Anda di halaman 1dari 40

Isolasi Katalase Besar dari Agen

Pendegradasi Hidrokarbon Aspergillus


terreus MTCC 6324
Preety Vatsyayan1 dan Pranab Goswami2
1Institute
of Analytical Chemistry, Chemo- and Biosensors, University of Regensburg, Germany
2Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Guwahati,

Guwahati, Assam 781039, India


Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Katalase (EC 1.11.1.6) merupakan suatu enzim yang bersifat antioksidan


dan memiliki haem pada strukturnya. Enzim ini diketahui memiliki
kemampuan untuk mendegradasi hidrogen peroksida menjadi air dan
gas oksigen.

Beberapa aplikasi penting dari katalase untuk industri yaitu: biosensor,


terapeutik, makanan dan tekstil.
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Green Algae
55-69 kDa subunit
Plantae

Archaea
Katalase Bacteria 75-86 kDa subunit
Fungi

Archaea
Bacteria
55-69 kDa subunit
Fungi
Animalia
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Bacteria

HPII
KatE KatE KatE CatC KatX
KatE

E.coli Bacillus subtilis Bacillus firmus Pseudomonas putida


Mycobacterium avium Xanthomonas oryzae
Fungi

Cat-1 CatA CatA


CPCAT1 CatR
Cat-3 CatB CatB

Neurospora crassa Claviceps Aspergillus nidulans Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus


Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Nama : 4QOL
Klasifikasi : Oksidoreduktase
Jenis : katalase-peroksidase bifungsional (KatG)
Pemilik : Loewen, P.C.
Organisme : Bacillus pumilus
Sistem Ekspresi : Escherichia coli
Metode Eksperimen: Difraksi sinar-X
Simetri Protein : Dihedral D-2
Stoikiometri : Homo 4-mer A4
Massa struktur total: 232562,75
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Nama : 3EJ6
Klasifikasi : Oksidoreduktase
Jenis : Katalase besar (CAT-3)
Pemilik : Diaz, A. et. al.
Organisme : Neurospora crassa
Sistem Ekspresi :-
Metode Eksperimen: Difraksi sinar-X
Simetri Protein : Dihedral D-2
Stoikiometri : Homo 4-mer A4
Massa struktur total: 308974,66
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Pemakan substrat karbon


Melimpah di alam
untuk bertahan hidup

A. terreus

Berpotensi menghasilkan A. terreus MTCC 6324


biokatalis (enzim) (ladang minyak Assam, India)
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

- : Cellular organism
Superkingdom : Eukaryota
- : Opisthokonta
Kingdom : Fungi
Subkingdom : Dikarya
Phylum : Ascomycota
- : Saccharomyceta
Subphylum : Pezizomycotina
- : Ieotiomyceta
Class : Eurotiomycetes
Subclass : Eurotiomycetidae
Order : Eurotiales
Family : Aspergillaceae
Genus : Aspergillus
Species : Aspergillus terreus
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Penentuan berat
Pengkulturan A.
Pemurnian CAT molekul dan
terreus
elektroforesis

(pH, T) optimum Enzyme Assay Peptide Mass


Stabilitas and Kinetics Fingerprinting
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Organisme dan Kondisi Kultur

Benih jamur A. terreus dari Microbial Type Culture Collection (MTCC),


Chandigarh, dengan nomor akses 6324.
Kultivasi dilakukan dalam labu Erlenmeyer 500 mL, berisi 2% n-
heksadekana/glukosa dalam 50 mL medium agar.
Nilai pH diatur menjadi 5,8; labu diinkubasi pada suhu 28oC.
Jamur hasil kultur dipindahkan ke wadah berbentuk tabung miring
setiap 15 hari.
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Pemurnian CAT

Penghancuran sel miselia secara mekanik


Sentrifugasi dan penambahan (NH4)2SO4
Phenyl Sepharose 6 Fast Flow Hydrophobic Interaction
Chromatography (HIC) - Fast Pressure Liquid Chromatography (FPLC)
Size Exclusion Chromatography (SEC)
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Penentuan Berat Molekul dan Elektroforesis

Penentuan berat molekul native CAT yang telah dimurnikan


menggunakan SEC-FPLC dengan standar: thyroglobulin (669 kDa),
apoferritin (443 kDa), -amylase (200 kDa), alcohol
dehydrogenase (150 kDa), dan carbonic anhydrase (29 kDa).
Native-PAGE dan SDS-PAGE menggunakan 7% dan 10% gel
(separating gels) dengan 5% gel pengumpul (stacking gels),
tebal 0,75 mm, dengan pewarna Coomassie brilliant blue (CBB)
R 250.
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Penentuan Berat Molekul dan Elektroforesis

Untuk SDS-PAGE, digunakan penanda:


carbonic anhydrase (bovine erythrocyte, 29 kDa)
fumarase (porcine heart, 48,5 kDa)
serum albumin (bovine, 66 kDa)
phosphorylase b (rabbit muscle, 97,4 kDa)
-galactosidase (E. coli, 116 kDa)
Glycostaining dari pita protein pada SDS-PAGE dilakukan dengan
menggunakan asam periodat Schniff (PAS)
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Penentuan Berat Molekul dan Elektroforesis

Penentuan pI
Isolasi haem dari CAT yang telah dimurnikan dan
karakterisasinya menggunakan Electrospray Ionization tandem
Mass Spectroscopy (ESI-MS/MS) dan Fourier Transform IR
spectroscopy (FTIR)
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Peptide Mass Fingerprinting

Nanoliquid chromatography-tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS)


Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Enzyme Assay and Kinetics

Dilakukan dengan metode spektrofotometri UV ( = 240 nm)


Kondisi standar: 50 mM SPB (pH 7,5) dan 4,9 mM H2O2 (240 = 43,6 M-1
cm-1)
Satu unit (U) aktivitas enzim = jumlah enzim yang mengonsumsi 2
mol H2O2 dalam satu menit pada suhu ruangan
Konsentrasi H2O2 = 0,05-75 mM
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

pH dan Suhu Optimum serta Kestabilan Enzim

pH optimum ditentukan dengan menggunakan larutan


penyangga: natrium sitrat (pH 2,5-4), natrium asetat (pH 5),
natrium fosfat (pH 6-7,5) tris(hidroksimetil)aminometana (tris,
pH 8), etanolamina (pH 9), natrium fosfat (pH 10-12,5) @50 mM
Kestabilan pH diukur pada suhu 4oC dengan masing-masing
larutan penyangga yang telah digunakan pada rentang waktu
tertentu
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

pH dan Suhu Optimum serta Kestabilan Enzim

Suhu optimum diukur dengan melakukan reaksi enzimatik pada


rentang suhu yang bervariasi (4oC-80oC) dan kestabilannya
ditentukan pada rentang waktu tertentu
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Keterangan Substrat 2%(v/v) n- Substrat 2%(v/v) glukosa


heksadekana
Aktivitas total (fasa 17 x 106 U gm-1 4,25 x 106 U gm-1
eksponensial akhir, 90h)
Aktivitas rata-rata (fasa log 9,5 x 106 U gm-1 Tidak diketahui
akhir ke fasa eksponensial
akhir)
Aktivitas total (fasa Menurun Menurun
stasioner)
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Kategori Keterangan
pI 4,2 0,1
Jenis Protein Glikoprotein
Rasio Protein-Karbohidrat 3,33
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Enzyme Kinetics

Kategori Keterangan
Jangkauan konsentrasi H2O2 (mM) 0,05-75
Jenis reaksi Michaelis-Menten
Km (mM) 14,15
Persamaan garis dari Lineweaver-Burk plot y = 4,265x + 0,301, R2 = 0,9949
Kcat (s-1) 6,65 x 106
Kcat /Km (M-1 s-1) 4,7 x 108
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Ditemukan aktivitas enzim katalase yang tinggi pada sel A.


terreus ketika ditumbuhkan pada substrat hidrokarbon
Aktivitas ini muncul sebagai perlawanan terhadap produksi
H2O2 yang terbentuk sebagai hasil samping dari metabolisme
Enzim yang diisolasi stabil pada pH basa dengan efisiensi
katalisis yang mengagumkan
Berpotensi sebagai biosensor dan aplikasi industri lainnya
Material dan
Pendahuluan Hasil dan Diskusi Kesimpulan
Metode

Terima kasih