LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Cultivo secundario y tincin de bacterias y hongos.

Introduccin

Algunas caractersticas hacen parte del punto de partida para la identificacin de microorganismos. Las tinciones
permiten analizar por microscopa ptica las caractersticas morfolgicas de los microorganismos y para el caso de las
bacterias puede permitir el reconocimiento de propiedades de la pared celular agrupndolas como Gram positivas o
Gram negativas con lo cual se puede dar inicio al proceso de identificacin. Tambin se pueden mediante tinciones
especificas, reconocer la presencia de estructuras especializadas en bacterias como flagelos, esporas cpsulas entre
otros que aportarn al anlisis morfolgico.

Procedimiento

Descripcin macroscpica de colonias

De los cultivos primarios, identifique las colonias con algn nmero y descrbalas en una tabla, especificando: color,
tamao, forma, elevacin, borde y textura

Textura: seca, viscosa, cremosa, algodonosa, pulverulenta

Aspecto, brillante, opaca

Tincin simple con azul de metileno

Permite teir el interior celular. Tie microorganismos procariticos (vivos o muertos). Los eucariticos slo se tien si
estn muertos. Algunas estructuras, como los corpsculos metacromticos (reservas de fosfatos), se tien ms
intensamente con este colorante que el resto de la clula.

1. Tome una muestra de los cultivos lquido.

2. Fije al calor la muestra.
3. Cubrir con azul de metileno la preparacin y esperar 2 minutos.
4. Lavar con agua.
5. Secar al aire y pasar por el mechero tres veces.
6. Observar al microscopio hasta llegar al objetivo de 100x utilizando aceite de inmersin

Tincin de Gram (Tincin diferencial de bacterias)

Emplear cultivos jvenes idealmente (24 horas).

Etiquetar tres portaobjetos por uno de sus extremos con los nmeros asignados de las colonias
2. Preparar los frotes bacterianos a partir de cultivos lquidos o slidos.
3. Fijar con calor (mechero).
4. Agregar cristal violeta en cantidad suficiente para cubrir el frote (2 a 3 gotas) y dejar actuar 30 seg a 1
minuto.
5. Lavar con el mnimo de agua para eliminar el exceso de colorante.
6. Agregar lugol en cantidad suficiente para cubrir el frote (2 a 3 gotas) y dejar actuar 1 minuto.
7. Lavar con el mnimo de agua para eliminar el exceso de mordente.
8. Decolorar con alcohol acetona hasta que el efluente salga incoloro (10-15 seg).
9. Lavar con agua para eliminar el exceso de disolvente.
10. Agregar fushina en cantidad suficiente hasta cubrir el frotis (2 3 gotas) y dejar actuar 1 minuto.
11. Lavar con agua para eliminar el exceso del colorante de contraste.
12. Dejar secar la preparacin a temperatura ambiente.
13. Observar al microscopio con los objetivos de 10x, 40x y 100x. El ltimo aumento 100x con aceite de inmersin
14. Esquematizar las observaciones realizadas con el objetivo de mayor aumento y describir las caractersticas de los
microorganismos observados e indicar si son Gram positivos o Gram negativos

Describa:
Forma: bacilo, coco, cocobacilo, espirilo, otro;
Agrupacin: pares, cadena, racimo, ninguno, otro;
Gram: positivo, negativo, no determinado.

Coloracin de hongos filamentosos

Preparar lminas con una gota de azul de lactofenol

Con la aguja de diseccin, tomar una porcin pequea del micelio areo del hongo y transferirla a la lamina
homogenizandola y disgregndola en la gota de lactofenol.
Cubrir con cubreobtetos
Visualizar al microscopio usando objetivos de 4X, 10x, y 40x.
Tinciones especficas

Tincin de endosporas con tinta china

1.- Poner con el asa una gota pequea de tinta china en el centro de un portaobjetos limpio.
2.-Poner una gota de agua del mismo tamao junto a la gota de tinta china
3.- Tomar con el Asa bacteriolgica un pequeo fragmento del cultivo de bacterias
4.- Hacer una suspensin ( sin extenderla) en la gota de agua
5.- Mezclarla con la tinta china
6.- Colocar un cubreobjetos sobre la suspensin, evitando que queden burbujas
7.- Observar la preparacin al microscopio con el objetivo seco fuerte y de inmersin.

La cpsula se observa como una zona brillante alrededor de la bacteria en un campo oscuro.

Tincin de endosporas con rojo congo

1.- Poner una gota pequea de rojo congo en el centro de un portaobjetos limpio
2.-Tomar con el asa bacteriolgica un pequeo fragmento de crecimiento de colonia bacteriana
3.- Suspender la muestra en la gota de rojo congo y hacer un frotis. Extiende la suspensin de manera que quede una
pelcula delgada.

4.- Deja secar la preparacin a temperatura ambiente. (SIN FIJARLO A LA FLAMA DEL MECHERO) 5.-5. Lavar el frotis
con agua destilada y dejarlo secar al aire
6. Cubrir con Fucsina cida (mordente), dejar que acte durante un minuto
7. Lava suavemente con agua corriente de la llave y seca el frotis mediante un ligero contacto con una toalla de papel.
6.- Observar la preparacin al microscopio con el objetivo de inmersin

Nota: para la observacin de esporas, use alguna de las colonias de bacilos Gram positivos

Tincin Shaefer-Fulton (para esporas)

1. Tomar una muestra de colonia o del cultivo lquido y extenderla en la lmima.
2. Dejar Secar
3. Fijar con mechero
4. Agregar verde de malaquita para cubrir completamente la muestra
5. Calentar por 8 minutos la placa hasta observar formacin de vapor sin que hierva la muestra, evite que se
seque la muestra agregando ms colorante si es requerido. Esto para permitir la penetracin del colorante a
la endospora
6. Deje enfriar la lamina
7. Lave con abundante agua
8. Agregar fuchina o safranina y deje actuar por 2 minutos.
9. Lave la preparacin
10. Deje secar y observe al microscopio