dibuat kemudian larutan lisis dimasukkan ke dalam
masing- masing sampel buah yang telah digerus lalu antara sampel buah dan larutan lisis dicampur
sampai homogen. Setelah homogen larutan di saring menggunakan kertas saring. Selanjutnya hasil
saringan ditambahkan alcohol dingin yang berfungsi untuk mengendapkan DNA maka akan
terbentuk lapisan- lapisan yang terdiri dari lapisan pengotor (keruh) dan lapisan yang mengandung
DNA (bening). Setelah itu, DNA diambil melalui mikropipet dan dipindahkan ke mikrotube
kemudian disentrifuse. Setelah kering, sampel DNA ditambahkan buffer TE/ Double Distilated
H20( DDH20).
Metode yang berikutnya yaitu metode CTAB yang menggunakan DNA sampel buah
(mangga, stroberi, papaya) hasil dari metode konvensional dan DNA sampel daun (cabai, jagung,
tomat) yang telah dicuci dan dikeringkan dengan tissue. Kemudian buffer ekstraksi dipanaskan
pada suhu 650C selama 30 menit. Setelah itu sampel daun digerus dengan mortar hingga lembut
dan ditambahkan buffer sebanyak 1500 dimasukan setengah-setengah agar larutan dapat
tercampur hingga merata lalu dimasukkan ke dalam microtube. Apabila sampel yang digunakan
merupakan sampel kering maka sampel didiamkan selama 1,5-1 jam dalam larutan buffer di suhu
lalu baru dapat digerus. Berikutnya campuran gerusan dan larutan buffer diinkubasi pada suhu
650C selama 60 menit dengan catatan setiap 10 menit dibolak-balik. Tujuan dilakukan inkubasi ini
adalah untuk mengefektifkan lisis sel dan menonaktifkan DNAse yang dapat merusak DNA serta
menghancurkan protein. Selanjutnya setelah diinkubasi, campuran diambil dari waterbath
didiamkan selama 2 menit dan ditambahkan pada setiap sampel 500 campuran 24 chloroform :
1 isoamil alkohol (CIAA). Berikutnya dicampur dan divorteks selama 5 menit. Pada tahap ini
bertujuan untuk mengekstrak dan mengendapkan protein, komponen phenolic, polisakarida dll
didalam campuran unutk dipisahkan dari DNA.
Langkah selanjutnya yaitu campuran disentrifuse selama 15 menit pada 12.000 rpm.
Kemudian supernatan yang telah terbentuk diambil secara hati-hati dan dipindahkan ke microtube
yang baru dan dicatat volumenya. Selanjutnya ditambahkan sodium asetat 3 M sebanyak 1/10 dari
volume supernatan yang diperoleh dan dicampur dengan baik. Berikutnya ditambahkan
isopropanol dingin sebanyak 2/3 volume total dan dicampur dengan baik dan tabung dibolak-
balikkan. Pada tahap ini berfungsi untuk mengendapkan DNA dengan keberadaan garam,
isopropanol dan suhu dingin. Berikutnya campuran didiamkan dalam freezer selama 24 jam.
Selanjutnya disentrifuse dengan 12.000 rpm selama 10 menit. Berikutnya cairan dibuang dan
endapan DNA dicuci dan ditambahkan 500 etanol 70% selanjutnya microtube dibolak-balik.
Kemudian sentrifuse 5 menit pada 12.000 rpm. Cairan dibuang dan endapan DNA dikering-
keringkan. Berikutnya setelah kering endapan DNA dilarutkan kembali dengan 50-100 TE
buffer + 1% RNAse dan diinkubasi pada waterbath dengan suhu 37 C selama 60 menit. Kemudian
larutan DNA disimpan pada suhu 4 C. Pada tahap ini RNAse berfungsi untuk mendegradasi RNA
yang terbawa oleh DNA.
Untuk menentukan konsentrasi dan kemurnian DNA digunakan alat spektrofotometer.
Spektrofotometer sinar UV berfungsi untuk mengukur tingkat kemurnian dan konsentrasi DNA
hasil isolasi. Dalam penentuan nilai kemurnian DNA, DNA murni yang bebas kontaminasi protein
akan mendekati 1,8, sedangkan jika kurang 1,8 menandakan bahwa DNA terdapat kontaminasi
fenol atau protein, jika lebih dari 1,8 menandakan bahwa DNA terkontaminasi RNA.
Berdasarkan isolasi DNA yang telah dilakukan, didapatkan hasil yaitu untuk isolasi DNA
metode konvensional pada sampel DNA buah mangga diperoleh kemurnian 1,444 dan konsentrasi
2.597 ng/l. Hal ini menunjukkan bahwa DNA buah mangga belum cukup murni karena masih
terkontaminasi oleh fenol dan protein, namun untuk kualitasnya cukup baik dan dihasilkan denga
jumlah yang cukup banyak. Selanjutnya untuk sampel DNA buah stroberi diperoleh kemurnian
sebesar 1,500 dan konsentrasi 300 ng/l. Hal ini menunjukkan bahwa DNA buah stroberi belum
cukup murni karena masih terkontaminasi oleh protein dan fenol, kualitasnya juga kurang baik
dan jumlah yang dihasilkan juga sedikit. Untuk sampel DNA buah papaya diperoleh kemurnian
sebesar 1,000 dan konsentrasi sebesar -200 ng/l. Hal ini menunjukkan bahwa DNA buah papaya
yang diperoleh sangat kurang murni karena masih terkontaminasi oleh protein dan fenol, serta
kualitas dan jumlah yang dihasilkan sangat rendah.
Sedangkan pada isolasi DNA melalui metode CTAB diperoleh hasil untuk sampel buah
mangga kemurniannya yaitu sebesar 1,000 yang menandakan bahwa DNA masih belum murni dan
masih terkontaminasi oleh protein dan fenol, untuk konsentrasinya sebesar 100 ng/l yang berarti
jumlah DNA yang diuji jumlahnya masih sedikit. Sedangkan untuk sampel DNA buah stroberi
diperoleh nilai kemurniannya yaitu sebesar 1,167 yang menandakan bahwa DNA masih
terkontaminasi oelh protein dan fenol, untuk konsentrasinya diperleh sebesar 699 ng/l yang
berarti jumlah DNA yang diuji tidak begitu banyak. Selanjutnya unutk sampel DNA buah papaya
diperoleh nilai kemurnian sebesar 1,000 yang berarti sampel DNA belum cukup murni dan masih
terkontaminasi oleh protein dan fenol, untuk konsentrasinya sebesar 200 ng/l yang menandakan
jumlah DNA yang dihasilkan masih sedikit.
Pada isolasi DNA daun cabai diperoleh nilai kemurnian sebesar 1,545 yang menandakan
berarti DNA masih terkontaminasi oleh protein, namun dari semua sampel DNA, sampel DNA
daun cabai merupakan yang paling mendekati murni. Sedangkan untuk konsentrasinya juga cukup
tinggi yaitu 3397 ng/l yang berarti jumlah dan kualitas DNA yang diuji cukup banyak dan tinggi.
Untuk kemurnian daun jagung diperoleh sebesar 2,000 dan melebihi 1,800 sehingga menandakan
bahwa daub jagung hamper mendekati murni akan tetapi masih terkontaminasi oleh RNA dan
konsentrasi nya sebesar 1998 ng/l yang berarti DNA yang diuji kualitasnya cukup baik dan
jumlahnya cukup banyak. Dan yang terakhir sampel DNA daun tomat kemurniannya yaitu 2,000
yang sama dengan daun jagung masih terkontaminasi oleh RNA, sedangkan konsentrasinya
sebesar 200 yang berarti kualitas dan jumlah DNA yang diuji masih rendah.
III. PENUTUPAN
A. Kesimpulan
1. Isolasi DNA dapat dilakukan dengan metode konvensional yaitu dengan penggerusan
menggunakan mortar dan pestel dan pemberian larutan lisis buffer yang terbuat dari garam
dan sabun dengan perbandingan 1:2. Sedangkan metode CTAB dilakukan dengan pemberian
senyawa kimia buffer Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) untuk melisiskan
membran inti untuk mengeluarkan DNA.
2. Berdasarkan isolasi DNA yang telah dilakukan diperoleh kemurnian dan konsentrasi DNA
yaitu untuk metode konvensional semua sampel DNA buah (mangga, stroberi, papaya)
kemurniannya masih dibawah 1,800 yang menandakan bahwa DNA yang diuji masih
terkontaminasi protein, sedangkan untuk konsentrasinya semua DNA kualitasnya masih
rendah dan jumlah yang dihasilkan sedikit kecuali pada sampel DNA buah mangga.
Sedangkan untuk metode CTAB semua sampel DNA kemurniannya masih dibawah 1,800
dan masih terkontaminasi protein dan fenol, kecuali pada sampel DNA daun jagung dan
daun tomat kemurniannya diatas 1,800 yang berarti masih terkontaminasi RNA, sedangkan
untuk konsentrasinya semua masih dalan kualitas dan jumlah yang rendah kecuali pada
sampel DNA yang diuji pada daun jagung dan daun cabai kualitas dan jumlahnya sudah
cukup tinggi.
DAFTAR PUSTAKA

Campbell, N.A., J.B. Reece, dan L.G. Mitchell. 2002. Biologi Jilid 1 Edisi 3. Erlangga, Jakarta.
Campbell, N.A., J.B. Reece, dan L.G. Mitchell. 2004. Biologi Jilid 1. Erlangga. Jakarta.
Langga, F. I., M. Restu, T. Kuswinanti. 2012. Optimalisasi suhu dan lama inkubasi dalam ekstraksi
DNA tanaman Bitti (Vitex cofassus reinw) serta analisis keragaman genetik dengan teknik
RAPD-PCR. Jurnal Sains dan Teknologi (12)3 : 265-276
Nugroho, K., R. T. Terryana, P. Lestari. 2015. Optimasi metode isolasi DNA pada Jatropha spp.
Jurnal Agroteknologi 5(2) : 15-22
Sunarno, F. Muna, N. Fitri, A. Malik, A. Karuniawati, A. Soebandrio. 2014. Metode cepat
ekstraksi DNA Corynebacterium diphtheriae untuk pemeriksaan PCR. Buletin Penelitian
Kesehatan 42(2) : 85-92
Suryo. 2012. Genetika Strata 1. UGM Press, Yogyakarta
LAMPIRAN